İnsan Dışı Primat Pankreatik Adacık Oksijen Tüketiminin Analizi

Özet

Bu protokol, insan dışı primat pankreas adacıklarında oksijen tüketiminin doğru ve tekrarlanabilir ölçümünü göstermektedir. Adacık yükleme teknikleri ve mikroplaka kaplama kültürlü küresel diğer türde solunum verimli ölçümü için bir çerçeve sağlar.

Özet

Ex vivo pankreas adacıkları gibi küresel hücre kümelerinde oksijen tüketiminin ölçümü tarihsel olarak zor olmuştur. Adacık oksijen tüketiminin ölçülmesini, küresel lerde oksijen tüketiminin ölçülmesi için tasarlanmış 96 kuyuluk bir mikroplaka ile gösteriyoruz. Bu tözde, küresel mikroplakalar bir hücre ve doku yapıştırıcısı ile önceki gün asanın la kaplıdır. Adacık bağlılığını sadece kuyunun dibine yapışmasını teşvik etmek için küçük hacimli yapışkan çözüm kullanıyoruz. Tsuruk gününde, 15 adacık, adacıkların optimum konumlandırılmasını ve oksijen tüketiminin doğru ölçülmesini sağlayan bir teknik kullanılarak doğrudan her kuyunun tabanına yüklenir. Mitokondriyal solunumun çeşitli yönleri, ATP'ye bağımlı solunum, maksimal solunum ve proton sızıntısı gibi insan dışı primat adacıklarında farmakolojik olarak incelenir. Bu yöntem, kuyu başına yalnızca az sayıda adacık kullanarak tutarlı, tekrarlanabilir sonuçlar sağlar. Teorik olarak benzer büyüklükteki kültürlere uygulanabilir.

Giriş

Normal kan şekeri düzeylerini korumak için, pankreas β hücre glikoz yükseklikleri algılamak ve buna göre insülin salgılar. İnsülin salgısının glikoz düzeyleri ile birleå mesi, glukoz metabolizması ve mitokondriyal oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP Ã1/4retimi ile doÄ rudan baÄ lantılı dÃ1/4Å Ã1/4rÃ1/4lÃ1/4yor. Böylece, mitokondri uyarıcı-salgı kaplin kritik bir rol oynamaktadır¹. Β-hücre mitokondriyal fonksiyonunun değerlendirilmesi, insülin salgısının bozulmasına yol açan kusurları ortaya çıkarabilir. Pankreas α hücreleri tarafından glukagon salgıları da yakından mitokondriyal fonksiyon²bağlıdır . Ölümsüzleştirilmiş adacık hücre hatları tahliller bazı türleri için yararlı kanıtlanmış olmasına rağmen, Bu hücrelerin fizyolojisi doğru tüm adacık fonksiyonu özetlemek değil, glukagon tarafından insülin salgılanması potentiation gösterildiği gibi^3,4 ve insülin tarafından glukagon salgılanması inhibisyonu^5,6 bozulmamış adacıklar. Bu, bütün, bozulmamış adacıklar kullanılarak oksijen tüketimini ölçme ihtiyacını göstermektedir.

Adacık hücre respirometrisinin ölçümü teknikleri zamanla, oksijene duyarlı floresan boyaların kullanımından^oksijen tüketimini doğrudan ölçen katı hal sensörlerine kadar gelişmiştir^8. Başlangıçta monolayer için tasarlanmış, yapışık hücreler, yaygın olarak kullanılan hücre kültürü plaka sistemleri pankreas adacıkları için etkisiz olduğu kanıtlanmıştır. Adacıklar doğal olarak kuyulara yapışmadığı için, kültürün çevresine itilmeye yatkındırlar ve bu da oksijen tüketiminin yanlış ölçülmesi ile sonuçlanır^9. Bu sorunla mücadele etmek için, adacıklar içerebilir merkezi bir depresyon ile özel 24-iyi plakalar geliştirilmiştir⁹. Ancak, 24-iyi plaka sistemi gerekli adacıkların çok sayıda (kuyu başına 50-80) ve aynı anda¹⁰test edilebilir koşulların sayısı ile sınırlıydı. Küresel lerde ekstrasellüler akı analizi için özel olarak tasarlanmış 96-iyi mikroplakalar son gelişme iyi¹⁰başına 20 veya daha az adacık ile adacık respirometri ölçümü sağlayan, bu engelleri aşmıştır.

