Dereplication antibiotico utilizzando la piattaforma di resistenza agli antibiotici

Riepilogo

Descriviamo una piattaforma che utilizza una libreria di Escherichia coli resistente agli antibiotici isogenici per la dereplicazione degli antibiotici. L'identità di un antibiotico prodotto da batteri o funghi può essere dedotta dalla crescita di E. coli che esprime il suo rispettivo gene di resistenza. Questa piattaforma è economicamente efficace ed efficiente in termini di tempo.

Abstract

Una delle principali sfide nella ricerca di nuovi antibiotici da estratti di prodotti naturali è la riscoperta di composti comuni. Per affrontare questa sfida, la dereplicazione, che è il processo di identificazione dei composti noti, viene eseguita su campioni di interesse. I metodi per la dereplicazione, ad esempio la separazione analitica seguita dalla spettrometria di massa, richiedono molto tempo e richiedono molto tempo. Per migliorare il processo di dereplicazione, abbiamo sviluppato la piattaforma di resistenza agli antibiotici (ARP). L'ARP è una libreria di circa 100 geni di resistenza agli antibiotici che sono stati clonati individualmente in Escherichia coli. Questa raccolta di ceppi ha molte applicazioni, tra cui un metodo facile e conveniente per la dereplicazione antibiotica. Il processo prevede la fermentazione di microbi che producono antibiotici sulla superficie di piatti Petri rettangolari contenenti mezzo solido, consentendo così la secrezione e la diffusione di metaboliti secondari attraverso il mezzo. Dopo un periodo di fermentazione di 6 giorni, la biomassa microbica viene rimossa e una sottile sovrapposizione di agar viene aggiunta alla parabola Petri per creare una superficie liscia e consentire la crescita dei ceppi dell'indicatore E. coli. La nostra collezione di ceppi ARP viene poi appuntata sulla superficie del piatto Petri che contiene antibiotici. La piastra viene successivamente incubata durante la notte per consentire la crescita di E. coli sulla superficie della sovrapposizione. Solo i ceppi contenenti resistenza a un antibiotico (o classe) specifico crescono su questa superficie consentendo una rapida identificazione del composto prodotto. Questo metodo è stato utilizzato con successo per l'identificazione dei produttori di antibiotici noti e come mezzo per identificare quelli che producono nuovi composti.

Introduzione

Dalla scoperta della penicillina nel 1928, i prodotti naturali derivati da microrganismi ambientali hanno dimostrato di essere una ricca fonte di composti antimicrobici¹. Circa l'80% degli antibiotici del prodotto naturale sono derivati da batteri del genere Streptomyces e altri actinomycetes, mentre il restante 20% è prodotto da specie fungine¹. Alcuni degli scaffold antibiotici più comuni utilizzati nella clinica, come i lactam, le tetracicline, i rifamycin e gli amminocolici, erano originariamente isolati dai microbi². Tuttavia, a causa dell'aumento dei batteri multifarmacoresistenti (MDR), il nostro attuale gruppo di antibiotici è diventato meno efficace nel trattamento^3,4. Questi includono gli agenti patogeni "ESKAPE" (cioè enterococci resistenti alla vancomicina e Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinebacter baumannii, e Enterobacter sp.), che sono un sottoinsieme di batteri ritenuti associati al più alto rischio da un certo numero di importanti autorità sanitarie pubbliche come l'Organizzazione Mondiale della Sanità^3,4,5. L'emergere e la diffusione globale di questi patogeni MDR si traduce in un costante bisogno di nuovi antibiotici^3,4,5. Purtroppo, gli ultimi due decenni hanno dimostrato che la scoperta di nuovi antibiotici da fonti microbiche è sempre più difficile⁶. Gli attuali approcci alla scoperta di farmaci includono lo screening ad alto consumo di composti bioattivi, comprese le librerie di estratti di prodotto naturali, consentendo il test di migliaia di estratti in un dato momento². Tuttavia, una volta rilevata l'attività antimicrobica, il passo successivo è quello di analizzare il contenuto dell'estratto grezzo per identificare il componente attivo ed eliminare quelli che contengono composti noti o ridondanti^7,8. Questo processo, denominato dereplicare, è fondamentale per prevenire e/o ridurre significativamente il tempo dedicato alla riscoperta di antibiotici noti^7,9. Anche se un passo necessario nella scoperta di farmaci di prodotto naturale, dereplication è notoriamente laborioso e ad alta intensità di^{risorse 10}.

