Analyse des Sauerstoffverbrauchs der nichtmenschlichen Primaten-Pankreas-Islet

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert die genaue und reproduzierbare Messung des Sauerstoffverbrauchs in nichtmenschlichen Pankreasinseln. Die Beladetechniken der Isleten und die Beschichtung der Mikroplatte bieten einen Rahmen für eine effiziente Messung der Atmung in anderen Arten von kultivierten Sphäroiden.

Zusammenfassung

Die Messung des Sauerstoffverbrauchs in Sphäroid-Clustern von Zellen, wie ex vivo Pankreasinseln, war historisch eine Herausforderung. Wir demonstrieren die Messung des Sauerstoffverbrauchs der Islet enmitieren mit einer 96-Well-Mikroplatte, die für die Messung des Sauerstoffverbrauchs in Sphäroiden entwickelt wurde. In diesem Test werden Sphäroid-Mikroplatten am Tag vor dem Test mit einem Zell- und Gewebekleber beschichtet. Wir verwenden ein kleines Volumen an Klebstofflösung, um die Befolgung der Leten nur an der Unterseite des Brunnens zu fördern. Am Tag des Assays werden 15 Inselchen mit einer Technik, die eine optimale Positionierung der Inselchen und eine genaue Messung des Sauerstoffverbrauchs gewährleistet, direkt in die Basis jedes Brunnens geladen. Verschiedene Aspekte der mitochondrialen Atmung werden pharmakologisch in nichtmenschlichen Primateninseln untersucht, einschließlich ATP-abhängiger Atmung, maximaler Atmung und Protonenleck. Diese Methode ermöglicht konsistente, reproduzierbare Ergebnisse mit nur einer kleinen Anzahl von Inselchen pro Bohrplatz. Es kann theoretisch auf alle kultivierten Sphäroide ähnlicher Größe angewendet werden.

Einleitung

Um den normalen Blutzuckerspiegel aufrechtzuerhalten, muss die Pankreas-Zelle Erhöhungen in Glukose spüren und Insulin entsprechend absondern. Die Kopplung der Insulinsekretion mit dem Glukosespiegel ist direkt mit dem Glukosestoffwechsel und der Produktion von ATP durch mitochondriale oxidative Phosphorylierung verbunden. Daher spielen Mitochondrien eine entscheidende Rolle bei der Stimulus-Sekretionskopplung¹. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion der Zelle kann Defekte aufdecken, die zu einer beeinträchtigten Insulinsekretion führen. Die Sekretion von Glucagon durch Pankreaszellen ist ebenfalls eng mit der mitochondrialen Funktion²verbunden. Obwohl sich verewigte Inselzelllinien für einige Arten von Assays als nützlich erwiesen haben, rekapituliert die Physiologie dieser Zellen die Funktion der ganzen Insel inselnicht genau, wie die Potenzierung der Insulinsekretion durch Glucagon^3,4 und die Hemmung der Glucagonsekretion durch Insulin/Somatostatin^5,6 in intakten Inselchen zeigt. Dies zeigt die Notwendigkeit, den Sauerstoffverbrauch mit ganzen, intakten Inseln zu messen.

Techniken zur Messung der Isletzell-Respirometrie haben sich im Laufe der Zeit weiterentwickelt, von der Verwendung von sauerstoffempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffen⁷ bis hin zu Festkörpersensoren, die den Sauerstoffverbrauch direkt messen⁸. Ursprünglich für monolayer, haftende Zellen entwickelt, haben sich häufig verwendete Zellkulturplattensysteme als unwirksam für Pankreasinseln erwiesen. Da Inselchen nicht natürlich an den Brunnen haften, neigen sie dazu, an die Peripherie der Kultur brunnen geschoben zu werden, was zu einer ungenauen Messung des Sauerstoffverbrauchs⁹führt. Um dieses Problem zu bekämpfen, wurden spezialisierte 24-Well-Platten mit einer zentralen Depression entwickelt, die Inselchen enthalten könnte⁹. Das 24-Well-Plattensystem wurde jedoch durch die große Anzahl der benötigten Inseln (50-80 pro Brunnen) und die Anzahl der Bedingungen, die gleichzeitig getestet werden konnten,¹⁰begrenzt. Die jüngste Entwicklung von 96-Well-Mikroplatten, die speziell für die extrazelluläre Flussflussanalyse in Sphäroiden entwickelt wurden, hat diese Barrieren überwunden und ermöglicht die Messung der Inselrespirometrie mit 20 oder weniger Inselchen pro Brunnen¹⁰.

