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Résumé

Nous décrivons une méthode de coloration rapide pour effectuer l’imagerie multispectrale sur les tissus congelés.

Résumé

L’imagerie multispectrale de fluorescence sur les tissus formalin-fixes de paraffine-embedded (FFPE) permet la détection de marqueurs multiples dans un seul échantillon de tissu qui peut fournir des informations sur la coexpression d’antigène et la distribution spatiale des marqueurs. Cependant, un manque d’anticorps appropriés pour les tissus formalin-fixes peut restreindre la nature des marqueurs qui peuvent être détectés. En outre, la méthode de coloration prend beaucoup de temps. Ici, nous décrivons une méthode rapide pour effectuer la formation image de fluorescence multispectrale sur les tissus congelés. La méthode comprend les combinaisons de fluorophore utilisées, des étapes détaillées pour la coloration des tissus congelés de souris et humains, et les procédures de numérisation, d’acquisition et d’analyse. Pour l’analyse des colorants, un système d’imagerie multispectral de fluorescence semi-automatique disponible dans le commerce est utilisé. Grâce à cette méthode, jusqu’à six marqueurs différents ont été tachés et détectés dans une seule section de tissu congelé. Le logiciel d’analyse de l’apprentissage automatique peut cellules phénotype qui peuvent être utilisés pour l’analyse quantitative. La méthode décrite ici pour les tissus congelés est utile pour la détection de marqueurs qui ne peuvent pas être détectés dans les tissus de la FFPE ou pour lesquels les anticorps ne sont pas disponibles pour les tissus FFPE.

Introduction

Les progrès récents dans les techniques d’imagerie microscopique ont considérablement amélioré nos connaissances et notre compréhension des processus biologiques et des états pathologiques. La détection in situ des protéines dans les tissus par immunohistochimie chromogénique (IHC) est régulièrement effectuée en pathologie. Cependant, la détection de marqueurs multiples utilisant la coloration chromogénique de LHC est difficile1 et de nouvelles méthodes pour employer des approches de coloration d’immunofluorescence multiplex (mIF), où plusieurs marqueurs biologiques sont étiquetés sur un seul échantillon de tissu, sont en cours de développement. La détection de marqueurs biologiques multiples est utile, parce que les informations liées à l’architecture des tissus, la distribution spatiale des cellules, et la co-expression des antigènes sont tous capturés dans un seul échantillon de tissu2. L’utilisation de la technologie d’imagerie par fluorescence multispectrale a rendu possible la détection de plusieurs marqueurs biologiques. Dans cette technologie, en utilisant des optiques spécifiques les spectres de fluorescence de chaque fluorophore individuel peuvent être séparés ou «non mélangés», permettant la détection de marqueurs multiples sans aucune traque spectrale3. L’imagerie multispectrielle de fluorescence devient une approche critique dans la biologie cellulaire, le développement préclinique de drogue, la pathologie clinique, et le profilage immunitaire de tumeur4,,5,6. Fait important, la distribution spaciale des cellules immunitaires (en particulier les lymphocytes T CD8) peut servir de facteur pronostique pour les patients atteints de tumeurs existantes7.

Diverses approches de coloration de fluorescence multiplex ont été développées et peuvent être effectuées simultanément ou séquentiellement. Dans la méthode de coloration simultanée, tous les anticorps sont ajoutés ensemble comme un cocktail en une seule étape pour étiqueter le tissu. La technologie UltraPlex utilise un cocktail d’anticorps primaires conjugués à l’hapten, suivi d’un cocktail d’anticorps secondaires anti-hapten conjugués au fluorophore. InSituPlex technology8 utilise un cocktail d’anticorps primaires conjugués à l’ADN uniques qui sont simultanément ajoutés au tissu suivis d’une étape d’amplification et enfin de sondes épurées au fluorophore qui sont complémentaires à chaque séquence d’ADN unique sur l’anticorps primaire. Ces deux technologies permettent la détection de quatre marqueurs plus 4',6-diamino-2-phenylindole (DAPI) pour la coloration nucléaire. Deux autres approches pour la coloration simultanée de multiplex sont basées sur la spectrométrie secondaire de masse d’ion9. Le système d’imagerie Hyperion utilise la cytométrie de massed’imagerie 10 pour détecter jusqu’à 37 marqueurs. Cette technologie utilise un cocktail d’anticorps conjugués au métal pour tacher les tissus, et des zones spécifiques des tissus sont ablés par un laser et transférées à un cytomètre de masse où les ions métalliques sont détectés. Une autre technologie similaire est l’IONPath, qui utilise la technologie d’imagerie à faisceau d’ions multiplexed11. Cette technologie utilise un instrument de spectrométrie de masse modifié et une source d’ions d’oxygène au lieu d’un laser pour abler les anticorps conjugués au métal. Bien que toutes ces approches simultanées de coloration multiplexe permettent la détection de marqueurs multiples, les coûts impliqués pour conjuguer l’ADN, les haptens ou les métaux aux anticorps, la perte de tissu due à l’ablation, et le traitement d’image étendu pour le semage ne peut pas être sous-estimé. En outre, les kits et les protocoles de coloration ne sont actuellement disponibles que pour les tissus FFPE et le développement de panneaux personnalisés implique plus de temps et de dépenses.

