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要約

凍結組織に対してマルチスペクトルイメージングを行う迅速な染色法について述べます。

要約

ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織上のマルチスペクトル蛍光イメージングは、抗原共発現およびマーカーの空間分布に関する情報を提供できる単一の組織サンプル内の複数のマーカーの検出を可能にする。しかしながら、ホルマリン固定組織に対する適切な抗体の欠如は、検出できるマーカーの性質を制限する可能性がある。また、染色方法は時間がかかります。ここでは、凍結組織に対してマルチスペクトル蛍光イメージングを行う迅速な方法について説明する。この方法には、使用されるフルオロフォアの組み合わせ、マウスおよびヒト凍結組織の染色に関する詳細なステップ、およびスキャン、取得、および分析手順が含まれる。染色解析には、市販の半自動マルチスペクトル蛍光イメージングシステムが使用されている。この方法を通じて、1つの凍結組織セクションで最大6つの異なるマーカーが染色され、検出された。機械学習解析ソフトウェアは、定量分析に使用できる表現型細胞を使用できます。ここで説明する凍結組織の方法は、FFPE組織では検出できないマーカーや、FFPE組織に対して抗体が利用できないマーカーの検出に有用である。

概要

顕微鏡イメージング技術の最近の進歩は、生物学的プロセスおよび疾患状態に関する我々の知識と理解を大幅に向上させました。染色原性免疫組織化学(IHC)を介した組織中のタンパク質のインサイチュ検出は、病理において日常的に行われている。しかし、発泡IHC染色を用いた複数のマーカーの検出は、1つ以上の新しい方法で多重免疫蛍光(mIF)染色法を用い、複数の生物学的マーカーが単一の組織サンプル上に標識され、開発されている。複数の生体マーカーの検出は、組織アーキテクチャ、細胞の空間分布、および抗原共発現に関する情報がすべて単一の組織試料2に捕捉されるため有用である。マルチスペクトル蛍光イメージング技術を用いることが、複数の生物学的マーカーの検出を可能にしました。この技術では、個々の蛍光色素の蛍光スペクトルを個別の蛍光スペクトルに特異的な光学を用いて、分離したり「混合しない」と、スペクトルクロストーク3を一切起らなく複数のマーカーを検出することを可能にする。マルチスペクトル蛍光イメージングは、細胞生物学、前臨床薬の開発、臨床病理学、および腫瘍免疫プロファイリング44、5、65,6において重要なアプローチになりつつある。重要なことに、免疫細胞(具体的にはCD8 T細胞)の容量分布は、既存の腫瘍7を有する患者の予後因子として機能し得る。

多重蛍光染色に対する様々なアプローチが開発されており、同時または順次に行うことができます。同時染色法では、すべての抗体をカクテルとして一回のステップで添加し、組織にラベルを付けます。UltraPlex技術は、ハプテン共役一次抗体のカクテルに続いて、フルオロフォア共役抗ハプテン二次抗体のカクテルを使用します。InSituPlex技術8は、組織に同時に付加されるユニークなDNA共役一次抗体のカクテルを使用し、その後に増幅ステップを行い、最後に一次抗体上の各固有DNA配列を補完するフルオロフォア共役プローブを用いる。これらの技術は、4つのマーカーに加えて、核染色のための4',6-diamino-2-フェニリンドール(DAPI)を検出することを可能にする。同時多重染色のための他の2つのアプローチは、二次イオン質量分析9に基づいています。Hyperion Imaging システムは、イメージング質量サイトメトリー10を使用して、最大 37 個のマーカーを検出します。この技術は、組織を染色するために金属共役抗体のカクテルを使用し、組織の特定の領域はレーザーによってアブレートされ、金属イオンが検出される質量サイトメーターに移されます。もう一つの同様の技術は、多重化イオンビームイメージング技術11を使用するIONPathです。この技術は、金属共役抗体をアブラクトするためにレーザーの代わりに、変性質量分析計装置と酸素イオン源を使用します。これらすべての同時多重染色法により、複数のマーカーの検出が可能になりますが、DNA、ハプテン、または金属を抗体に結合するためのコスト、アブレーションによる組織の喪失、および混合解除のための広範な画像処理を過小評価することはできません。さらに、キットおよび染色の議定書はFFPEティッシュのために現在だけ利用でき、カスタムパネルを開発することは付加的な時間および支出を伴う。