Hier zeigen wir die Verwendung dieses Systems zur Messung des Sauerstoffverbrauchs in Inselchen aus dem japanischen Makaken (Macaca fuscata), einem Tiermodell mit ähnlicher Inselbiologie wie Menschen^11,12. In diesem Protokoll werden 15 Makakeninseln pro Brunnen analysiert. In unseren Händen produzierten 15 Inseln pro Brunnen einen höheren Ausgangssauerstoffverbrauch als weniger Inseln, mit robuster Aktivierung und Unterdrückung der Atmung als Reaktion auf pharmakologische Manipulation. Wir heben die Schritte zur Vorbereitung auf den Assay hervor, eine effektive Methode für das konsistente Laden von Inselchen in der Mitte jedes Brunnens und gemeinsame Herausforderungen bei der Durchführung dieses Assays.

Protokoll

1. Vorbereitung von Mikroplatte und Sensorpatrone am Tag vor dem Ausführen des Assays

Inselchen wurden von dreijährigen japanischen Makaken isoliert, wie zuvor beschrieben¹³. Diese Methode ist sehr ähnlich der, die verwendet wird, um menschliche Inselchen von Kadaverspendern zu isolieren, unterscheidet sich aber von Mäusen, bei denen Pankreata oft mit Kollagenaselösung aufgeblasen werden, während das Tier unter Sedierung und vor der Organentfernung steht. Der Islet Retrieval wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Oregon National Primate Research Center (ONPRC) und der Oregon Health and Science University durchgeführt und vom ONPRC IACUC genehmigt. Das ONPRC hält sich an den Animal Welfare Act und die Vom Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten (USDA) durchgesetzten Vorschriften und die Politik des öffentlichen Gesundheitsdienstes zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren in Übereinstimmung mit dem von den National Institutes of Health veröffentlichten Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Herstellung von Spheroid Mikroplatte
   1. Bereiten Sie 3 ml einer 0,1M-Lösung von Natriumbicarbonat vor. Filter sterilisieren die Lösung. Wir haben einen 0,45-m-Filter (Materialtabelle )verwendet.
   2. In einer Zellkulturhaube 200 l Zell- und Gewebeklebstoff (Materialtabelle) zu 2,8 ml 0,1M Natriumbicarbonat hinzufügen. Fügen Sie dann 20 L dieser Lösung an den Boden jeder Bohrung der 96-Well-Sphäroid-Mikroplatte (Tabelle der Materialien) hinzu. Stellen Sie sicher, dass Luftblasen von der Pipettenspitze entfernt werden und nur der Boden der Platte abgedeckt ist. Die Beschichtung der Mikroplatte verhindert, dass sich Dieschen an den Seiten der Brunnen nach oben bewegen, wenn Medikamente hinzugefügt und während des Assays in den Brunnen gemischt werden.
      HINWEIS: Es ist nur notwendig, so viele Brunnen zu beschichten, wie für Inselchen verwendet werden, wenn der Test ausgeführt wird. Wenn nur wenige Brunnen verwendet werden, kann die Zellklebstofflösung entsprechend verkleinert werden. Der im Test verwendete Zellklebstoff ist eine formulierte Proteinlösung, die aus der Meeresmuschel extrahiert wird. Alternativ können Mikroplattenbohrungen auch mit 20 l poly-D-Lysin mit 100 g/ml beschichtet werden.
   3. Inkubieren Sie die Platte in einem 37 °C, Nicht-CO2 2-Inkubator für eine Stunde.
   4. In einer sterilen Umgebung, Aspirieren Zellklebstofflösung von der Platte. Waschen Sie jeden Brunnen zweimal mit 400 l 37 °C sterilem Wasser mit einer Mehrkanalpipette. Trocknen lassen.
   5. Nach 30-40 Minuten die Platte abdecken und über Nacht bei 4 °C lagern.
2. Hydration der Sensorpatrone
   1. Öffnen Sie in einer sterilen Umgebung das Sensorkassettenpaket (Materialtabelle) und entfernen Sie den Inhalt. Stellen Sie die Sensorpatrone kopfüber neben die Gebrauchsschild.
   2. Füllen Sie jeden Brunnen der Versorgungsplatte mit 200 l sterilem Wasser und senken Sie die Sensorpatrone wieder in die Versorgungsplatte. Legen Sie montierte Sensorpatrone und Nutzplatte über Nacht in einen 37 °C, nicht CO2-Inkubator.
3. Vorbereitung von Calibrant
   1. Aliquot 25 ml Kalibrant (Materialtabelle) in ein 50 ml konisches Rohr. Rohr über Nacht in einen 37 °C, nicht-CO2 2-Inkubator legen.