La méthode séquentielle de coloration multiplex, en revanche, comprend l’étiquetage du tissu avec un anticorps à un marqueur, le décapage pour enlever l’anticorps, suivi par des répétitions séquentielles de ce processus pour étiqueter plusieurs marqueurs12. L’amplification du signal de tyramide (TSA) est la méthode de multiplexe séquentielle la plus fréquemment utilisée. Deux autres technologies de multiplexage utilisent une combinaison de méthodes de coloration simultanées et séquentielles. La plate-forme CODEX13 utilise un cocktail d’anticorps conjugués à des séquences uniques d’oligonucléotide d’ADN qui sont finalement étiquetés avec un fluorophore à l’aide d’une étape de polymérisation indexée suivie de l’imagerie, le décapage et la répétition du processus pour détecter jusqu’à 50 marqueurs. L’approche de coloration multiplexe MultiOmyx14 est une itération de colorant avec un cocktail de trois à quatre anticorps fluorophore-conjugués, imagerie, étanchéité des fluorophores, et répétant ce cycle pour détecter jusqu’à 60 marqueurs sur une seule section. Semblable à la méthode simultanée de coloration multiplex, tandis qu’un large éventail de marqueurs peuvent être détectés, le temps impliqué dans la coloration, l’acquisition d’image, le traitement, et l’analyse est étendu. L’étape de décapage/étanchéité consiste à chauffer et/ou à blanchir l’échantillon de tissu et, par conséquent, l’approche séquentielle de coloration multiplexe est couramment pratiquée sur les tissus ffPE qui maintiennent l’intégrité des tissus lors du chauffage ou du blanchiment.

La fixation de formaline et l’intégration subséquente de paraffine sont facilement exécutées dans un arrangement clinique, les blocs de tissu sont faciles à stocker, et plusieurs protocoles de coloration de multiplexe sont disponibles. Cependant, le traitement, l’intégration et la deparaffinisation des tissus FFPE, ainsi que la récupération d’antigène15, un processus par lequel les anticorps peuvent mieux accéder aux épitopes, prend beaucoup de temps. En outre, le traitement impliqué dans les tissus FFPE contribue à l’autofluorescence16 et les masques ciblent les épitopes, résultant en la variabilité et le manque de clone d’anticorps disponibles pour détecter les antigènes dans les tissus FFPE17,18,19. Un exemple est l’antigène leucocyte humain (HLA) classe I allèles20. En revanche, la congélation rapide des tissus n’implique pas d’étapes de traitement étendues avant ou après la fixation, contournant le besoin de récupération d’antigène21,22, et le rendant bénéfique pour détecter un plus large éventail de cibles. Par conséquent, l’utilisation de tissus congelés pour l’imagerie multispectrale de fluorescence peut être utile pour détecter des cibles pour des études précliniques et cliniques.

Étant donné les limites mentionnées ci-dessus lors de l’utilisation des tissus FFPE, nous avons demandé si l’imagerie multispectrale de fluorescence peut être effectuée sur les tissus congelés. Pour répondre à cette question, nous avons testé une méthode simultanée de coloration multiplexe à l’aide d’un panel d’anticorps fluorophore-conjugués pour détecter de multiples antigènes et analysé la coloration à l’aide d’un système d’imagerie multispectral semi-automatique. Nous avons pu tacher simultanément jusqu’à six marqueurs dans une seule section tissulaire dans un rayon de 90 min.