シーケンシャル多重染色法には、対照的に、抗体を用いた組織を1つのマーカーに標識し、除去して抗体を除去し、続いてこのプロセスの逐次反復を行い、複数のマーカー12を標識する。このチラミド信号増幅(TSA)は、最も頻繁に使用される逐次多重化法である。他の2つの多重化技術は、同時染色法と逐次染色法の組み合わせを使用します。CODEXプラットフォーム13は、インデックス化された重合ステップを使用して最終的にフルオロフォアで標識されるユニークなDNAオリゴヌクレオチド配列に結合した抗体のカクテルを採用し、その後、最大50個のマーカーを検出するプロセスを繰り返します。MultiOmyx多重染色アプローチ14は、3〜4個のフルオロフォア共役抗体のカクテルで染色し、イメージング、蛍光ホルを焼入れ、このサイクルを繰り返して単一のセクションで最大60個のマーカーを検出する反復である。同時多重染色法と同様に、広範囲のマーカーを検出できる一方で、染色、画像取得、処理、および分析に関わる時間は広範囲に及ぶ。ストリッピング/クエンチングステップは、組織サンプルの加熱および/または漂白を伴い、加熱または漂白時に組織の完全性を維持するFFPE組織に対してシーケンシャルな多重染色アプローチが一般的に行われます。

ホルマリン固定およびそれに続くパラフィン埋め込みは臨床現場で容易に行われ、組織ブロックは保存しやすく、複数の多重染色プロトコルが利用可能である。しかしながら、FFPE組織の処理、埋め込み、および脱パラフィン化、ならびに抗原検索15は、抗体がエピトープに良好にアクセスできるプロセスに、時間がかかる。さらに、FFPE組織に関与する処理は、自己蛍光16およびマスク標的エピトープに寄与し、FFPE組織17、18、1918,19における抗原を検出するために利用可能な抗体クローンのばら17つきおよび欠如をもたらす。例としては、ヒト白血球抗原(HLA)クラスIアレル20である。対照的に、組織のスナップ凍結は、固定前または後に広範な処理ステップを伴わない、抗原検索21、22の必要性を回避し、22より広い範囲の標的を検出するのに有益である。したがって、マルチスペクトル蛍光イメージングに凍結組織を用い、前臨床および臨床研究の標的を検出する価値がある。

FFPE組織を用いた上述の制限を踏まえると、冷凍組織に対してマルチスペクトル蛍光イメージングを行うことができるかどうか尋ねた。この問題に対処するため、複数の抗原を検出するフルオロフォア共役抗体のパネルを用いて同時多重染色法を試験し、半自動マルチスペクトルイメージングシステムを用いて染色を解析した。90分以内に1つの組織セクションで最大6つのマーカーを同時に染色することができました。

プロトコル

マウス脾臓およびHLF16マウス腫瘍組織23は、当研究室から得られた。ヒト扁桃組織は、市販業者から購入した。詳細については、資料一覧を参照してください。

1. 組織埋め込み

  1. 新しい組織をOCT(最適な切断温度)溶液に埋め込み、ドライアイスまたは液体窒素を使用して凍結します。
  2. 組織を-80°Cで保存する。

2. クライオセクション

  1. クライオスタットで8μmのセクションをカットし、温度を-25 °Cに設定します。
    注:推奨断面の厚さは、より鮮明な画像を生成するように調整することができます。
  2. 帯電ガラススライドにセクションを配置します。
  3. 10分間、占星術グレードの氷冷アセトンを固定する前に、室温(RT)で1時間の部分を空気乾燥させます。
    注:アセトンは水溶性タンパク質の凝固を引き起こし、脂質を抽出しますが、炭水化物含有成分には影響しません。対照的に、ホルマリンはほとんどの脂質を保存し、炭水化物24にほとんど影響を与えない。固定性の選択は、検出されるマーカーの選択に応じて重要です。
  4. スライドは-20°Cで保管してください。

3. 抗体および蛍光体の選択

注:組織染色の前に、アセトン固定組織からのシーケンシャル切片内で目的の抗原を強固かつ特異的に染色する抗体クローンを検証する必要があります。一部の抗体は、異なる固定性を必要とし、パネル内の他の抗体との相溶性も経験的に決定する必要があります。目標はまた、DAPI、FITC、Cy3、テキサスレッド、およびCy5の蛍光フィルターで検出できる最小限の重複を有する蛍光性を同定することです。

  1. 既知の発現標的抗原を有する組織切片における従来のIHCまたは免疫蛍光(IF)検出による染色を確認する。
  2. 半自動画像化システムで利用可能な励起および発光フィルタセットを用いて、フルオロフォア共役一次抗体の様々な組み合わせをテストした後、最小限のスペクトルオーバーラップを有するフルオロフォアを調製する(例えば、表1参照)。

