Un metodo rapido per l'imaging della fluorescenza multispettrale delle sezioni dei tessuti congelati

Riepilogo

Descriviamo un metodo di colorazione rapida per eseguire l'imaging multispettrale sui tessuti congelati.

Abstract

L'imaging a fluorescenza multispettrale su tessuti incorporati in paraffina fissata in formalina (FFPE) consente di rilevare più marcatori in un singolo campione di tessuto in grado di fornire informazioni sulla coespressione dell'antigene e sulla distribuzione spaziale dei marcatori. Tuttavia, la mancanza di anticorpi adatti per i tessuti fissati in formalina può limitare la natura dei marcatori che possono essere rilevati. Inoltre, il metodo di colorazione richiede molto tempo. Qui descriviamo un metodo rapido per eseguire l'imaging a fluorescenza multispettrale sui tessuti congelati. Il metodo include le combinazioni di fluoroforo utilizzate, passaggi dettagliati per la colorazione dei tessuti congelati del topo e dell'uomo e le procedure di scansione, acquisizione e analisi. Per l'analisi della colorazione, viene utilizzato un sistema di imaging a fluorescenza multispettrale semiautomatico disponibile in commercio. Attraverso questo metodo, fino a sei diversi marcatori sono stati macchiati e rilevati in una singola sezione di tessuto congelato. Il software di analisi dell'apprendimento automatico può fenotipo le cellule che possono essere utilizzate per l'analisi quantitativa. Il metodo qui descritto per i tessuti congelati è utile per il rilevamento di marcatori che non possono essere rilevati nei tessuti FFPE o per i quali anticorpi non sono disponibili per i tessuti FFPE.

Introduzione

I recenti progressi nelle tecniche di imaging microscopico hanno migliorato significativamente le nostre conoscenze e la comprensione dei processi biologici e degli stati della malattia. Il rilevamento in situ delle proteine nei tessuti tramite immunohistochimica cromogenica (IHC) viene regolarmente eseguito in patologia. Tuttavia, il rilevamento di più marcatori che utilizzano la colorazione IHC cromogenica è difficile¹ e metodi più recenti per utilizzare approcci di colorazione multifluorescenza (mIF), in cui più marcatori biologici sono etichettati su un singolo campione di tessuto, sono in fase di sviluppo. La rilevazione di più marcatori biologici è utile, perché le informazioni relative all'architettura dei tessuti, alla distribuzione spaziale delle cellule e alla co-espressione dell'antigene sono tutte catturate in un campione di tessuto singolo². L'uso della tecnologia di imaging a fluorescenza multispettrale ha reso possibile il rilevamento di più marcatori biologici. In questa tecnologia, utilizzando ottiche specifiche, gli spettri di fluorescenza di ogni singolo fluoroforo possono essere separati o "non miscelati", consentendo il rilevamento di più marcatori senza alcun crosstalk spettrale³. L'imaging a fluorescenza multispettrale sta diventando un approccio critico nella biologia cellulare, nello sviluppo di farmaci preclinici, nella patologia clinica e nella profilazione immunitaria del tumore^4,5,6. È importante sottolineare che la distribuzione di cellule immunitarie (in particolare le cellule T CD8) può servire come fattore prognostico per i pazienti con tumori esistenti⁷.

