抗生物質耐性プラットフォームを用いた抗生物質脱複製

要約

抗生物質の脱複製に対する同種抗生物質耐性エシェリヒア大腸菌のライブラリーを利用するプラットフォームについて述べる。細菌または真菌によって産生される抗生物質の同一性は、それぞれの耐性遺伝子を発現する大腸菌の増殖によって推定することができる。このプラットホームは経済的に有効で、時間効率が良い。

要約

天然物抽出物からの新しい抗生物質の探索における主な課題の1つは、一般的な化合物の再発見です。この課題に対処するために、既知の化合物を同定するプロセスである脱複製が目的のサンプルに対して行われます。分析分離、質量分析などの脱複製の方法は、時間とリソースを大量に消費します。脱複製プロセスを改善するために、抗生物質耐性プラットフォーム(ARP)を開発しました。ARPは、エシェリヒア大腸菌に個別にクローニングされた約100の抗生物質耐性遺伝子のライブラリーです。この株のコレクションは、抗生物質の脱複製のための費用対効果の高い、顔の良い方法を含む多くのアプリケーションを持っています。このプロセスは、固体媒体を含む長方形ペトリ皿の表面に抗生物質産生微生物を発酵させ、それによって培地を介した二次代謝産物の分泌および拡散を可能にする。6日間の発酵期間の後、微生物バイオマスを除去し、薄い寒天オーバーレイをペトリ皿に加えて滑らかな表面を作成し、大腸菌指標株の成長を可能にします。ARP株の私たちのコレクションは、抗生物質含有ペトリ皿の表面に固定されます。プレートは、オーバーレイの表面に大腸菌の成長を可能にするために、次に一晩インキュベートされます。特定の抗生物質(またはクラス)に対する耐性を含む株のみがこの表面上で成長し、生成された化合物の迅速な同定を可能にする。この方法は、既知の抗生物質の生産者の同定と、新しい化合物を産生するものを同定する手段として正常に使用されている。

概要

1928年にペニシリンが発見されて以来、環境微生物由来の天然物は、抗菌^化合物1の豊富な供給源であることが証明されている。天然物系抗生物質の約80%はストレプトマイセス属および他の多発性菌の細菌に由来し、残りの20%は真菌^種1によって産生される。β-ラクタム、テトラサイクリン、リファマイシン、アミノグリコシドなどの診療所で使用される最も一般的な抗生物質足場のいくつかは、もともと^微生物2から単離された。しかし、多剤耐性(MDR)細菌の増加により、現在の抗生物質のパネルは^治療3、4であまり効果がなくなってきています。これらには、「ESKAPE」病原体(すなわち、バンコマイシン耐性腸球菌およびβ-ラクタム耐性黄色ブドウ球菌、クレブシエラ肺炎、シュードモナス・エルギノーサ、アシネトバクター・バウマンニ、およびエンテロバクターsp.)は、世界保健機関(WHO)3、4、5などの多くの主要な公衆衛生当局によって最も高いリスクに関連していると考えられる細菌のサブセットである。これらのMDR病原体の出現とグローバルな広がりは、新しい^{抗生物質3、4、5}の絶え間ない必要性をもたらす。残念ながら、過去20年間で、微生物源からの新しい抗生物質の発見はますます困難であることを実証^{している6.}創薬に対する現在のアプローチには、天然物抽出ライブラリーを含む生理活性化合物のハイスループットスクリーニングが含まれており、所定の^時間2で何千もの抽出物を試験することができる。しかし、抗菌活性が検出されると、次のステップは、原油抽出物の内容物を分析して活性成分を同定し、既知または冗長^{化合物7、8}を含むものを排除する。このプロセスは、脱複製と呼ばれ、既知の^{抗生物質7、9}の再発見に費やされる時間を防止および/または大幅に短縮するために不可欠である。天然物創薬の必要なステップですが、脱複製は、非常に手間がかかり、リソース集約的^な10.

Beutlerらは、最初に「脱複製」という用語を造語して以来、既知の^{抗生物質11、12}の迅速な同定のための革新的な戦略を開発するための広範な努力がなされてきた。今日、脱複製に使用される最も一般的なツールには、高性能液体クロマトグラフィー、質量分析、および核磁気共鳴ベースの検出^{方法11、13}などの分析クロマトグラフィーシステムが含まれる。残念ながら、これらの方法のそれぞれは、高価な分析機器と高度なデータ解釈の使用を必要とします。

