非ヒト霊長類膵島酸素消費量の分析

要約

このプロトコルは、非ヒト霊長類膵島における酸素消費量の正確かつ再現性の測定を示す。マイクロプレートの小口ローディング技術およびコーティングは、他のタイプの培養スフェロイドにおける呼吸の効率的な測定のためのフレームワークを提供する。

要約

ex vivo膵島のような細胞の回転楕円体クラスターにおける酸素消費量の測定は、歴史的に困難でした。回転楕円体中の酸素消費量の測定用に設計された96ウェルマイクロプレートを用いて、小本当座酸素消費量の測定を実証する。このアッセイでは、回転楕円体マイクロプレートは、アッセイの前日に細胞および組織接着剤でコーティングされる。少量の接着剤溶液を利用して、井戸の底だけに対するイツラシの付着を促します。アッセイの日に、15個の小島が各井戸のベースに直接積み込まれ、小島の最適な位置決めと酸素消費量の正確な測定を保証する技術を使用します。ミトコンドリア呼吸の様々な側面は、ATP依存性呼吸、最大呼吸、およびプロトン漏出を含む非ヒト霊長類の島で薬理学的にプローブされる。この方法では、井戸あたりの小島の数が少ないだけで、一貫性のある再現可能な結果が得られます。理論的には、同様のサイズの任意の培養回転楕円体に適用することができる。

概要

正常な血糖値を維持するために、膵臓β細胞はグルコースの上昇を感知し、それに応じてインスリンを分泌しなければならない。グルコースレベルとインスリン分泌の結合は、グルコース代謝とミトコンドリア酸化リン酸化リン酸化を介してATPの産生に直接リンクされています。従って、ミトコンドリアは刺激分泌結合¹において重要な役割を果たす。β細胞ミトコンドリア機能を評価すると、インスリン分泌障害につながる欠陥を明らかにすることができます。膵臓α細胞によるグルカゴンの分泌もミトコンドリア機能²と密接に結びついている。不死化した島の細胞株は、いくつかのタイプのアッセイに有用であることが証明されているが、これらの細胞の生理学は、グルカゴン^3、4およびインスリン/ソマトスタチン^5、6無傷のイレットによるインスリン分泌の増強によって示すように^、全島機能を正確に再現しない。これは、完全な、無傷の小島を使用して酸素消費量を測定する必要性を示しています。

アイソレ細胞の呼吸法の測定技術は、酸素感受性蛍光色素⁷の使用から酸素消費量^を直接測定する固体センサまで、時間の経過とともに進化してきた。当初は単層、付着細胞、一般的に使用される細胞培養プレートシステム用に設計されており、膵島には効果がないことが証明されている。小島は自然に井戸に付着しないので、それらはよく酸素消費量⁹の不正確な測定をもたらす培養の周辺に押し込まれる傾向がある。この問題に対処するために、小島を含むことができる中央うつ病を持つ特殊な24ウェルプレートが開発されました^9.しかし、24ウェルプレートシステムは、必要な多数の小島(井戸あたり50〜80)と^{同時にテスト}できる条件の数によって制限された。スフェロイドの細胞外フラックス解析のために特別に設計された96ウェルマイクロプレートの最近の開発は、これらの障壁を克服し、井戸¹⁰あたり20以下の小島で島の呼吸の測定を可能にする。

ここでは、ヒト^11、12に類似した島の生物学を持つ動物モデルであるニホンザル(マカカフスカタ)からの島の酸素消費量を測定するためにこのシステムの使用を実証する。このプロトコルでは、15個のマカク島がウェルごとに分析されます。私たちの手では、15の島は、より少ない島よりも高いベースライン酸素消費量を生産し、薬理学的操作に応答して呼吸の堅牢な活性化と抑制を行いました。アッセイに備えるステップ、各井戸の中心に島を一貫して積み込むための効果的な方法、およびこのアッセイを行う際の一般的な課題を強調します。

プロトコル

1. アッセイを実行する前日のマイクロプレートおよびセンサーカートリッジの準備

島は、前に説明した¹³として3歳のニホンザルから分離されました。この方法は、人間の膵島を死体ドナーから分離するために使用されるものと非常によく似ていますが、動物が沈下している間に、動物が臓器除去の前にコラゲターゼ溶液で膵臓を膨らませることが多いマウスとは異なります。島の取得は、オレゴン国立霊長類研究センター(ONPRC)およびオレゴン健康科学大学の制度動物ケア使用委員会(IACUC)のガイドラインに従って行われ、ONPRC IACUCによって承認されました。ONPRCは、米国農務省(USDA)が施行する動物福祉法および公衆衛生サービス方針および国立衛生研究所が公表する実験動物のケアと使用に関するガイドに従って、実験動物の人道的ケアと使用に関する公衆衛生サービスポリシーを遵守します。