4. 染色

注:組織の水分補給およびスライドのすきは、コプリン瓶で行った。ブロッキングおよび抗体インキュベーションステップを加湿スライドボックスで行った。

  1. スライドを 5 ~ 10 分間 RT に暖かくします。
  2. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で5分間水分補給を行った。
  3. 抗体で組織を染色する前にブロッキングステップを行います。マウスセクションでは、RTで10分間、特殊なブロッキングソリューション(「材料表」を参照)を使用します。ヒト切片の場合、RTで15分間PBSで希釈した正常なプールされたヒト血清(NHS)を10%使用してください。
    注:使用する後続手順に応じてセクションの特定のプロパティを保持するために、必要に応じてさまざまなブロッキング バッファをテストできます。
  4. ブロック後にPBSで5分間スライドを洗います。
  5. 多重染色の場合は、所定の最適な希釈液で相性の高いフルオロフォアを有する抗体のカクテルを調製してください。
  6. スライドにフルオロフォア共役抗体のカクテルを加えます。シングルマーカー染色の場合は、一次結合抗体のみをスライドに追加します。
  7. 一次結合抗体を添加することなく同じ染色手順を経る対照未染色スライドを含む。
  8. 暗闇の中でRTでスライドを1時間インキュベートし、スライド2倍をPBSでそれぞれ5分間洗浄します。ここから、得られたスライドはマルチプレックス染色と呼ばれる。
  9. 対抗するには、DAPIをマルチプレックス染色スライドに加え、RTで暗闇の中で7分間インキュベートし、スライド2xをPBSでそれぞれ5分間洗浄します。単染色および未染色スライドに対抗しないでください。
  10. カバースリップするには、取り付け媒体の一滴を加え、ガラスカバースリップを組織の上にそっと置きます。

5. スペクトルライブラリの準備

  1. 画像取得
    1. ランプの電源を100%に設定します。FFPE組織の蛍光検出にはシグナル増幅ステップが含まれるため、通常電力は10%に設定される。
    2. 顕微鏡の操作ソフトウェアを開くことから始めます(材料表を参照)。
    3. [プロトコルの編集] を選択し、[新しいプロトコル] をクリックします。
    4. 「プロトコル名」を入力し、イメージングモードで蛍光を選択し、「研究名」を入力します。
    5. 単染色スライドをステージ上に置き、対応する蛍光チャネルの各マーカーを調べて染色を確実にします。マーカーの最も強い信号を表現する組織上の領域を選択します。
    6. [自動焦点]オプションと[自動公開]オプションを使用して、露出時間を調整します。
    7. 単染色および未染色スライドのスナップショットを取得し、プロトコルを保存します。
      注:以下の手順は、機械学習ソフトウェア(材料表を参照)で、単一の染色スライドと未染色スライドを使用して特定の染色を検証し、抗体クロストークを決定します。
    8. ソフトウェアの [ライブラリの作成]タブで、1 つのスライド イメージを読み込み、適切な Fluor を選択して 、[抽出] をクリックします。ソフトウェアは自動的に蛍光で選ばれた蛍光シグナルを抽出します。
    9. 抽出した色を保存するには、[保存 ]をクリックします。「新しいグループ」を作成するか、抽出した色を既存のグループに保存できます。
  2. スペクトルライブラリの検証
    1. 抽出した画像の右側にある、各フィルタセットの発光スペクトルカーブウィンドウを確認します。
      注:蛍光色素が検出されたフィルターセット内でのみスペクトル曲線が観測された場合、抽出された信号は正しい。スペクトル曲線が間違ったフィルタセットで観測された場合、フィルタセットで想定される1次信号が十分に強くないか、スペクトルの重なりが原因でソフトウェアが高すぎる別の信号を検出している可能性があります。この場合は、まず描画処理領域ツールを使用して、画像内の蛍光マーカーと自己蛍光を表現する領域の周りに領域を描画してみてください。これは、真の信号を検出し、任意の干渉信号を削除するソフトウェアを訓練します。これがうまくいかない場合は、単染色スライドの染色プロセスを繰り返して、異なる抗体滴定をテストします。