特殊な装置なしで迅速に行うことができる脱複製法を開発する試みとして、抗生物質耐性プラットフォーム(ARP)10を確立した。ARPは、抗生物質アジュバントの発見、既知の耐性機構に対する新しい抗生物質化合物のプロファイリング、およびアクチノバクテリアおよび他の微生物由来の抽出物における既知の抗生物質の脱複製に使用することができる。ここでは、抗生物質の脱複製におけるその応用に焦点を当てる。ARPは、最も一般的に再発見された^{抗生物質14,15}に対して有効である個々の抵抗遺伝子を発現する等方性エシェリヒア大腸菌株^のライブラリーを利用する。大腸菌ライブラリーが二次代謝産物産生生物の存在下で成長すると、化合物の同一性は、関連する耐性^遺伝子10を発現する大腸菌株の増殖によって推測されうる。ARPが最初に報告されたとき、ライブラリーは16の抗生物質クラスに対する耐性を与える>40遺伝子で構成されていました。元の脱複製テンプレートは、脱複製プロセス中に抗生物質サブクラスに関する情報を提供するために、抗生物質クラスごとの耐性遺伝子のサブセットを包含するように設計されました。今日、ARPは18の抗生物質クラスに対する抵抗性を与える>90遺伝子で構成されている。耐性遺伝子の広範なコレクションを使用して、二次脱複製テンプレートが開発され、最小抗生物質耐性プラットフォーム(MARP)として知られています。このテンプレートは、遺伝子の冗長性を排除し、単に脱複製された代謝産物が関連する一般的な抗生物質クラスに関する情報を提供するために作成されました。さらに、MARPテンプレートは、野生型と大腸菌BW25113(大腸菌BW25113ΔbamBΔtolC)の両方の肥一性/流出欠損株の両方を有し、ARPの元の化身と比較して、唯一の過透過性株を利用する。このユニークな側面は、脱複製中に追加の型を作成し、グラム陰性細菌の外膜を横断する化合物能力を示す。ここでは、ARP または MARP を使用して複製を解除する際に従うべき堅牢なプロトコルについて説明し、従うべき最も重要な手順を強調し、さまざまな可能な結果について説明します。

プロトコル

1.大腸菌ライブラリーグリセロールストックの調製(寒天スラントから)

1. ARP/MARP大腸菌株を、LB寒天と適切な選択マーカーを含むペトリ皿にリソジェニーブロス(LB)寒天のスラングからストリークします(表1)。
2. 1つのコロニーで適切な選択可能なマーカーを含むLBの3 mLを接種することにより、大腸菌株の各培養物を調記する。通気(250 rpm)で37°Cで一晩成長します。
3. 800 μL の培養と 200 μL の無菌 80% グリセロールを 1.8 mL の凍結で組み合わせます。チューブを3~4回反転して混ぜ、-80°Cに保存します。

2. ARP/MARP冷凍ストックライブラリプレート準備

1. セクション1で調製したグリセロールストックから、LB寒天と適切な選択可能なマーカーを含むペトリ皿の新しいセットにARP/MARP株をストリークします。37 °Cで一晩成長します。
2. 無菌技術を用いて、カチオンのピペット500μLは、無菌貯留槽から無菌96深井戸プレートの各井戸にミューラー・ヒントン・ブロス(MHB)を調整した。
3. ステップ2.1で用意したプレートでは、アプリケータスティックを使用して、ARP/MARPマップ(補足図1および補足図2)に従って96の深い井戸板を接種します。適切な選択可能なマーカーが各ウェルに追加されていることを確認します。深い井戸板の表面に通気性シール膜を置き、37°C(250 rpm)で一晩インキュベートします。
4. ARP/MARP マップを参照して、汚染された井戸がないことを確認します。汚染された場合は繰り返します。マルチチャンネルピペッタを使用して、深い井戸プレートの各ウェルから100μLを無菌96ウェル丸底板に移します。この手順を繰り返して、複数の凍結ストック ライブラリ プレートを作成します。
   注:凍結ストックライブラリプレートが汚染された場合にステップ2.1−2.4を繰り返さないように、一度に少なくとも5枚のライブラリプレートを準備することをお知りください。
5. 無菌50%グリセロールの100μLを各ウェルにピペッティングし、上下にゆっくりとピペッティングして混ぜ合わせ、ARP/MARP冷凍ストックライブラリプレートを作り終えます。
6. 滅菌アルミニウムシールでプレートを覆い、各井戸が個別に密封されていることを確認してください。
7. プレートに番号を付け、特定の時間に新しいテンプレートを接種するための冷凍ストックライブラリプレートを1つだけ専用します。凍結ストックライブラリプレートの汚染が発生した場合は、残りをバックアップとして保管してください。
8. プレート蓋をアルミシールの上に置き、-80°Cに保管します。