Sono stati sviluppati vari approcci alla colorazione a fluorescenza multiplex che possono essere eseguiti contemporaneamente o in sequenza. Nel metodo di colorazione simultanea, tutti gli anticorpi vengono aggiunti insieme come cocktail in un unico passaggio per etichettare il tessuto. La tecnologia UltraPlex utilizza un cocktail di anticorpi primari coniugati seguiti da un cocktail di anticorpi secondari anti-hapten anti-hapten confluito con fluoroforo. La tecnologia InSituPlex⁸ utilizza un cocktail di anticorpi primari coniugati in DNA unici che vengono aggiunti contemporaneamente al tessuto seguito da un passo di amplificazione e infine sonde coniugate a fluoroforo che sono complementari a ogni sequenza di DNA unica sull'anticorpo primario. Entrambe queste tecnologie consentono il rilevamento di quattro marcatori più 4',6-diamino-2-fenilindole (DAPI) per la colorazione nucleare. Altri due approcci per la colorazione multiplex simultanea si basano sulla spettrometria di massa iomaci^{secondaria 9}. Hyperion Imaging System utilizza la citometria di massa¹⁰ per rilevare fino a 37 marcatori. Questa tecnologia utilizza un cocktail di anticorpi coniugati in metallo per macchiare i tessuti, e specifiche aree dei tessuti sono ablatate da un laser e trasferite in un citometro di massa dove vengono rilevati gli ioni metallici. Un'altra tecnologia simile è l'IONPath, che utilizza la tecnologia di imaging del fascio di ioni multiplexed¹¹. Questa tecnologia utilizza uno strumento di spettrometria di massa modificato e una fonte di ioni di ossigeno invece del laser per ablate gli anticorpi coniugati in metallo. Mentre tutti questi approcci di colorazione multiplex simultanei consentono il rilevamento di più marcatori, i costi per coniugare DNA, apteni o metalli agli anticorpi, la perdita di tessuto a causa dell'ablazione e l'estesa elaborazione delle immagini per lo smistamento non possono essere sottovalutati. Inoltre, i kit e i protocolli di colorazione sono attualmente disponibili solo per i tessuti FFPE e lo sviluppo di pannelli personalizzati comporta tempi e spese aggiuntivi.

Il metodo di colorazione multiplex sequenziale, al contrario, include l'etichettatura del tessuto con un anticorpo a un marcatore, stripping per rimuovere l'anticorpo, seguita da ripetizioni sequenziali di questo processo per etichettare più marcatori¹². L'amplificazione del segnale di tirofa (TSA) è il metodo di multiplexing sequenziale più utilizzato. Altre due tecnologie di multiplexing utilizzano una combinazione di metodi di colorazione simultanei e sequenziali. La piattaforma CODEX¹³ impiega un cocktail di anticorpi coniugati a sequenze uniche di oligonucleotidi di DNA che alla fine vengono etichettate con un fluoroforo utilizzando una fase di polimerizzazione indicizzata seguita dall'imaging, dallo stripping e dalla ripetizione del processo per rilevare fino a 50 marcatori. L'approccio di colorazione multiplex MultiOmyx¹⁴ è un'iterazione di colorazione con un cocktail di tre o quattro anticorpi coniugati con fluoroforo, imaging, spegnimento dei fluorofori e ripetizione di questo ciclo per rilevare fino a 60 marcatori su una singola sezione. Simile al metodo di colorazione multiplex simultanea, mentre è possibile rilevare un'ampia gamma di marcatori, il tempo necessario per la colorazione, l'acquisizione dell'immagine, l'elaborazione e l'analisi è ampio. La fase di stripping/spegnimento comporta il riscaldamento e/o lo sbiancamento del campione di tessuto e, pertanto, l'approccio di colorazione multiplex sequenziale viene comunemente eseguito sui tessuti FFPE che mantengono l'integrità dei tessuti al riscaldamento o allo sbiancamento.

La fissazione della formalina e il successivo incorporamento della paraffina vengono prontamente eseguiti in un ambiente clinico, i blocchi di tessuto sono facili da memorizzare e sono disponibili diversi protocolli di colorazione multiplex. Tuttavia, l'elaborazione, l'incorporamento e la deparaffinazione dei tessuti FFPE, così come il recupero dell'antigene¹⁵, un processo attraverso il quale gli anticorpi possono accedere meglio agli epitopi, richiede molto tempo. Inoltre, l'elaborazione coinvolta nei tessuti FFPE contribuisce all'autofluorescenza¹⁶ e maschera gli epitopi bersaglio, con conseguente variabilità e mancanza di clone di anticorpi disponibili per rilevare gli antigeni nei tessuti FFPE^17,18,19. Un esempio è l'antigene di leucocito umano (HLA) di classe I alleli²⁰. Al contrario, lo scatto di congelamento dei tessuti non comporta lunghe fasi di elaborazione prima o dopo il fissaggio, eludendo la necessità di recupero dell'antigene^21,22e rendendolo vantaggioso per rilevare una più ampia gamma di obiettivi. Pertanto, l'utilizzo di tessuti congelati per l'imaging a fluorescenza multispettrale può essere utile per rilevare obiettivi per studi preclinici e clinici.