Da quando Beutler et al. per la prima volta ha coniato il termine "dereplication", sono stati fatti sforzi ampi per sviluppare strategie innovative per la rapida identificazione degli antibiotici noti^11,12. Oggi gli strumenti più comuni utilizzati per la dereplicazione includono sistemi cromatografici analitici come la cromatografia liquida ad alte prestazioni, la spettrometria di massa e i metodi di rilevamento basato sulla risonanza magnetica nucleare^11,13. Purtroppo, ognuno di questi metodi richiede l'uso di costose apparecchiature analitiche e un'interpretazione sofisticata dei dati.

Nel tentativo di sviluppare un metodo di dereplicazione che può essere eseguito rapidamente senza attrezzature specializzate, abbiamo stabilito la piattaforma di resistenza agli antibiotici (ARP)¹⁰. L'ARP può essere utilizzato per la scoperta di adiuvanti antibiotici, la profilazione di nuovi composti antibiotici contro meccanismi di resistenza noti e la dereplicazione di antibiotici noti in estratti derivati da actinobatteri e altri microbi. Qui, ci concentriamo sulla sua applicazione nella dereplicazione antibiotica. L'ARP utilizza una libreria di ceppi isogenici di Escherichia coli che esprimono singoli geni di resistenza che sono efficaci contro gli antibiotici più comunemente riscoperti^14,15. Quando la biblioteca E. coli viene coltivata in presenza di un organismo secondario che produce metaboliti, l'identità del composto può essere dedotta dalla crescita di ceppi di E. coli che esprimono il suo gene di resistenza associato¹⁰. Quando l'ARP è stato segnalato per la prima volta, la biblioteca consisteva di >40 geni che conferevano resistenza a 16 classi di antibiotici. Il modello originale di dereplicazione è stato progettato per comprendere un sottoinsieme di geni della resistenza per classe di antibiotici per fornire informazioni riguardanti la sottoclasse di antibiotici durante il processo di dereplicazione. Oggi, l'ARP è composto da >90 geni che conferiscono resistenza a 18 classi di antibiotici. Utilizzando la nostra vasta collezione di geni di resistenza, è stato sviluppato un modello di dereplicazione secondario ed è noto come la piattaforma di resistenza agli antibiotici minima (MARP). Questo modello è stato creato per eliminare la ridondanza genica e per fornire semplicemente informazioni riguardanti la classe antibiotica generale a cui è correlato un metabolita. Inoltre, il modello MARP possiede sia wildtype che un ceppo iperpermeabile/efflusso carente di E. coli BW25113(E. coli BW25113 -bam B-tolC), rispetto all'incarnazione originale dell'ARP, che solo utilizza il ceppo iperpermeabile. Questo aspetto unico crea fenotipi aggiuntivi durante la dereplicazione, indicando una capacità di composti di attraversare la membrana esterna dei batteri Gram-negativi. Qui, descriviamo un protocollo robusto da seguire quando descriviamo con l'ARP e/o la MARP, evidenziamo i passaggi più critici da seguire e discutiamo i vari possibili risultati.

Protocollo

1. Preparazione di E. coli Library Glycerol Stocks (da Agar Slants)

1. Streak i ceppi ARP/MARP E. coli dal brodo di lisogenia (LB) agar obise piatti Petri contenenti agar LB e il marcatore selezionabile appropriato (Tabella 1).
2. Preparare le colture per ciascuno dei ceppi di E. coli inoculando 3 mL di LB contenenti il marcatore selezionabile appropriato con una singola colonia. Coltivare durante la notte a 37 gradi centigradi con aerazione (250 giri/min).
3. Unire 800 l di coltura e 200 l un l di sterile 80% glicerolo in un crioviale da 1,8 ml. Mescolare invertendo i tubi 3/4 volte, e conservare a -80 gradi centigradi.