6. マルチスペクトルイメージング

注:スペクトルライブラリを作成して検証したら、マルチプレックス染色スライドに対して次の手順を実行します。

  1. スライド全体のスキャン
    1. セクション 5.1 で説明されているように、マルチプレックス染色スライドのフォーカスと露出時間を調整します。
    2. [スキャン スライド] で新しいタスクを作成し、上記で保存したプロトコルを選択します。
    3. マルチプレックススライドでスライド全体のスキャンを実行します。
    4. スライド スキャン ソフトウェア全体を使用して、スライド スキャン イメージ全体を開きます。この画像はスペクトル的に混合されていません。
    5. スタンプまたは ROI ツールを使用して、スライド スキャン イメージ全体で対象地域(ROI)を選択します。これらのROIは、6.1.1で設定された露光時間を使用してスキャンされ、スペクトルの非混合および分析に使用されます。
    6. [スライドの処理]をクリックして、20倍の倍率でROIsを取得します。
  2. スペクトルアンミックス
    1. ROI を取得したら、機械学習ソフトウェアの [手動分析] タブで、[ファイル] の下の [開く] をクリックして、マルチプレックス染色された画像を読み込みます。
    2. [スペクトル ライブラリ ソース] ドロップダウン メニューで、[蛍光素の選択] をクリックします。
    3. 新しいウィンドウが開きます。ここで、上記で作成したスペクトルライブラリまたはグループを選択します。
    4. 未染色のスライド イメージを読み込みます。選択したスペクトルライブラリの上にあるAFインクマーカーアイコンをクリックし、未染色スライド上に線または領域を描いて、組織の自己蛍光を識別します。
    5. [マーカーと色の編集] タブで、各マーカーの名前を割り当てます。この手順では、擬似色を割り当てることができます。
      注:自己蛍光画像の色は、デフォルトで DarkSlateGray になります。これを [黒] に変更します。
    6. [すべて準備]をクリックします。
  3. スペクトルの非混合画像の検証
    注:    スペクトルのアンミックス手順が完了すると、すべての色からなる合成画像が作成されます。
    1. [ビューの編集]アイコンをクリックします。ここでは、「コンポーネント表示」の各色をオフまたはオンにして、個々のマーカーの染色を確認することができます。
    2. 細胞の染色と形態を視覚的に調べて、生物学的に関連しない限り、マーカーの重複がないことを確認します。病理学者は、染色の検証にも役立ちます。
      注:多重化されたスライドの染色は、一度に1つのフルオロフォアを取り出し、染色パターンを見直すことによって検証されるべきである。さらに、この検証は、抗体クロストークやブリードスルーにより隣接スペクトルに現れる強い蛍光体を同定するのにも役立ちます。
    3. 各蛍光マーカーの明視野画像をシミュレートする「病理学ビュー」の場合は、「コンポーネントイメージを選択」ボタンをクリックします。ここでは、シミュレートされた明視野画像を表示するマーカーを選択します。

7. 細胞のセグメンテーションとフェノタイピングによるマルチスペクトル画像の解析

注:スペクトル的に混合されていない画像を検証した後、機械学習ソフトウェアを使用して細胞のセグメンテーションを行い、ステップバイステップの指示を提供します。ここでは組織の分節は行われなかった。パネルが1つ以上の組織特異的マーカーを含み、特に組織が乱雑な場合は、組織のセグメンテーションを行う必要があります。

  1. [セグメント] オプションの下にある [細胞質] と [膜] を選択します。
    注 :既定では、"Nuclei"が選択されています。
  2. パネルからマーカーを選択します。核、細胞質、または膜のいずれかを検出するようにマーカーを構成します。例えば、膜の核およびCD3を検出するためにDAPIを選択することができる。
  3. 省略記号ボタン ('...') をクリックして、 "このシグナルを使用して" を検索する ] の下のオプションを選択します。たとえば、DAPI の '核' です。パネルから複数のマーカーをセグメンテーション用に選択できます。
    注:細胞質マーカーまたは膜マーカーの場合は、「この信号を使用して核セグメンテーションを支援する」オプションを選択します。
  4. ソフトウェアは自動的に検出し、画像内の核、細胞質、および膜のマスクを作成します。
  5. セグメンテーションのためにすべてのセルが「マスク」されていることを確認します。調整するには、7.3で選択した特定のマーカーの「病理ビュー」に切り替えます。をクリックし、ソフトウェアの設定オプションを使用します。
  6. [すべてセグメント ]をクリックしてセルをセグメント化します。
  7. 細胞のセグメンテーションの後、細胞のフェノタイピングを進めます。このステップでは、フェノタイピングに必要なマーカーを選択し、選択したマーカーで明るく染色されたセルを少なくとも 5 つ選択します。これにより、ソフトウェアが自動的に画像内の選択したマーカーで染色されたすべてのセルを検出するようにトレーニングされます。
  8. 表現型マップが作成されます。解析して、マーカーで染色されたセルが正しくフェノタイプされていることを確認します。
    注:細胞のフェノタイピングは反復プロセスになり得る。ソフトウェアが細胞を正しく表現できない場合は、トレーニングが不十分または間違っていることを意味します。この場合、ユーザーは手動でセルを選択し、ソフトウェアを再トレーニングし、ユーザーがトレーニングに満足するまでこの手順を繰り返す必要があります。
  9. "その他" という名前のグループを作成し、どのマーカーにも染色されないセルを含めます。
    注:このステップは、ソフトウェアをトレーニングして、染色されていない細胞をすべて、フェノタイピングから除外するために重要です。