Date le limitazioni di cui sopra quando si utilizzano tessuti FFPE, ci siamo chiesti se l'imaging a fluorescenza multispettrale può essere eseguito su tessuti congelati. Per rispondere a questa domanda, abbiamo testato un metodo di colorazione multiplex simultaneo utilizzando un pannello di anticorpi coniugati a fluoroforo per rilevare più antigeni e analizzato la colorazione utilizzando un sistema di imaging multispettrale semiautomatico. Siamo stati in grado di macchiare simultaneamente fino a sei marcatori in una singola sezione di tessuto entro 90 min.

Protocollo

La milza del topo e i tessuti tumorali del topo HLF16²³ sono stati ottenuti dal nostro laboratorio. Il tessuto tonsillare umano è stato acquistato da un fornitore commerciale. I dettagli sono forniti nella Tabella dei Materiali.

1. Incorporamento dei tessuti

1. Incorporare tessuti freschi nella soluzione OCT (temperatura di taglio ottimale) e congelare con lo snap utilizzando ghiaccio secco o azoto liquido.
2. Conservare i tessuti a -80 gradi centigradi.

2. Criosezione

1. Tagliare 8 sezioni in un criostato con temperature fissate a -25 gradi centigradi.
   NOT: Lo spessore della sezione preferito può essere regolato per generare immagini più nitide.
2. Posizionare le sezioni sugli scivoli di vetro caricati.
3. Asciugare ad aria le sezioni per 1 h a temperatura ambiente (RT) prima di fissare in acetone ghiacciato di grado istologico per 10 min.
   NOT: L'acetone provoca la coagulazione delle proteine solubili in acqua ed estrae i lipidi, ma non influisce sui componenti contenenti carboidrati. Al contrario, la formalina conserva la maggior parte dei lipidi e ha poco impatto sui carboidrati²⁴. La scelta del fissativo è importante a seconda della scelta del marcatore rilevato.
4. Conservare i vetrini a -20 gradi centigradi.

3. Selezione di anticorpi e fluorofori

NOT: Prima della colorazione dei tessuti, i cloni di anticorpi che macchiano in modo robusto e specifico i loro antigeni di interesse all'interno di sezioni sequenziali dal tessuto fisso di acetone devono essere convalidati. Alcuni anticorpi possono richiedere un fissativo diverso, e la loro compatibilità con altri anticorpi nel pannello dovrà anche essere determinata empiricamente. L'obiettivo è anche quello di identificare i fluorofori con una sovrapposizione minima che può essere rilevata con i filtri di epifluorescenza per DAPI, FITC, Cy3, Texas Red e Cy5.

1. Confermare la colorazione mediante rilevamento convenzionale iHC o immunofluorescenza (IF) nelle sezioni tissutali con antigene bersaglio espressione nota.
2. Utilizzando i set di filtri di eccitazione e e di emissione disponibili sul sistema di imaging semiautomatico e dopo aver testato varie combinazioni di anticorpi primari coniugati a fluoroforo, preparare i fluorofori da utilizzare che presentano una sovrapposizione spettrale minima (ad esempio, vedi tabella 1).

4. Colorazione

NOT: La reidratazione dei tessuti e i fustici a scivolo sono stati eseguiti in un barattolo di Coplin. I passaggi di blocco e incubazione degli anticorpi sono stati eseguiti in una scatola di scorrimento umidificata.