3. 種子培養・脱複製プレート調製

1. アプリケータースティックを使用して、1つの滅菌ガラスビーズを含む試験管内のストレプトマイセス系抗生物質培地(SAM)(または試験対象の他の適切な培地)の3mLを接種し、産生株を有する。デレプリケートされます。ストレプトマイセスの場合は、コロニーの表面から胞子をそっと掻き取ります。
2. 同じ木製のアプリケータースティックを使用して、ベネットの寒天を含むペトリ皿に無菌制御をストリーク。
3. 種子培養を30°Cで6日間(250rpm)通気でインキュベートし、無菌制御プレートを30°Cで6日間インキュベートします。
   注:SAM とベネットのメディアレシピについては、表 2を参照してください。上記の指示は、ほとんどのアクティノマイセトに適しています。他の細菌や真菌のために必要に応じて成長培温を変更します。
4. 23 mLの暖かいベネットの寒天を血清的なピペットに吸引して脱複製プレートを準備し、長方形のペトリ皿(材料のテーブル)の表面を均等に20 mL分配し、メディアの残りの部分をピペットに残して防ぎます。気泡形成。
   注:プレートを注ぐために使用される表面が水平であることを確認し、寒天があまりにも冷却する前に、この手順を実行します。平らなサーフェスは、次の段階でライブラリを固定するために不可欠です。
5. 媒体がプレートのすべての領域を覆うまでプレートをゆっくりと回転させ、寒天が完全に設定されるまで、プレートを邪魔しません。
6. シートが脱複製プレートの表面に収まるように、長方形のペトリ皿蓋をトレーステンプレートとして使用して、ニトロセルロース膜シート(材料の表)を準備します。シーツを切り、無菌パウチでオートクレーブします。
   注:この膜は、生物がその表面に胞子を可能にし、二次代謝物は、以下の媒体に排泄することができる。一度成長すると、膜が除去のためのきれいな表面を提供するために除去されます。膜紙がベネットの寒天の表面に近いほど、脱複製の結果はクリーンになります。
7. 無菌制御プレートをチェックして、インキュベーションの6日後に汚染物質が存在しないことを確認してください。汚染のない場合は、長方形のペトリ皿の蓋を取り外し、種子培養物のピペット200 μLをベネットの寒天の表面に取り外します。
8. 無菌綿棒を使用して、プレート全体の表面全体に均等に培養物を広げます。
9. ペトリ皿の表面に培養の上にステップ3.6で調製したニトロセルロース膜を置きます。ペトリ皿の下端に膜の下端を合わせることから始め、ゆっくりとプレートの上端に膜を適用します。
10. 無菌綿棒を使用して、膜寒天界面の間に形成された気泡を滑らかにし、膜が寒天にフラッシュされることを保証します。
11. 長方形のペトリ皿に蓋を戻し、密閉されたビニール袋に逆さまに置きます。30°Cで6日間インキュベートします。

4. 復位プレートMHBオーバーレイとARP/MARPライブラリプレート準備

1. 6日後、30°Cインキュベーターから脱複製プレートを取り出します。滅菌ピンセット(70%エタノールでオートクレーブまたはスプレー)を使用して、ベネットの寒天の表面からニトロセルロース膜を慎重に取り除きます。
   注:このステップは、脱複製のためのきれいな表面を提供するために、膜の表面に成長した疎水性胞子とmyceliaを除去し、ステップ4.2を容易にします。
2. ステップ3.4で説明したように、作業面が水平であることを確認し、血清ピペットを使用して23 mLの暖かい陽イオン調整MHB寒天を吸引する。脱複製プレートの表面に20mLを均等に分配し、空気の泡の形成を防ぐためにピペットに媒体の残りの部分を残すことによってオーバーレイを作成します。
3. 媒体がすべての領域を覆うまでプレートを穏やかに回転させ、寒天が完全に設定されるまでそれを邪魔しません。冷却して固化したら、脱複製プレートを密閉されたビニール袋に戻し、一晩4°Cで逆さまに保管します。
   注:このステップは、発酵ベネットの媒体からMHB寒天オーバーレイへの二次代謝産物の拡散を可能にする。ニトロセルロース膜が適切に調製されなかった場合、MHB寒天を撃退する疎水性特性を有するプレートの縁の周りに胞スが生育します。オーバーレイが汚染される可能性があるため、これらの胞子の上にオーバーレイを注ぎ込まないようにしてください。
4. オーバーレイが注がれた同じ日に、100 μLの陽イオン調整MHBを96ウェルプレートの各ウェルにピペッティングして、新鮮なARP/MARPテンプレートを接種します。
   注:脱複製中に汚染が広がる可能性を減らすには、単一のARP/MARPライブラリプレートを使用して、2-3脱複製プレートのみをデレプリケートします。したがって、脱複製される株の数に基づいて、十分な96ウェルARP/MARPプレートを接種します。
5. 冷凍ストックARP/MARPライブラリプレートを-80 °C冷凍庫から取り出します。結露が下側に形成され始める前にアルミニウムシールを取り除き、それによって図書館の板の近隣の井戸を汚染する可能性を減らす。
6. 無菌の96ウェルピン留めツール(または他の形態の接種装置)を使用して、冷凍ストックARP/MARPライブラリプレートから慎重にピン留めし、新鮮なMHB含有96ウェルプレートを接種します。脱複製時の汚染を最小限に抑えるには、ライブラリプレートごとに2−3のデレプリケーションプレートのみをデプリケートするために必要なARPまたはMARPライブラリプレートをいくつでも準備します。各プレートを接種する間にピン留めツールを殺菌します。
7. 冷凍テンプレートに新しい無菌アルミニウムシールを貼り、-80°C冷凍庫に戻します。密封されたビニール袋の中に接種された96ウェルプレートを入れ、18時間通気(250 rpm)で37°Cでインキュベートします。
   注:新しい冷凍ストックライブラリプレートは、汚染が存在しないことを確認した後、この手順から準備することができます。ステップ2.5に記載されているように-80 °Cで保存する前にプレートにグリセロールを追加します。