2. ARP/MARP Preparazione piastra stock congelati

1. Streak i ceppi ARP/MARP dalle scorte di glicerolo preparate nella sezione 1 su una nuova serie di piatti Petri contenenti agar LB e il marcatore selezionabile appropriato. Coltivare durante la notte a 37 gradi centigradi.
2. Utilizzando la tecnica asettica, la pipetta 500 -L di cation regolato brodo Mueller Hinton (MHB) da un serbatoio sterile in ogni pozzo di una piastra sterile 96 profondo pozzo.
3. Con le piastre preparate nel passaggio 2.1, utilizzare un bastone applicatore per inoculare la piastra del pozzo profondo 96 in conformità con la mappa ARP/MARP (Figura supplementare 1 e Figura supplementare 2). Assicurarsi che a ogni bene venga aggiunto il marcatore selezionabile appropriato. Posizionare una membrana di sigillamento traspirante sulla superficie della piastra del pozzo profondo e incubare durante la notte a 37 gradi centigradi ( 250 giri/min).
4. Assicurarsi che non vi siano pozzi contaminati facendo riferimento alla mappa ARP/MARP. Ripetere se contaminato. Utilizzando un pipettor multicanale, trasferire 100 l da ogni pozzo della piastra del pozzo profondo a una piastra inferiore rotonda 96-well sterile. Ripetere questo passaggio per creare più piastre di libreria di scorte bloccate.
   NOT: È meglio preparare almeno 5 piatti della biblioteca alla volta per evitare di ripetere i passi 2.1.2.4 in caso di contaminazione congelata della libreria di magazzini.
5. Finire di realizzare le piastre della libreria di magazzino congelati ARP/MARP con pipettando 100 gradi di glicerolo sterile 50% in ogni pozzo e mescolare pipettando delicatamente su e giù.
6. Coprire le piastre con guarnizioni sterili in alluminio e assicurarsi che ogni pozzo sia sigillato individualmente.
7. Numerare le piastre e dedicare una sola piastra congelata per l'inoculazione di nuovi modelli in un determinato momento. Mantenere il resto come back-up in caso di contaminazione della piastra di riserva congelata.
8. Posizionare il coperchio della piastra sulla parte superiore del sigillo di alluminio e conservare a -80 gradi centigradi.

3. Cultura dei semi e preparazione della piastra di dereplicazione

1. Utilizzando un bastone applicatore, inoculare 3 mL di Streptomyces mezzo antibiotico (SAM) (o altro mezzo appropriato per l'organismo sottoposto a test) in un tubo di prova contenente una perla di vetro sterile (per rompere il micelio) con il ceppo di produzione che deve essere dereplicato. Per Streptomyces, raschiare delicatamente le spore dalla superficie di una colonia.
2. Utilizzando lo stesso bastone applicatore in legno, striscia un controllo di sterilità su un piatto Petri contenente agar di Bennett.
3. Incubare la coltura del seme a 30 gradi centigradi con aerazione per 6 giorni (250 giri/min) e incubare la piastra di controllo della sterilità a 30 gradi centigradi per 6 giorni.
   NOT: Fare riferimento alla Tabella 2 per le ricette multimediali di SAM e Bennett. Le istruzioni di cui sopra sono adatte per la maggior parte degli actinomycetes. Alterare i media di crescita come necessario per altri batteri e funghi.
4. Preparare piastre di dereplicazione aspirando 23 mL di agar caldo di Bennett in una pipetta sierologica e erogare 20 mL in modo uniforme sulla superficie di un piatto Petri rettangolare (Tabella dei materiali), lasciando il resto del mezzo nella pipetta per evitare formazione di bolle d'aria.
   NOT: Assicurarsi che la superficie utilizzata per versare le piastre sia livellata ed eseguire questo passaggio prima che l'agar si sia raffreddato troppo; una superficie piana è indispensabile per l'aggiunta della libreria nelle fasi successive.
5. Ruotare delicatamente la piastra fino a quando il mezzo copre tutte le aree della piastra e non disturbarlo fino a quando l'agar è impostato completamente.
6. Preparare i fogli di membrana di nitrocellulosa (Tabella dei materiali) utilizzando un coperchio piatto Petri rettangolare come modello di tracciamento in modo che i fogli si adattino alla superficie della piastra di dereplicazione. Tagliare le lenzuola e autoclave in una sacca sterile.
   NOT: Questa membrana permette agli organismi di sporchezzare sulla sua superficie, mentre i metaboliti secondari possono essere espulsi nel mezzo sottostante. Una volta coltivata, la membrana viene rimossa per fornire una superficie pulita per la dereplicazione. Più la vestibilità più vicina ha la carta a membrana sulla superficie dell'agar dello Bennett, più pulito è il risultato della dereplicazione.
7. Controllare la piastra di controllo della sterilità per assicurarsi che non siano presenti contaminanti dopo 6 giorni di incubazione. Se privo di contaminazione, togliere il coperchio del piatto rettangolare Petri e della pipetta 200 -L di coltura dei semi sulla superficie dell'agar del Bennett.
8. Diffondere uniformemente la coltura su tutta la superficie dell'intera piastra utilizzando un tampone di cotone sterile.
9. Posizionare la membrana di nitrocellulosa preparata al punto 3.6 sopra la coltura sulla superficie del piatto Petri. Iniziare allineando il bordo inferiore della membrana al bordo inferiore della parabola Petri e applicare lentamente la membrana dal bordo inferiore al bordo superiore della piastra.
10. Utilizzare un tampone sterile di cotone per appianare eventuali bolle d'aria che potrebbero essersi formate tra l'interfaccia membrana-agar, assicurando che la membrana sia a filo per l'agar.
11. Rimettere il coperchio sul piatto rettangolare Petri e metterlo a testa in giù in un sacchetto di plastica sigillato. Incubare a 30 gradi centigradi per 6 giorni.