1. Lasciare scaldare i vetrini a RT per 5-10 min.
2. Reidratare in fosfato tampone salina (PBS) per 5 min.
3. Eseguire una fase di blocco prima di macchiare i tessuti con anticorpi. Per le sezioni del mouse, utilizzare una soluzione di blocco specializzata (vedere Tabella dei materiali) per 10 min in RT. Per le sezioni umane, utilizzare il 10% del siero umano in pool normale (NHS) diluito in PBS per 15 min a RT.
   NOT: È possibile testare diversi buffer di blocco in base alle esigenze per mantenere le proprietà specifiche delle sezioni a seconda delle procedure di follow-up da utilizzare.
4. Lavare i vetrini per 5 min in PBS dopo il blocco.
5. Per la colorazione multiplex, preparare un cocktail di anticorpi con fluorofori compatibili con diluizioni ottimali predeterminate.
6. Aggiungere il cocktail di anticorpi coniugati con fluoroforo agli scivoli. Per la colorazione a marcatore singolo, aggiungere solo l'anticorpo primario coniugato alla diapositiva.
7. Includere un controllo diapositiva incontaminata che subisce la stessa procedura di colorazione senza l'aggiunta di alcun anticorpo coniugato primario.
8. Incubare i vetrini per 1 h al RT al buio e poi lavare i vetrini 2x con PBS per 5 min ciascuno. Da qui in poi, la diapositiva risultante viene definita macchiata multiplex.
9. Per controstare, aggiungere DAPI allo scivolo colorato multiplex, incubare per 7 min al buio a RT e lavare i vetrini 2x con PBS per 5 min ciascuno. Non contrastare le vetrine monomacchiate e non colorate.
10. Per coprire, aggiungere una goccia del supporto di montaggio, e posizionare delicatamente il coperchio di vetro sopra il tessuto.

5. Preparazione di una libreria spettrale

1. Acquisizione di immagini
   1. Impostare la potenza della lampada al 100%. Di solito la potenza è impostata al 10% perché il rilevamento della fluorescenza sui tessuti FFPE include una fase di amplificazione del segnale.
   2. Iniziare aprendo il software operativo al microscopio (vedere Tabella dei materiali).
   3. Selezionare Modifica protocollo , quindi Nuovo protocollo.
   4. Specificare un "Nome protocollo" e selezionare Fluorescenza in Modalità imaginge specificare un "Nome studio".
   5. Posizionare i vetrini a macchie singole sullo stage ed esaminare ogni marcatore nel corrispondente canale di fluorescenza per garantire la colorazione. Scegliere una regione sul tessuto esprimendo il segnale più forte per il marcatore.
   6. Regolare i tempi di esposizione utilizzando le opzioni Messa a fuoco automatica ed Esposizione automatica.
   7. Acquisire istantanee per le diapositive a macchie singole e non colorate e salvare il protocollo.
      NOT: I passaggi seguenti vengono eseguiti nel software di apprendimento automatico (vedere Tabella dei materiali), utilizzando le singole diapositive colorate e non colorate per verificare una colorazione specifica e per determinare il cross talk degli anticorpi.
   8. Nella scheda Crea librerie del software, caricare ogni immagine di diapositiva a colorata singola, scegliere il Fluor appropriato e fare clic su Estrai. Il software estrarrà automaticamente il segnale di fluorescenza scelto nel Fluor.
   9. Per salvare il colore estratto, fare clic su Salva nel negozio. È possibile creare un "Nuovo gruppo" o il colore estratto può essere memorizzato in un gruppo esistente.
2. Verifica della libreria spettrale
   1. Controllare la finestra della curva spettrale di emissione, situata a destra dell'immagine estratta, per ogni set di filtri.
      NOT: Il segnale estratto è corretto se la curva spettrale viene osservata solo nei set di filtri in cui viene rilevato il fluoroforo. Se una curva spettrale viene osservata nel set di filtri errato, può significare che il segnale primario previsto nel set di filtri non è abbastanza forte o che il software sta rilevando un altro segnale troppo alto, probabilmente a causa della sovrapposizione spettrale. In questo caso, provare innanzitutto a utilizzare lo strumento Disegna regioni di elaborazione per disegnare aree intorno alle aree che esprimono il marcatore fluorescente e l'autofluorescenza nell'immagine. Questo addestra il software per rilevare il segnale vero e rimuovere eventuali segnali interferenti. Se questo non funziona, ripetere il processo di colorazione per la diapositiva singola macchiata per testare diverse titrazioni anticorpali.