Protocole

La rate de souris et les tissus de tumeur de souris de HLF1623 ont été obtenus de notre laboratoire. Des tissus d’amygdale humaine ont été achetés auprès d’un vendeur commercial. Les détails sont fournis dans la Table des Matériaux.

1. Embedding tissu

  1. Intégrer le tissu frais dans la solution OCT (température de coupe optimale) et geler les cheveux à l’aide de glace sèche ou d’azote liquide.
  2. Conserver les tissus à -80 oC.

2. Cryosection

  1. Couper les sections de 8 m dans un cryostat avec des températures fixées à -25 oC.
    REMARQUE: L’épaisseur de la section préférée peut être ajustée pour générer des images plus nettes.
  2. Placez les sections sur des glissières en verre chargées.
  3. Sécher les sections pendant 1 h à température ambiante (RT) avant de fixer dans l’acétone glacée de qualité histologie pendant 10 min.
    REMARQUE: L’acétone provoque la coagulation des protéines solubles dans l’eau et extrait des lipides, mais n’a pas d’impact sur les composants contenant des glucides. En revanche, la formaline préserve la plupart des lipides et a peu d’impact sur les glucides24. Le choix du fixatif est important en fonction du choix du marqueur détecté.
  4. Conservez les toboggans à -20 oC.

3. Sélection d’anticorps et de fluorophores

REMARQUE: Avant la coloration des tissus, les clones d’anticorps qui tacheront robustement et spécifiquement leurs antigènes d’intérêt dans les sections séquentielles du tissu fixe d’acétone doivent être validés. Certains anticorps peuvent nécessiter un fixatif différent, et leur compatibilité avec d’autres anticorps dans le panneau devra également être déterminé empiriquement. L’objectif est également d’identifier les fluorophores avec un chevauchement minimal qui peut être détecté avec les filtres d’épifluorescence pour DAPI, FITC, Cy3, Texas Red, et Cy5.

  1. Confirmer la coloration par détection conventionnelle de l’IHC ou de l’immunofluorescence (IF) dans les sections tissulaires avec l’antigène cible d’expression connu.
  2. À l’aide des ensembles de filtres d’excitation et d’émission disponibles sur le système d’imagerie semi-automatique et après avoir testé diverses combinaisons d’anticorps primaires conjugués au fluorophore, préparez des fluorophores à utiliser qui ont un chevauchement spectral minimal (p. ex., voir le tableau 1).

4. Staining

REMARQUE: La réhydratation de tissu et les lavages de glissière ont été exécutés dans un pot de Coplin. Les étapes de blocage et d’incubation d’anticorps ont été exécutées dans une boîte à glissière humidifiée.

  1. Laisser les toboggans se réchauffer à RT pendant 5 à 10 min.
  2. Réhydratez en saline tamponnée de phosphate (PBS) pendant 5 min.
  3. Effectuez une étape de blocage avant de colorer les tissus avec des anticorps. Pour les sections de souris, utilisez une solution de blocage spécialisée (voir Tableau des matériaux)pendant 10 min à RT. Pour les sections humaines, utilisez 10% normal sérum humain mis en commun (NHS) dilué dans PBS pendant 15 min à RT.
    REMARQUE: Différents tampons de blocage peuvent être testés au besoin pour préserver les propriétés spécifiques des sections en fonction des procédures de suivi à utiliser.
  4. Laver les diapositives pendant 5 minutes dans PBS après blocage.
  5. Pour la coloration multiplexe, préparer un cocktail d’anticorps avec des fluorophores compatibles lors de dilutions optimales prédéterminées.
  6. Ajouter le cocktail d’anticorps fluorophore-conjugués aux diapositives. Pour la coloration à un seul marqueur, ajouter uniquement l’anticorps conjugué primaire à la glissière.
  7. Inclure une glissière non contenue de contrôle qui subit la même procédure de coloration sans l’ajout d’un anticorps conjugué primaire.
  8. Incuber les diapositives pendant 1 h à RT dans l’obscurité, puis laver les diapositives 2x avec PBS pendant 5 minutes chacun. À partir de maintenant, la diapositive qui en résulte est appelée multiplexe teintée.
  9. Pour contrer, ajoutez daPI à la glissière tachée de multiplexe, incuber pendant 7 minutes dans l’obscurité à RT, et laver les diapositives 2x avec PBS pendant 5 minutes chacun. Ne pas contrebaler les toboggans à coloration unique et nontachés.
  10. Pour couvrir, ajouter une goutte du milieu de montage, et placer délicatement le housse en verre sur le tissu.