2. Protokoll zur Medienvorbereitung, Beladung von Inselchen und Beladung der Sensorpatrone am Tag des Assays

1. Vorbereitung von Medien
   1. Auf 48,5 ml Basismedien (minimal DMEM, siehe Materialtabelle)500 l von je 1 mM Natriumpyruvat und 2 mM Glutamin hinzufügen. Zusätzlich 496 l mit 200 mg/ml Glukose hinzufügen (die Endkonzentration von Glukose in den Medien beträgt 5,5 mM).
      ANMERKUNG: Die Glukosebasiskonzentration wurde für diese Experimente konstant gehalten. Jedoch, Glukose kann auch verwendet werden, um die Atmung zusätzlich zu den pharmakologischen Manipulationen beschrieben Schlag¹⁰zu stimulieren.
   2. Bestätigen Sie, dass der pH-Wert 7,4 +/- 0,1 beträgt und bei Bedarf angepasst wird.
2. Vorbereitung der Sensorpatrone
   1. Nehmen Sie die Sensorpatrone aus dem Inkubator, entfernen Sie den Deckel der Sensorpatrone und werfen Sie Wasser aus Brunnen aus. Legen Sie 200 ml vorgewärmten Kalibrant in jeden Brunnen und ersetzen Sie den Deckel der Sensorpatrone.
   2. Stellen Sie die Sensorpatrone für ca. 1 Stunde (bis erforderlich) wieder in den Inkubator ein.
3. Zubereitung von Medikamenten für mitochondrialen Stresstest
   1. Öffnen Sie das Stresstestkit (Materialtabelle) und entfernen Sie den Inhalt. Bestands- und Arbeitslösungen für Oligomycin, Carbonylcyanid-4-(Trifluormethoxy)phenylhydrazone (FCCP) und Rotenon/Antimycin A (AA) wie folgt.
      1. Oligomycin: Fügen Sie 630 l montierte Medien in die Röhre ein, um 100 -M-Lager zu bilden. Dann mit Medien auf 45 m verdünnen, um eine Portkonzentration zu erhalten (endende Brunnenkonzentration nach der Injektion beträgt 4,5 m)
      2. FCCP: Fügen Sie 720 l montierte Medien zu Tube hinzu, um 100 -M-Lager zu machen. Verdünnung auf 10 m mit Medien, um eine Portkonzentration zu erhalten (Endbrunnenkonzentration beträgt 1 m)
         HINWEIS: BSA und/oder FBS sollten nicht zu Medien hinzugefügt werden, da dies die Wirkung von mitochondrialen Entkopplern beeinflussen kann¹⁴.
      3. Rotenone/AA: Fügen Sie 540 l montierte Medien in die Röhre ein, um 50 -M-Lager zu bilden. Verdünnung auf 25 m mit Medien, um eine Portkonzentration zu erhalten (Endbrunnenkonzentration beträgt 2,5 m)
         ANMERKUNG: Die oben genannten Konzentrationen haben zu konsistenten Ergebnissen in unseren Händen geführt. Zusätzliche FCCP führte zu keiner weiteren Erhöhung der Atmung. Allerdings müssen die Wirkstoffkonzentrationen je nach Inselgröße und insbesondere bei Inselchen verschiedener Arten oder Nicht-Inselspheroide angepasst werden. Zum Vergleich: Der durchschnittliche Durchmesser einer nichtmenschlichen Primaten-Islet beträgt etwa 150 m¹⁵.
4. Herstellung von Sphäroidplatte und Transfer von Inselchen
   1. Handpflücken Sie Pankreasinseln in eine 60 mm x 15 mm Zellkulturschale mit montierten Medien, um nahezu 100% Reinheit zu erhalten.
      HINWEIS:Inselchen sollten gerundet, mit einer klar definierten Peripherie erscheinen und dichter erscheinen als exokrine Gewebeverunreinigungen. Vermeiden Sie Inselchen, die beschädigt oder ausgefranst erscheinen. In diesem Experiment wurde die Inselgröße nicht direkt gemessen, obwohl wir versuchten, Für jeden Brunnen und jede Probe Inseln von ungefähr gleicher Größe zu pflücken.
   2. Laden Sie jede Bohrung mit Sphäroid-Mikroplatte mit 175 l montierten Medien mit einer Mehrkanalpipette.
   3. Mit einer P20-Pipette, die auf 15 l eingestellt ist, 15 Inselchen aus der Zellkulturschale aspirieren. Inselchen sollten in der Pipettenspitze mit bloßem Auge sichtbar sein.
   4. Um Inselchen auf sphäroide Mikroplatte zu übertragen, niedrigere Pipette Spitze auf den Boden des Brunnens, kaum heben, und langsam Pipette aus einem sehr kleinen Volumen (ca. 5 l). Vergewissern Sie sich, dass alle Inselchen die Pipettenspitze verlassen haben. Jeder Brunnen sollte 15 Inseln erhalten. Überprüfen Sie gelegentlich sphäroide Mikroplatte unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob sich die Inselchen an der Unterseite jedes Brunnens befinden, anstatt an den Seiten zu kleben.
      HINWEIS: Vermeiden Sie das Laden der Eckbrunnen mit Inselchen. Sauerstoff und pH-Fluss aus dem Kunststoff können während des Testes auftreten, und dies wird in den vier Eckbrunnen verschärft.
   5. Sobald alle Inselchen auf die Sphäroid-Mikroplatte übertragen wurden, inkubieren Sie die Mikroplatte in einem 37 °C, nicht-CO2-Inkubator, während Sie die folgenden Schritte ausführen.
5. Laden der Sensorpatrone und Ausführen des Assays
   1. Entfernen Sie die Sensorpatrone aus dem Inkubator. Ports A-C für jeden Brunnen müssen entweder mit Drogen oder Medien geladen werden. Brunnen mit Inselchen und die vier Eckbrunnen sollten mit Drogen beladen werden. Nicht-Eckbrunnen ohne Inselchen sollten mit Medien beladen werden. Port D kann leer gelassen werden. Lastanschluss A (oben links von jedem Sensor) mit 20 l Oligomycin oder Medien. Ladeanschluss B (oben rechts) mit 22 L FCCP oder Medien. Lastanschluss C (unten links) mit 25 L Rotenon/AA oder Medien.
   2. Programmieren Sie einen extrazellulären Flussanalysator-Assay für eine 30-minütige Baseline-Atmungsphase (5 Zyklen mit 3-Minuten-Mix, 3-Minuten-Messung), 42-minütige Oligomycin-Messperiode (7 Zyklen 3-Minuten-Mix, 3-Minuten-Messung), 30 Minuten FCCP (5 Zyklen 3-Minuten-Mix, 3-Minuten-Messung) und 30 Minuten Rotenone/AA (5 Zyklen 3-Minuten-Mischung, 3-Minuten-Messung).
   3. Führen Sie den Test aus und befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um den Sensor zu kalibrieren und die Mikroplatte einzulegen.