6. Imaging multispettrale

NOT: Una volta creata e verificata la libreria spettrale, effettuare le seguenti operazioni per la diapositiva color multiplex.

1. Scansione intera delle diapositive
   1. Regolare i tempi di messa a fuoco e di esposizione sulla diapositiva macchiata multiplex come indicato nella sezione 5.1.
   2. In Scansione diapositive, creare una nuova attività e scegliere il protocollo salvato in precedenza.
   3. Eseguire un'intera scansione della diapositiva sulla diapositiva macchiata multiplex.
   4. Utilizzando l'intero software di scansione delle diapositive, aprire l'intera immagine di scansione delle diapositive. Questa immagine non è stata spettrale senza miscela.
   5. Selezionare le aree di interesse (ROI) nell'intera immagine di scansione delle diapositive utilizzando lo strumento Timbro o ROI. Queste ROI verranno analizzate utilizzando i tempi di esposizione impostati in 6.1.1 da utilizzare per lo smistare e l'analisi spettrale.
   6. Fare clic su Elabora diapositiva per acquisire i ROI con ingrandimento 20x
2. Spettrale smescolando
   1. Una volta acquisite le ROI, nel software di apprendimento automatico, nella scheda Analisi manuale, caricare le immagini colorate multiplex facendo clic su Apri in File.
   2. Nel menu a discesa Origine libreria spettrale, fare clic su Seleziona fluors.
   3. Si aprirà una nuova finestra. Qui, scegli la libreria o il gruppo spettrale creato sopra.
   4. Caricare l'immagine della diapositiva non colorata. Fate clic sull'icona dell'indicatore di inchiostro AF situato sopra la libreria spettrale selezionata e disegnate una linea o un'area sulla diapositiva non colorata per identificare l'autofluorescenza nel tessuto.
   5. Nella scheda Modifica marcatori e colori, assegnate i nomi a ciascun marcatore. In questa fase è possibile assegnare pseudo colori.
      NOT: The color for the Autofluorescence image defaults to DarkSlateGray. Cambia questo in Nero.
   6. Fare clic su Prepara tutto.
3. Verifica di immagini spettrali non mescolate
   NOTA: una volta completato il passaggio di dismissione spettrale, viene creata un'immagine composita costituita da tutti i colori.
   1. Fare clic sull'icona Modifica occhio Vista. Qui, ogni colore nel "Visualizzazione componenti" può essere disattivato o acceso per visualizzare la colorazione di ogni singolo marcatore.
   2. Ispezionare visivamente la colorazione e la morfologia delle cellule per assicurarsi che non vi sia alcuna sovrapposizione di marcatore, a meno che non sia biologicamente rilevante. Un patologo può aiutare a verificare la colorazione pure.
      NOT: La colorazione sulla diapositiva multiplexata deve essere convalidata tralasciando un fluoroforo alla volta e rivedendo il modello di colorazione. Inoltre, la convalida aiuterà anche a identificare forti fluorofori che appaiono negli spettri adiacenti a causa del cross talk anticorpale o del sanguinamento.
   3. Per Viste patologiche, che simulano le immagini di campo luminoso per ogni indicatore fluorescente, fare clic sul pulsante Seleziona immagine componente. Qui, scegliete un marcatore per visualizzare un'immagine di campo luminoso simulato.

7. Analisi delle immagini multispettrali tramite segmentazione cellulare e fenotipizzazione

NOT: Dopo aver verificato l'immagine non mista, la segmentazione delle celle può essere eseguita utilizzando il software di apprendimento automatico, che fornirà istruzioni dettagliate. La segmentazione dei tessuti non è stata eseguita qui. Se il pannello include uno o più marcatori specifici del tessuto e soprattutto se il tessuto è disordinato, deve essere eseguita la segmentazione dei tessuti.