5. Préparation d’une bibliothèque spectrale

  1. Acquisition d’images
    1. Réglez la puissance de la lampe à 100%. Habituellement, la puissance est réglée à 10% parce que la détection de fluorescence sur les tissus FFPE comprend une étape d’amplification du signal.
    2. Commencez par ouvrir le logiciel d’exploitation du microscope (voir Tableau des matériaux).
    3. Sélectionnez Le protocole d’édition, puis le nouveau protocole.
    4. Fournir un « nom de protocole » et sélectionnez la fluorescence en mode imagerieet fournissez un « nom d’étude ».
    5. Placez les toboggans à une seule téale sur la scène et examinez chaque marqueur dans son canal de fluorescence correspondant pour assurer la coloration. Choisissez une région sur le tissu exprimant le signal le plus fort pour le marqueur.
    6. Ajustez les temps d’exposition à l’aide des options Autofocus et Autoexpose.
    7. Acquérez des instantanés pour les diapositives à coloration unique et non contenues et enregistrez le protocole.
      REMARQUE: Les étapes suivantes sont effectuées dans un logiciel d’apprentissage automatique (voir tableau des matériaux),en utilisant les diapositives non tachées et nontachées simples pour vérifier la coloration spécifique ainsi que pour déterminer les discours croisés d’anticorps.
    8. Sous l’onglet Build Libraries dans le logiciel, chargez chaque image de diapositives à une seule tache, choisissez le fluor approprié et cliquez sur Extrait. Le logiciel extraira automatiquement le signal de fluorescence choisi dans le Fluor.
    9. Pour enregistrer la couleur extraite, cliquez sur Enregistrer pour stocker. Un "nouveau groupe" peut être créé ou la couleur extraite peut être stockée à un groupe existant.
  2. Vérification de la bibliothèque spectrale
    1. Vérifiez la fenêtre de courbe spectrale d’émission, située à droite de l’image extraite, pour chaque ensemble de filtre.
      REMARQUE: Le signal extrait est correct si la courbe spectrale n’est observée que dans les ensembles de filtre où le fluorophore est détecté. Si une courbe spectrale est observée dans le mauvais ensemble de filtre, cela peut signifier que soit le signal principal attendu dans l’ensemble de filtre n’est pas assez fort, ou le logiciel détecte un autre signal qui est trop élevé, peut-être en raison du chevauchement spectral. Dans ce cas, essayez d’abord d’utiliser l’outil Draw Processing Regions pour dessiner des régions autour des zones exprimant le marqueur fluorescent et l’autofluorescence dans l’image. Cela forme le logiciel pour détecter le signal réel et supprimer les signaux d’interférence. Si cela ne fonctionne pas, répétez le processus de coloration pour la glissière à une seule téale pour tester différentes titrations d’anticorps.

6. Imagerie multispectrale

REMARQUE: Une fois la bibliothèque spectrale créée et vérifiée, effectuez les étapes suivantes pour la glissière tachée de multiplexe.