4. Dereplication Plate MHB Overlay e Preparazione della piastra di libreria ARP/MARP

1. Dopo 6 giorni, rimuovere la piastra di dereplicazione dall'incubatrice di 30 gradi centigradi. Utilizzando una pinzetta sterile (autoclaved o spruzzate accuratamente con 70% di etanolo), rimuovere con cura la membrana di nitrocellulosa dalla superficie dell'agar del Bennett.
   NOT: Questo passaggio rimuoverà le spore idrofobiche e i miceli coltivati sulla superficie della membrana per fornire una superficie pulita per la dereplicazione, facilitando il passaggio 4.2.
2. Come descritto per il passaggio 3.4, assicurarsi che la superficie di lavoro sia livellata e utilizzare una pipetta sierologica per aspirare 23 mL di agar MHB regolato per la tation caldo. Creare una sovrapposizione erogando 20 mL in modo uniforme sulla superficie della piastra di dereplicazione, lasciando il resto del mezzo nella pipetta per evitare la formazione di bolle d'aria.
3. Ruotare delicatamente la piastra fino a quando il mezzo copre tutte le aree e non disturbarlo fino a quando l'agar è impostato completamente. Una volta raffreddata e solidita, riportare la piastra di dereplicazione nel sacchetto di plastica sigillato e riporre a testa in stolto a 4 gradi centigradi durante la notte.
   NOT: Questo passaggio consente la diffusione di metaboliti secondari dal mezzo fermentato di Bennett nella sovrapposizione di agar MHB. Se la membrana di nitrocellulosa non è stata preparata correttamente ci sarà la crescita delle spore intorno ai bordi della piastra, che hanno proprietà idrofobiche che respingono l'agar MHB. Non versare la sovrapposizione sopra queste spore perché può causare la contaminazione della sovrapposizione.
4. Lo stesso giorno in cui viene versata la sovrapposizione, inoculare un nuovo modello ARP/MARP con il pipettaggio di 100 L di cation regolato MHB in ogni pozzetto di una piastra di 96 pozzetti.
   NOT: Per ridurre la possibilità di diffusione della contaminazione durante la dereplicazione, utilizzare una singola piastra della libreria ARP/MARP per dereplicare solo le piastre di dereplicazione 2-3. Pertanto, inoculare abbastanza 96-well piastre ARP/MARP in base al numero di ceppi che verranno dereplicati.
5. Togliere la piastra di libreria ARP/MARP congelata dal congelatore -80 . Rimuovere la guarnizione in alluminio prima che la condensa inizi a formarsi sulla parte inferiore, diminuendo così la possibilità di contaminare i pozzi vicini nella piastra della libreria.
6. Utilizzando strumenti sterili a pungiglione 96 ben (o altre forme di attrezzature per l'inoculazione), pin accuratamente dal supporto congelato ARP / MARP piastra della libreria e inoculare le piastre fresche MHB-contenente 96 pozzetti. Per ridurre al minimo la contaminazione durante la dereplica, preparare tutte le piastre della libreria ARP o MARP necessarie per dereplicare solo 2/3 piastre di dereplicazione per piastra di libreria. Sterilizzare gli strumenti di fissaggio tra l'inoculazione di ogni piastra.
7. Mettere una nuova guarnizione sterile in alluminio sul modello congelato una volta completato e riportarlo al congelatore -80 gradi centigradi. Collocare le piastre inoculate di 96 pozzetti all'interno di un sacchetto di plastica sigillato e incubare a 37 gradi centigradi con aerazione (250 giri/min) per 18 h.
   NOT: Da questo passaggio possono essere preparate nuove piastre di libreria di brodo congelati, dopo aver assicurato che non sia presente alcuna contaminazione. Aggiungere il glicerolo alla piastra prima di conservare a -80 gradi centigradi, come descritto al punto 2.5.