1. 回転楕円体マイクロプレートの調製
   1. 重炭酸ナトリウムの0.1M溶液の3 mLを調製する。フィルターは、溶液を殺菌します。0.45μmフィルタ(材料表)を利用しました。
   2. 細胞培養フードに、200μLの細胞および組織接着剤(材料の表)を0.1M重炭酸ナトリウムの2.8mLに加えます。次に、この溶液の20°Lを96ウェルスフェロイドマイクロプレート(材料表)の各ウェルの底部に加える。気泡がピペット先端から取り除かれ、プレートの底面のみが覆われていることを確認します。マイクロプレートのコーティングは、アッセイ中に薬物が添加され、井戸に混合されたときに、小島が井戸の側面を上に移動するのを防ぎます。
      メモ:アッセイを実行する際に島に使用されるのと同じ数の井戸をコーティングする必要があります。少数のウェルのみを使用する場合は、細胞接着液を適宜スケールダウンすることができます。アッセイに用いられる細胞接着剤は、海洋ムール貝から抽出された製剤化タンパク質溶液である。あるいは、マイクロプレートウェルは、100μg/mLポリD-リジンの20°Lでコーティングすることができます。
   3. プレートを37°C、非_CO2インキュベーターで1時間インキュベートします。
   4. 無菌環境下で、プレートから細胞接着液を吸引する。マルチチャンネルピペットを使用して、37°Cの滅菌水400°Lで各ウェルを2回洗浄します。空気乾燥を許可します。
   5. 30~40分後、プレートを覆い、4°Cで一晩保管してください。
2. センサカートリッジの水和
   1. 無菌環境では、センサーカートリッジパッケージ(材料表)を開き、内容物を取り除きます。ユーティリティプレートの横にセンサーカートリッジを逆さまに置きます。
   2. ユーティリティプレートの各ウェルに200μLの滅菌水を充填し、センサーカートリッジをユーティリティプレートに戻します。組み立てられたセンサーカートリッジとユーティリティプレートを37°C、非_CO2インキュベーターに一晩入れます。
3. キャリブラントの準備
   1. 50 mL円錐状の管にキャリブラント(材料の表)のアリクォート25 mL。チューブを37°C、非_CO2インキュベーターに一晩入れます。