  1. Balayage de diapositives entières
    1. Ajuster les temps de mise au point et d’exposition sur la glissière tachée de multiplexe comme mentionné en vertu de la section 5.1.
    2. Sous Scan Slides, créez une nouvelle tâche et choisissez le protocole enregistré ci-dessus.
    3. Effectuez un balayage complet de la diapositive sur la glissière tachée de multiplexe.
    4. À l’aide de l’ensemble du logiciel de balayage de diapositives, ouvrez toute l’image de balayage de diapositives. Cette image n’a pas été spectralement intacte.
    5. Sélectionnez les régions d’intérêt (ROI) sur l’ensemble de l’image de balayage de diapositives à l’aide de l’outil Timbre ou RETOUR sur investissement. Ces ROI seront numérisés à l’aide des temps d’exposition fixés en 6.1.1 pour être utilisés pour le mélange spectral et l’analyse.
    6. Click Process Slide pour acquérir des IPP à 20x grossissement
  2. Le non-mélange spectral
    1. Une fois que les ROI ont été acquis, dans le logiciel d’apprentissage automatique, sous l’onglet Analyse manuelle, charger les images tachées de multiplex en cliquant sur Open under File.
    2. Dans le menu Spectral Library Source dropdown cliquez sur Select Fluors.
    3. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Ici, choisissez la bibliothèque spectrale ou le groupe créé ci-dessus.
    4. Chargez l’image de diapositive non contenue. Cliquez sur l’icône du marqueur d’encre AF située au-dessus de la bibliothèque spectrale sélectionnée et tracez une ligne ou une région sur la glissière non contenue pour identifier l’autofluorescence dans le tissu.
    5. Sous l’onglet Marqueurs et couleurs d’édition, attribuez des noms pour chaque marqueur. Les pseudo-couleurs peuvent être attribuées à cette étape.
      REMARQUE: La couleur de l’image Autofluorescence par défaut à DarkSlateGray. Changez ça en noir.
    6. Cliquez sur Préparer tous.
  3. Vérification des images spectralement non mélangées
    REMARQUE :     Lorsque l’étape de mélange spectrale est terminée, une image composite composée de toutes les couleurs est créée.
    1. Cliquez sur l’icône Modifier l’œil View. Ici, chaque couleur dans le "Component Display" peut être désactivée ou allumée pour afficher la coloration de chaque marqueur individuel.
    2. Inspecter visuellement la coloration et la morphologie des cellules pour s’assurer qu’il n’y a pas de chevauchement du marqueur, à moins qu’il ne soit biologiquement pertinent. Un pathologiste peut aider à vérifier la coloration ainsi.
      REMARQUE: La coloration sur la glissière multiplexée doit être validée en laissant de côté un fluorophore à la fois et en examinant le motif de coloration. En outre, la validation aidera également à identifier les fluorophores forts qui apparaissent dans les spectres adjacents en raison de la parole croisée des anticorps ou le saignement.
    3. Pour Pathology Views, qui simulent des images de champ lumineux pour chaque marqueur fluorescent, cliquez sur le bouton Sélectionnez une image de composant. Ici, choisissez un marqueur pour afficher une image simulée de champ lumineux.

7. Analyser les images multispectrales via la segmentation cellulaire et le phénotypage

REMARQUE: Après vérification de l’image spectralement non mélangée, la segmentation cellulaire peut être effectuée à l’aide du logiciel d’apprentissage automatique, qui fournira des instructions étape par étape. La segmentation de tissu n’a pas été exécutée ici. Si le panneau comprend un ou plusieurs marqueurs spécifiques aux tissus et surtout si le tissu est désordonné, la segmentation des tissus doit être effectuée.

  1. Sélectionnez "Cytoplasm" et "Membrane" sous l’option 'Segment'.
    REMARQUE: "Nuclei" est choisi par défaut.
  2. Sélectionnez un marqueur à partir du panneau. Configurer le marqueur pour détecter les noyaux, le cytoplasme ou la membrane. Par exemple, DAPI peut être sélectionné pour détecter les noyaux et le CD3 pour la membrane.
  3. Cliquez sur le bouton ellipsis ('...') pour sélectionner une option sous "utiliser ce signal pour trouver". Par exemple, 'nuclei' pour DAPI. Plusieurs marqueurs du panneau peuvent être sélectionnés pour la segmentation.
    REMARQUE: Pour les marqueurs cytoplasmiques ou membranaires, sélectionnez l’option «Utilisez ce signal pour aider à la segmentation nucléaire».
  4. Le logiciel détecte et crée automatiquement un masque chacun pour le noyau, le cytoplasme et la membrane de l’image.
  5. Assurez-vous que toutes les cellules sont « masquées » pour la segmentation. Pour vous ajuster, passez à la vue de pathologie pour le marqueur spécifique choisi en 7.3. et utiliser les options de configuration dans le logiciel.
  6. Cliquez sur "Segment All" pour segmenter les cellules.
  7. Après la segmentation cellulaire, procéder avec des cellules de phénotypage. Dans cette étape, choisissez les marqueurs nécessaires pour le phénotypage et sélectionnez manuellement au moins cinq cellules qui sont brillamment tachées avec le marqueur choisi. Cela forme le logiciel pour ensuite détecter automatiquement toutes les cellules tachées avec le marqueur choisi dans l’image.
  8. Une carte de phénotype est créée. Analyser pour s’assurer que la cellule tachée avec le marqueur est correctement phénotyped.
    REMARQUE: Le phénotypage cellulaire peut être un processus itératif. Si le logiciel est incapable de phénotyper les cellules correctement, cela signifie que la formation est inadéquate ou incorrecte. Dans ce cas, l’utilisateur doit sélectionner manuellement plus de cellules et recycler le logiciel et répéter cette étape jusqu’à ce que l’utilisateur soit satisfait de la formation.
  9. Créez un groupe nommé « Autres » et incluez des cellules qui ne sont pas tachées pour l’un des marqueurs.
    REMARQUE: Cette étape est importante pour former le logiciel à exclure toutes les cellules non contaminées du phénotypage.