Burada, japon makak(Macaca fuscata),insanlara benzer adacık biyolojisi ile bir hayvan modeli^11,12adacıklarda oksijen tüketimini ölçmek için bu sistemin kullanımını göstermek . Bu protokolde, her biri 15 makak adacık analiz edilir. Elimizde, 15 adacık lar iyi az adacıklar daha yüksek bazal oksijen tüketimi üretilen, sağlam aktivasyon ve farmakolojik manipülasyon yanıt olarak solunum baskı ile. Her kuyunun merkezinde adacıkların tutarlı bir şekilde yüklenmesi için etkili bir yöntem olan ve bu titreyi gerçekleştirirken karşılaşılan genel zorluklara hazırlanmak için gereken adımları vurguluyoruz.

Protokol

1. Tsanın Çalıştırılan Gün Mikroplaka ve Sensör Kartuşunun Hazırlanması

Adacıklar daha önce¹³açıklandığı gibi üç yaşındaki Japon makak izole edildi. Bu yöntem kadavra donörlerden insan adacıkları izole etmek için kullanılan çok benzer, ancak fareler farklıdır, hangi pankreata genellikle hayvan sedasyon altında ve organ kaldırma önce kollajenaz çözeltisi ile şişirilir. Adacık alımı Oregon Ulusal Primat Araştırma Merkezi (ONPRC) ve Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergelerine uygun olarak yapılmıştır ve ONPRC IACUC tarafından onaylanmıştır. ONPRC, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA) tarafından yürürlüğe konan Hayvan Refahı Yasası ve Yönetmelikleri ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak Laboratuvar Hayvanlarının İnsani Bakımı ve Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmeti Politikası'na uyar.

1. Spheroid Mikroplaka Hazırlanması
   1. 0,1 M sodyum bikarbonat çözeltisinin 3 mL'sini hazırlayın. Filtre çözeltisterilize. Biz 0.45 μm filtre(Malzeme Tablosu)kullandı.
   2. Hücre kültüründe, 200 μL hücre ve doku yapıştırıcısını(Malzeme Tablosu)0,1 M sodyum bikarbonat 2,8 mL'ye ekleyin. Daha sonra, 96-iyi spheroid mikroplaka(Malzeme Tablosu)her kuyunun altına bu çözeltinin 20 μL ekleyin. Hava kabarcıklarının pipet ucundan çıkarıldığından ve plakanın sadece alt kısmı nın kapalı olduğundan emin olun. Mikroplakanın kapasması, ilaç eklendiğinde ve tgörünüşe göre kuyuya karıştığında adacıkların kuyunun kenarlarına doğru hareket etmesini önler.
      NOT: Sadece, tazyik çalıştırıldığında adacıklar için kullanılacak kadar kuyu kaplamak gerekir. Yalnızca birkaç kuyu kullanılacaksa, hücre yapışkan çözeltisi uygun şekilde küçültülebilir. Elekta kullanılan hücre yapıştırıcısı deniz midyesinden elde edilen formüle edilmiş bir protein çözeltisitir. Alternatif olarak, mikroplaka kuyuları 20 μL 100 μg/mL poli-D-lizin ile kaplanabilir.
   3. Plakayı 37 °C'de, CO₂ olmayan bir kuluçka makinesinde bir saat kuluçkaya yatırın.
   4. Steril bir ortamda, plakadan aspir hücre yapıştırıcı çözeltisi. Çok kanallı bir boru kullanarak her kuyuyu 400 μL 37 °C steril su ile iki kez yıkayın. Kuru hava izin verin.
   5. 30-40 dakika sonra tabağı kapatın ve gece boyunca 4 °C'de saklayın.
2. Sensör Kartuşunun Hidrasyonu
   1. Steril bir ortamda, sensör kartuş paketini(Malzeme Tablosu)açın ve içeriğini çıkarın. Sensör kartuşu yardımcı plakanın yanına ters yerleştirin.
   2. Yardımcı plakanın her kuyusunu 200 μL steril suyla doldurun ve sensör kartuşunu yardımcı plakaya geri indirin. Monte edilmiş sensör kartuşu ve yardımcı plakayı bir gecede 37 °C'lik, CO₂ kuluçka makinesi olmayan bir yere yerleştirin.
3. Kalibran hazırlanması
   1. Aliquot 25 mL kalibran(Malzeme Tablosu)50 mL konik tüp içine. Tüpü bir gecede 37 °C'lik, CO₂ kuluçka makinesi olmayan bir yere yerleştirin.