5. ARP/MARP を使用したリプリケートの再現

1. インキュベーターから ARP/MARP テンプレートを取り外し、汚染物質が存在しないことを確認します。常に、冷凍在庫から直接ではなく、新たに準備されたテンプレートを使用して複製を削除します。
2. 4°Cから脱複製プレートを取り出し、室温まで平衡化します。結露がある場合は、蓋を開け、無菌環境で乾燥させます。
3. 無菌ピンニングツール(またはその他の接種装置)を使用して、ARP/MARPライブラリプレートから脱複製プレートのMHB寒天オーバーレイの表面にピンをピン留めします。寒天に突き刺さらないのは注意が必要だ。各脱複製プレートを接種する間にピン留めツールを殺菌します。
4. テンプレートを脱複製プレートの表面に固定した後、テンプレートの接種を3-5分間乾燥させます。
5. 次の日の脱複製結果を分析し、脱複製プレート上の成長を ARP/MARP マップに対応するウェルと比較します (表 3および表 4)。

結果

以下の結果は、ARPおよび/またはMARPを使用して抗生物質産生株のコレクションが非複製された場合に得られた。

ARP/MARP 脱複製ワークフローの図を図 1に示し、ライブラリ プレート マップを補足図 1および補足図 2 に示します。図2は、環境抽出物WAC 8921がクロラムフェニコール生産者として同定される?...

ディスカッション

上記のプロトコルは、その活性を救出するために既存の抗生物質と組み合わせて使用することができる新しい抗菌化合物およびアジュバントの両方の発見に適用することができる。プラットフォームは、耐薬品抽出物内の化合物を脱複製するために、抵抗機構とその認知抗生物質の高い基質特異性を利用します。脱複製プレートの調製に要する時間は長い(~2週間)が、一晩のインキュベーショ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Bio Shop	AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage	Sigma-Aldrich	Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt	Bio Shop	AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)	Becton Dickinson	212322
BBL Phytone Peptone (Soytone)	Becton Dickinson	211906
Calcium Carbonate	Bio Shop	CAR303.500
Casamino acid	Bio Basic	3060
Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-101
CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour	Sarstedt	72.379.992
D-glucose	Bio Shop	GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm	Fisher Scientific	14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous	Commercial Alcohols	P016EAAN
Glass Beads, Solid	Fisher Scientific	11-312C
Glycerol	Bio Shop	GLY001.4
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Instant sealing sterilization pouch	Fisher Scientific	01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich	F7002-250G
Kanamycin Sulfate	Bio Shop	KAN201.50
LB Broth Lennox	Bio Shop	LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Fisher Scientific	M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size	Millipore-Sigma	HAWP00010	10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base	Sarstedt	82.1582.001
New Brunswick Innova 44	Eppendorf	M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Fisher Scientific	264728	with lid, sterile, non treated
Petri dish 92 mm x 16 mm with cams	Sarstedt	82.1473.001
Pinning tools	ETH Zurich	-	Custom order
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P217-500
Potato starch	Bulk Barn	279
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Sodium Nitrate	Fisher Scientific	S343-500
Wood Applicators	Dukal Corporation	9000
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2