8. Exportation d’images et de tableaux d’analyse

  1. Cliquez sur le bouton Exportation pour afficher le panneau Paramètres d’exportation.
  2. Dans le «Répertoire d’exportation», cliquez sur Parcourir pour sélectionner un emplacement pour exporter les images.
  3. Dans les « options d’exportation d’images », choisissez le format de sortie d’image.
  4. Dans la liste "Images à exporter", sélectionnez les images à exporter. "Image composite" est l’image pseudocolored finale non mélangée. "Pathology Views" sont les images individuelles simulées de champ lumineux et les "Images composant (multi-image TIFF)" est un fichier multi-image TIFF de données de composants qui peuvent être utilisés par un logiciel d’analyse tiers.
  5. Cliquez sur le bouton «Exportation pour tous» pour exporter les images.
    REMARQUE: Les tableaux de l’analyse peuvent également être sélectionnés et exportés à cette étape.

Résultats

Détection de marqueurs à une seule téale sur des sections de rate congelées
Comme le système d’imagerie semi-automatique utilise un système de filtre à thon en cristal liquide (LCTF) qui permet une plus large gamme de détection de longueur d’onde25, et parce qu’aucune étape d’amplification du signal n’a été effectuée ici, nous avons d’abord optimisé la détection de nos anticorps conjugués primaires pour chaque marqueur au microscope. Un exemple est mo...

Discussion

Les tissus congelés ont été largement utilisés pour l’imagerie mIF pour détecter traditionnellement trois à quatre marqueurs31 sur un tissu en utilisant la méthode directe et indirecte32. Dans la méthode directe, les anticorps sont conjugués aux colorants fluoréscing ou points quantiques33 pour étiqueter le tissu, tandis que dans la méthode indirecte, un anticorps primaire non judiciaire est utilisé pour étiqueter le tissu suivi d’u...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Des conseils en imagerie et en analyse ont été fournis par le Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core de l’Université de l’Illinois à Chicago, établi avec le soutien du bureau du vice-chancelier de la recherche. Les travaux ont été soutenus par NIH/NCI RO1CA191317 à CLP, par NIH/NIAMS (subvention du CRST 1P30AR075049-01) au Dr A. Paller, et par le soutien du Centre complet du cancer Robert H. Lurie au centre d’évaluation de l’immunothérapie de l’Université Northwestern.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetone (histological grade)Fisher ScientificA16F-1GALFixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3BioLegend100212Clone - 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20ThermoFisher Scientific53-0202-82Clone - L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67BD Biosciences558617Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3BioLegend300446Clone - UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8aBioLegend100758Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8aBioLegend372906Clone - C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR)BioLegend141711Clone - C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 AntibodyBioLegend100426Clone - GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 MouseCharles River Laboratories27Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin JarSigma AldrichS6016-6EARehydrating and washing slides
DAPI SolutionBD Biosciences564907Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged SlidesDOT ScientificDW7590WAdhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg)Fisher ScientificMT21031CVWashing and diluent
Gold Seal Cover SlipsThermoFisher Scientific3306Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue blockAMSBioAMS6023Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1XGemini Bio-Products100-512Blocking and diluent for human tissues
inFormAkoya BiosciencesVersion 2.4.1Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4BioLegend300529Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11bBD Biosciences550993Clone - M1/70; primary conjugated antibody
PhenochartAkoya BiosciencesVersion 1.0.8Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade MountantThermoFisher ScientificP36965Mounting medium
Research CryostatLeica BiosystemsCM3050 SSectioning tissues
Superblock 1XThermoFisher Scientific37515Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T SolutionSakura Finetek4583Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 SlideAkoya BiosciencesCLS142568Semi-automated multispectral imaging system
Vectra SoftwareAkoya BiosciencesVersion 3.0.5Software to operate microscope

Références

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