8. 画像と分析テーブルのエクスポート

  1. [エクスポート]ボタンをクリックして、[エクスポート設定]パネルを表示します。
  2. [エクスポート ディレクトリ] で[参照]をクリックして、イメージをエクスポートする場所を選択します。
  3. [イメージのエクスポート オプション] で、[イメージ出力形式] を選択します。
  4. [エクスポートするイメージ] の一覧で、エクスポートするイメージを選択します。「合成画像」は、最終的な擬似色の未混合画像です。「病理ビュー」は、個々のシミュレートされた明視野画像であり、「コンポーネント画像(マルチ画像TIFF)」は、サードパーティの分析ソフトウェアで使用できるコンポーネントデータのマルチ画像TIFFファイルです。
  5. [すべてエクスポート] ボタンをクリックして、イメージをエクスポートします。
    注:このステップで、分析のテーブルを選択してエクスポートすることもできます。

結果

凍結した脾臓セクション上の単染色マーカーの検出
半自動撮像システムは、より広い範囲の波長検出25を可能にする液晶調整フィルター(LCTF)システムを使用し、ここで信号増幅ステップが行われなかったため、まず顕微鏡上の各マーカーに対して一次共役抗体の検出を最適化しました。図1に示す例を示し、各単色マーカーは疑似色の赤?...

ディスカッション

凍結組織は、従来から直接的および間接的な方法32を用いて組織上の3〜4個のマーカー31を検出するmIFイメージングに広く使用されてきた。直接法では、抗体は組織を標識するために蛍光色素または量子ドット33に結合し、一方、間接的な方法では、組織に対して一次抗体を特異的に認識するフルオロフォア共役二次抗体が続く組織を標識?...

開示事項

著者らは開示する利益相反を持っていません。

謝辞

イメージングと分析のガイダンスは、イリノイ大学シカゴ校の研究資料研究センター、研究組織イメージングコアによって提供され、研究担当副首相の事務所の支援を受けて設立されました。この研究は、NIH/NCI RO1CA191317からCLP、NIH/NIAMS(SBDRCはA.パラー博士に対して1P30AR075049-01)、ロバート・H・ルーリー総合がんセンターのノースウェスタン大学免疫療法評価コアの支援によって支えられた。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetone (histological grade)Fisher ScientificA16F-1GALFixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3BioLegend100212Clone - 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20ThermoFisher Scientific53-0202-82Clone - L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67BD Biosciences558617Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3BioLegend300446Clone - UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8aBioLegend100758Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8aBioLegend372906Clone - C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR)BioLegend141711Clone - C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 AntibodyBioLegend100426Clone - GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 MouseCharles River Laboratories27Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin JarSigma AldrichS6016-6EARehydrating and washing slides
DAPI SolutionBD Biosciences564907Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged SlidesDOT ScientificDW7590WAdhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg)Fisher ScientificMT21031CVWashing and diluent
Gold Seal Cover SlipsThermoFisher Scientific3306Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue blockAMSBioAMS6023Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1XGemini Bio-Products100-512Blocking and diluent for human tissues
inFormAkoya BiosciencesVersion 2.4.1Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4BioLegend300529Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11bBD Biosciences550993Clone - M1/70; primary conjugated antibody
PhenochartAkoya BiosciencesVersion 1.0.8Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade MountantThermoFisher ScientificP36965Mounting medium
Research CryostatLeica BiosystemsCM3050 SSectioning tissues
Superblock 1XThermoFisher Scientific37515Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T SolutionSakura Finetek4583Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 SlideAkoya BiosciencesCLS142568Semi-automated multispectral imaging system
Vectra SoftwareAkoya BiosciencesVersion 3.0.5Software to operate microscope

参考文献

  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  6. Wickenhauser, C., Pico de Coaña, Y., et al. . Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. , 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47 (2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479 (1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017 (2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03 (2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652 (2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338 (2019).

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