2. Basım, Adacıkların Yüklenmesi ve Sensör Kartuşunun Tofaş Günü Nezaman Yüklenmesi Protokolü

1. Medyanın hazırlanması
   1. 48,5 mL baz ortama (minimal DMEM, bkz. Malzeme Tablosu),her biri 1 mM sodyum pirüuvat ve 2 mM glutamin olmak üzere 500 μL ekleyin. Ayrıca, 200 mg/ml glukozun 496 μL'sini ekleyin (ortamdaki son glikoz konsantrasyonu 5,5 mM'dir).
      NOT: Bu deneylerde temel glikoz konsantrasyonu sabit tutulmuştur. Ancak, glikoz da darbe açıklanan farmakolojik manipülasyonlar ek olarak solunum uyarmak için kullanılabilir¹⁰.
   2. PH'ın 7,4 +/- 0,1 olduğunu ve gerekirse ayarladığını doğrulayın.
2. Sensör kartuşunun hazırlanması
   1. Sensör kartuşu kuvözden çıkarın, sensör kartuş kapağını çıkarın ve kuyulardan su boşaltın. Her kuyuya 200 mL önceden ısıtılmış kalibrant yerleştirin ve sensör kartuş kapağını değiştirin.
   2. Sensör kartuşunu yaklaşık 1 saat (gerekli olana kadar) kuvöze geri yerleştirin.
3. Mitokondriyal stres tayı için ilaç hazırlanması
   1. Stres test kitini(Malzeme Tablosu)açın ve içeriğini çıkarın. Oligomisin, Carbonyl siyanür-4-(trifluoromethoxy)fenilhidrat (FCCP) ve Rotenone/Antimycin A (AA) için stok ve çalışma çözümleri yapın.
      1. Oligomisin: 100 μM stok yapmak için tüp e monte edilmiş ortam 630 μL ekleyin. Daha sonra, bağlantı noktası konsantrasyonu elde etmek için ortam ile 45 μM seyreltin (enjeksiyondan sonra son kuyu konsantrasyonu 4,5 μM olacaktır)
      2. FCCP: 100 μM stok yapmak için tüpe 720 μL monte edilmiş ortam ekleyin. Liman konsantrasyonu elde etmek için ortamla 10 μM'ye seyreltin (son kuyu konsantrasyonu 1 μM olacaktır)
         NOT: BSA ve/veya FBS ortama eklenmemelidir, çünkü bu mitokondriyal uncouplers^14'ünetkisini etkileyebilir.
      3. Rotenone/AA: 50 μM stok yapmak için tüpe 540 μL monte edilmiş ortam ekleyin. Liman konsantrasyonu elde etmek için ortamla 25 μM'ye seyreltin (son kuyu konsantrasyonu 2,5 μM olacaktır)
         NOT: Yukarıdaki konsantrasyonlar ellerimizde tutarlı sonuçlar vermiştir. Ek FCCP solunum daha fazla artışa yol açtı. Ancak, ilaç konsantrasyonlarının adacık boyutuna ve özellikle farklı türlerden veya adacık olmayan adacıklardan adacıklara bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Referans olarak, insan olmayan bir primat adacık ortalama çapı yaklaşık 150 μm¹⁵olduğunu.
4. Küresel plakanın hazırlanması ve adacıkların transferi
   1. El-pick pankreas adacıkları 60 mm x 15 mm hücre kültürü çanak içine monte medya içeren içine yakın% 100 saflık elde etmek için.
      NOT: Adacıklar, açıkça tanımlanmış bir çevre ile yuvarlak ve eknotrin doku kirleticiler daha yoğun görünür görünmelidir. Hasarlı veya yıpranmış görünen adacıklardan kaçının. Bu deneyde, adacık boyutu doğrudan ölçülmedi, ancak her kuyu ve numune için yaklaşık eşdeğer büyüklüktea sahip adacıkları seçmeye çalıştık.
   2. Çok kanallı pipet kullanarak 175 μL monte edilmiş ortamla her bir küresel mikroplaka kuyusu yükleyin.
   3. 15 μL'ye ayarlanmış bir P20 pipetkullanarak hücre kültürü çanaktan 15 adacık aspire edin. Adacıklar pipet ucunda çıplak gözle görülmelidir.
   4. Adacıkları küresel mikroplakaya aktarmak için, kuyunun dibine daha düşük pipet ucu, zar zor yukarı kaldırın ve çok küçük bir hacimde (~5 μL) yavaşça pipet çıkar. Tüm adacıkların pipet ucunu bıraktığını doğrulayın. Her kuyuya 15 adacık verilmelidir. Ara sıra, adacıkların yanlara yapışmak yerine her kuyunun altında olduğunu doğrulamak için mikroskop altında küresel mikroplakayı kontrol edin.
      NOT: Köşe kuyularını adacıklarla yüklemekten kaçının. Plastikten oksijen ve pH akışı teşrin sırasında oluşabilir ve bu dört köşe kuyularında şiddetlenir.
   5. Tüm adacıklar küresel mikroplakaya aktarıldıktan sonra, aşağıdaki adımları tamamlarken mikro plakayı 37 °C'lik, CO₂ olmayan bir kuluçka makinesine yerleştirin.
5. Sensör kartuşunun yüklenmesi ve titrenin çalıştırılması
   1. Sensör kartuşu'nu kuvözden çıkarın. Her kuyu için A-C bağlantı noktaları uyuşturucu veya medya ile doldurulmalıdır. Adacıklar ve dört köşe kuyusu içeren kuyular ilaçla doldurulmalıdır. Adacıksız köşe li kuyular ortam la doldurulmalıdır. Port D boş bırakılabilir. 20 μL oligomisin veya ortam içeren A (her sensörün sol üst tesli) bağlantı noktasını yükleyin. 22 μL FCCP veya ortamiçeren B bağlantı noktasını (sağ üstte) yükleyin. 25 μL Rotenone/AA veya ortam içeren C (sol altta) bağlantı noktasını yükleyin.
   2. Program bir hücre dışı akı analizörü 30 dakikalık temel solunum süresi (3 dakika karışımı 5 döngüleri, 3 dakika ölçmek), 42 dakikalık oligomisin ölçüm dönemi (3 dakika karışımı 7 döngüleri, 3 dakika ölçmek), 30 dakika FCCP (3 dakika karışımı 5 döngüleri, 3 dakika ölçmek) ve 30 dakika Rotenone / AA (3 mix dakika, 3 dakika ölçüm 5 döngüsü).
   3. Sensörü kalibre etmek ve mikro plakayı takmak için testi çalıştırın ve ekrandaki talimatları izleyin.