5. Dereplicazione mediante ARP/MARP

1. Rimuovere il modello ARP/MARP dall'incubatrice e assicurarsi che non siano presenti contaminanti. Dereplicate sempre utilizzando un modello appena preparato e non direttamente dal supporto congelato.
2. Togliere le piastre di dereplicante a partire da 4 gradi centigradi e lasciare che l'eclichino a temperatura ambiente. Se c'è condensa, aprire i coperchi e lasciare asciugare in un ambiente sterile.
3. Utilizzando strumenti di pinning sterili (o altre attrezzature per l'inoculazione), pin dalla piastra della libreria ARP/MARP sulla superficie della sovrapposizione di agar MHB delle piastre di dereplicazione. Fare attenzione a non forare l'agar. Sterilizzare gli strumenti di pinning tra l'inoculazione di ogni piastra di dereplicazione.
4. Dopo aver appuntato il modello sulla superficie delle piastre di dereplicazione, lasciare asciugare il modello inoculum per 3-5 min.
5. Analizzare i risultati della dereplicazione il giorno successivo confrontando la crescita sulla piastra di dereplicazione con i pozzi che corrispondono alla mappa ARP/MARP (tabella 3 e tabella 4).

Risultati

I seguenti risultati sono stati ottenuti quando una raccolta di ceppi di interesse che producono antibiotici è stata dereplicata utilizzando l'ARP e/o la MARP.

Un diagramma del flusso di lavoro di dereplica ARP/MARP è illustrato nella Figura 1e le mappe a piastre della libreria sono illustrate nella figura supplementare 1 e nella figura supplementare 2. Figura 2 dimostra un risultato positivo di der...

Discussione

Il protocollo sopra descritto può essere applicato sia alla scoperta di nuovi composti antimicrobici e di adiuvanti che possono essere utilizzati in combinazione con antibiotici esistenti per salvare la loro attività. La piattaforma sfrutta l'elevata specificità del substrato dei meccanismi di resistenza e dei loro antibiotici in cognato, per dereplicare i composti all'interno di estratti di prodotti naturali grezzi. Anche se il tempo necessario per la preparazione delle piastre di dereplicazione è lungo (2 settimane...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Bio Shop	AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage	Sigma-Aldrich	Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt	Bio Shop	AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)	Becton Dickinson	212322
BBL Phytone Peptone (Soytone)	Becton Dickinson	211906
Calcium Carbonate	Bio Shop	CAR303.500
Casamino acid	Bio Basic	3060
Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-101
CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour	Sarstedt	72.379.992
D-glucose	Bio Shop	GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm	Fisher Scientific	14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous	Commercial Alcohols	P016EAAN
Glass Beads, Solid	Fisher Scientific	11-312C
Glycerol	Bio Shop	GLY001.4
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Instant sealing sterilization pouch	Fisher Scientific	01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich	F7002-250G
Kanamycin Sulfate	Bio Shop	KAN201.50
LB Broth Lennox	Bio Shop	LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Fisher Scientific	M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size	Millipore-Sigma	HAWP00010	10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base	Sarstedt	82.1582.001
New Brunswick Innova 44	Eppendorf	M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Fisher Scientific	264728	with lid, sterile, non treated
Petri dish 92 mm x 16 mm with cams	Sarstedt	82.1473.001
Pinning tools	ETH Zurich	-	Custom order
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P217-500
Potato starch	Bulk Barn	279
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Sodium Nitrate	Fisher Scientific	S343-500
Wood Applicators	Dukal Corporation	9000
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2