2. アッセイ当日のメディア準備、島の積み込み、センサーカートリッジの装入れに関するプロトコル

1. メディアの準備
   1. ベースメディアの48.5 mL(最小限のDMEM、材料の表を参照)に、1 mMピルビン酸ナトリウムと2 mMグルタミンのそれぞれ500 μLを追加します。さらに、200 mg/ml グルコースの 496 μL を追加します (メディア内のグルコースの最終濃度は 5.5 mM です)。
      注:これらの実験のためにベースライングルコース濃度を一定に保った。しかしながら、グルコースは、ブロー¹⁰について記載された薬理学的操作に加えて呼吸を刺激するためにも使用することができる。
   2. pHが7.4 +/- 0.1であることを確認し、必要に応じて調整します。
2. センサカートリッジの準備
   1. インキュベーターからセンサーカートリッジを取り出し、センサーカートリッジのふたを取り外し、井戸から水を捨ててください。200 mL の事前温めキャリブラントを各ウェルに入れ、センサーカートリッジの蓋を交換します。
   2. センサーカートリッジをインキュベーターに約1時間(必要になるまで)戻します。
3. ミトコンドリアストレスアッセイのための薬物の調製
   1. ストレス テスト キット (材料の表) を開き、内容を削除します。オリゴマイシン、カルボニルシアニド-4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)、ロテノン/アンチマイシンA(AA)のストックおよびワーキングソリューションを以下のように構成します。
      1. オリゴマイシン:組み立てられたメディアの630 μLをチューブに追加して、100μMのストックを作ります。次いで、媒体で45μMに希釈してポート濃度を得る(注入後の最終的な井戸濃度は4.5μMになる)
      2. FCCP: 組み立て済みメディアの 720 μL をチューブに追加して、100 μM のストックを作成します。ポート濃度を得るために媒体で10μMに希釈する(最終的な井戸濃度は1μMになる)
         メモ: BSA および/または FBS は、ミトコンドリア アンカプラー¹⁴の動作に影響を与える可能性があるため、メディアに追加しないでください。
      3. ロテノールネ/AA:540μLの組み立てメディアをチューブに追加して、50μMのストックを作ります。ポート濃度を得るためにメディアで25μMに希釈する(最終的な井戸濃度は2.5μMになる)
         注:上記の濃度は、私たちの手に一貫した結果を生成しています。追加のFCCPは、呼吸のさらなる増加につながった.しかし、薬物濃度は、島の大きさ、特に異なる種または非島球状体からの島に応じて調整する必要があります。参考までに、非ヒト霊長類の平均直径は約150μm15である。
4. 回転楕円体板の調製と小島の移入
   1. 組み立てられた媒体を含む60ミリメートルx 15mm細胞培養皿に膵島を手で選び、ほぼ100%の純度を得る。
      注:島は、明確に定義された周辺で丸く見える必要があり、異分泌組織汚染物質よりも密度が高く見えます。損傷やほつれと見える小島は避けてください。この実験では、小島の大きさは直接測定されなかったが、井戸と試料ごとにほぼ同等の大きさの小島を選ぶ試みをみた。
   2. マルチチャンネルピペットを使用して、組み立てられたメディアの175°Lで回転楕円体マイクロプレートの各ウェルをロードします。
   3. 15μLに設定されたP20ピペットを用いて、細胞培養皿から15個の小島を吸引する。島は肉眼にピペットの先端で見える必要があります。
   4. 小島を回転楕円体マイクロプレートに移すために、ピペット先端を井戸の底部に下げ、かろうじて持ち上げ、非常に小さな体積(〜5°L)をゆっくりとピペットアウトする。すべての島がピペットチップを残していることを確認します。各井戸は15の島を受け取る必要があります。時折、顕微鏡下の回転楕円体マイクロプレートをチェックして、小島が側面にくっつくのではなく、各井戸の底にあることを確認します。
      メモ: 小島でコーナーウェルをロードしないでください。プラスチックからの酸素およびpHフラックスは、アッセイ中に起こり得る、これは4つのコーナー井戸で悪化する。
   5. すべての小島が回転楕円体マイクロプレートに移されたら、以下の手順を完了しながら、37°、非_CO2インキュベーターでマイクロプレートをインキュベートします。
5. センサーカートリッジのロードとアッセイの実行
   1. インキュベーターからセンサーカートリッジを取り外します。各井戸のポートA-Cは、薬物または媒体のいずれかでロードする必要があります。小島と4つのコーナー井戸を含む井戸は、薬物をロードする必要があります。小島のないコーナー以外の井戸には、メディアをロードする必要があります。ポート D は空のままにしておくことができます。20°Lのオリゴマイシンまたはメディアを搭載したロードポートA(各センサの左上)。FCCPまたはメディアの22°LでポートB(右上)をロードします。ロテノネ/AAまたはメディアの25°LでポートC(左下)をロードします。
   2. 30分ベースライン呼吸期間(3分ミックスの5サイクル、3分測定)、42分オリゴマイシン測定期間(3分ミックスの7サイクル、3分測定)、30分FCCP(3分ミックスの5サイクル、3分測定)、および30分ロテノネ/AA(3分ミックス、3分測定の5サイクル)に対する細胞外フラックスアナライザアッセイをプログラムする。
   3. アッセイを実行し、センサーをキャリブレーションし、マイクロプレートを挿入するための画面の指示に従います。

結果

小島をマイクロプレートにロードするには、図1Aに示すように、15個の小島を15μLの媒体で吸引する必要があります。島は数秒以内にピペットチップの底部に向かって自然に沈殿します。その後、ピペットチップは井戸の底部に下がります。先端は非常にわずかに持ち上げられ、小さな容積(約5°L)は小さな小腸と一緒にピペットされ?...

ディスカッション

島の酸素消費量の研究は、以前、島の球形の形状、培養面への付着の欠如、および井戸あたりの必要な島の数によって妨げられてきた。このプロトコルでは、少数の小島の島の酸素消費量を測定するための96ウェルスフェロイドマイクロプレートの有効性を強調し、技術的に実現可能で一貫した島を処理し、ロードする技術を実証します。結果。

小島がマイクロプレート...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style	Corning	430166
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	Corning	354240
Conical tube, 50 mL	Falcon	352070
Dextrose anhydrous	Fisher Scientific	BP350-1	For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered
Disposable reservoirs (sterile), 25 ML	Vistalab	3054-1033	for loading multichannel pipet
EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm	Foxx Life Sciences	371-3115-OEM
L-glutamine	Gibco	25030-081	200 mM (100x)
Multichannel pipette tips	ThermoFisher Scientific	94410810
Multichannel pipette, 15-1250 μL	ThermoFisher Scientific	4672100BT	Recommended
P20, P200, and P1000 pipettes	Eppendorf	2231000602
pH Probe	Hanna Instruments	HI2210-01
Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL	Olympus	24-404, 24-412, 24-430
Seahorse XF Base Media	Agilent	103334-100
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	S7800B	Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini	Agilent	102905-100	Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	BP328-500
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070	100 mM (100x)
Stereo Microscope	Olympus	SZX9
Syringe (sterile), 5 mL	BD	309603	For sterile filtration
Water (sterile)	Sigma	W3500-500mL