Sonuçlar

Adacıkları mikro plakaya yüklemek için Şekil 1A'dagösterildiği gibi 15 adacık 15°L ortama aspire edilmelidir. Adacıklar doğal olarak birkaç saniye içinde pipet ucunun dibine doğru yerleşirler. Daha sonra, pipet ucu kuyunun altına indirilir. Ucu çok hafifçe kaldırılır ve küçük bir hacim (yaklaşık 5 μL) adacıklar ile birlikte dışarı borulu. Bu teknik, adacık ların mikroplaka nın alt kısmında tutarlı bir şek...

Tartışmalar

Adacık oksijen tüketimi çalışma daha önce adacıkların küresel şekli, kültür yüzeylerine bağlılık eksikliği ve iyi başına gerekli adacık sayısı tarafından engel olmuştur. Bu protokolde, 96 kuyulu küresel mikroplakanın az sayıda adacık üzerinde adacık oksijen tüketimini ölçmek için etkinliğini vurgulamakta ve teknik olarak uygun ve tutarlı hale gelen adacıkların taşınması ve yüklenmesi için bir teknik göstermekteyiz. Sonuç -ları.

Adacıkların mikrop...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style	Corning	430166
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	Corning	354240
Conical tube, 50 mL	Falcon	352070
Dextrose anhydrous	Fisher Scientific	BP350-1	For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered
Disposable reservoirs (sterile), 25 ML	Vistalab	3054-1033	for loading multichannel pipet
EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm	Foxx Life Sciences	371-3115-OEM
L-glutamine	Gibco	25030-081	200 mM (100x)
Multichannel pipette tips	ThermoFisher Scientific	94410810
Multichannel pipette, 15-1250 μL	ThermoFisher Scientific	4672100BT	Recommended
P20, P200, and P1000 pipettes	Eppendorf	2231000602
pH Probe	Hanna Instruments	HI2210-01
Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL	Olympus	24-404, 24-412, 24-430
Seahorse XF Base Media	Agilent	103334-100
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	S7800B	Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini	Agilent	102905-100	Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	BP328-500
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070	100 mM (100x)
Stereo Microscope	Olympus	SZX9
Syringe (sterile), 5 mL	BD	309603	For sterile filtration
Water (sterile)	Sigma	W3500-500mL