Ergebnisse

Um Inselchen in Mikroplatten zu laden, sollten 15 Inselchen in 15 l Medien angesaugt werden, wie in Abbildung 1Adargestellt. Inselchen werden sich natürlich innerhalb weniger Sekunden zur Unterseite der Pipettenspitze absetzen. Dann wird die Pipettenspitze auf den Boden des Brunnens abgesenkt. Die Spitze ist sehr leicht angehoben, und ein kleines Volumen (ca. 5 l) wird zusammen mit den Inselchen herausgepfetet. Diese Technik führt zu einer ...

Diskussion

Die Untersuchung des Sauerstoffverbrauchs der Insel wurde bisher durch die kugelförmige Form von Inselchen, deren mangelnde Haftung an Kulturoberflächen und die Anzahl der pro Brunnen benötigten Inselchen behindert. In diesem Protokoll unterstreichen wir die Wirksamkeit der 96-Well-Sphäroid-Mikroplatte zur Messung des Sauerstoffverbrauchs von Inselchen auf einer kleinen Anzahl von Inselchen und zeigen eine Technisch machbare und konsistente Technik zum Um- und Laden von Inselchen Ergebnisse.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style	Corning	430166
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	Corning	354240
Conical tube, 50 mL	Falcon	352070
Dextrose anhydrous	Fisher Scientific	BP350-1	For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered
Disposable reservoirs (sterile), 25 ML	Vistalab	3054-1033	for loading multichannel pipet
EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm	Foxx Life Sciences	371-3115-OEM
L-glutamine	Gibco	25030-081	200 mM (100x)
Multichannel pipette tips	ThermoFisher Scientific	94410810
Multichannel pipette, 15-1250 μL	ThermoFisher Scientific	4672100BT	Recommended
P20, P200, and P1000 pipettes	Eppendorf	2231000602
pH Probe	Hanna Instruments	HI2210-01
Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL	Olympus	24-404, 24-412, 24-430
Seahorse XF Base Media	Agilent	103334-100
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	S7800B	Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini	Agilent	102905-100	Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	BP328-500
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070	100 mM (100x)
Stereo Microscope	Olympus	SZX9
Syringe (sterile), 5 mL	BD	309603	For sterile filtration
Water (sterile)	Sigma	W3500-500mL