1. Selezionare "Citoplasma" e "Membrana" sotto l'opzione "Segmento".
   NOTA: "Nuclei" è scelto per impostazione predefinita.
2. Selezionate un marcatore dal pannello. Configurare il marcatore per rilevare nuclei, citoplasma o membrana. Ad esempio, DAPI può essere selezionato per rilevare i nuclei e CD3 per la membrana.
3. Fare clic sul pulsante con i lipsia ('...') per selezionare un'opzione in "utilizzare questo segnale per trovare". Ad esempio, "nuclei" per DAPI. È possibile selezionare più marcatori dal pannello per la segmentazione.
   NOT: Per i marcatori citoplasmamici o di membrana, selezionare l'opzione " Usa questo segnale per facilitare lasegmentazione nucleare".
4. Il software rileva e crea automaticamente una maschera ciascuno per il nucleo, il citoplasma e la membrana nell'immagine.
5. Assicurarsi che tutte le celle siano "mascherate" per la segmentazione. Per regolare, passare alla vista patologica per il marcatore specifico scelto in 7.3. e utilizzare le opzioni di configurazione nel software.
6. Fare clic su "Segmenta tutto" per segmentare le celle.
7. Dopo la segmentazione cellulare, procedere con le cellule fenotipiche. In questo passaggio, scegliere i marcatori necessari per la fenotipizzazione e selezionare manualmente almeno cinque celle che sono macchiate con il marcatore scelto. Questo addestra il software a rilevare automaticamente tutte le celle macchiate con il marcatore scelto nell'immagine.
8. Viene creata una mappa fenotipo. Analizzare per assicurarsi che la cella macchiata con il marcatore sia correttamente fenotipizzata.
   NOT: La fenotipizzazione cellulare può essere un processo iterativo. Se il software non è in grado di fenotipo correttamente delle cellule, significa che la formazione è inadeguata o errata. In questo caso, l'utente deve selezionare manualmente più celle e riaddestrare il software e ripetere questo passaggio fino a quando l'utente non è soddisfatto della formazione.
9. Creare un gruppo denominato "Altri" e includere le celle non colorate per nessuno dei marcatori.
   NOT: Questo passaggio è importante per addestrare il software a escludere tutte le cellule non colorate dalla fenotipizzazione.

8. Esportazione di immagini e tabelle di analisi

1. Fate clic sul pulsante Esporta per visualizzare il pannello Impostazioni di esportazione.
2. Nella sezione "Esporta directory", fare clic su Sfoglia per selezionare un percorso in cui esportare le immagini.
3. In "Opzioni di esportazione immagini", scegliere il Formato di output immagine.
4. Nell'elenco "Immagini da esportare", selezionare le immagini da esportare. "Immagine composita" è l'immagine non mista pseudocolorata finale. Le "viste patologiche" sono le singole immagini di brightfield simulate e le "Immagini dei componenti (TIFF multi-immagine)" sono un file TIFF multi-immagine di dati dei componenti che possono essere utilizzati da software di analisi di terze parti.
5. Fare clic sul pulsante "Esporta per tutti" per esportare le immagini.
   NOT: Le tabelle dall'analisi possono anche essere selezionate ed esportate in questa fase.

Risultati

Rilevamento di marcatori a macchia singola su sezioni di milza congelate
Poiché il sistema di imaging semiautomatico utilizza un sistema di filtri regolabili a cristalli liquidi (LCTF) che consente una più ampia gamma di rilevamento della lunghezza d'onda²⁵, e poiché non sono stati eseguiti passaggi di amplificazione del segnale qui, abbiamo prima ottimizzato il rilevamento dei nostri anticorpi coniugati primari per ogni marcatore al microscopio. Un esempio è illustrato nel...

Discussione

I tessuti congelati sono stati ampiamente utilizzati per l'imaging mIF per rilevare tradizionalmente da tre a quattro marcatori³¹ su un tessuto utilizzando il metodo diretto e indiretto³². Nel metodo diretto, gli anticorpi sono coniugati a coloranti fluorescenti o punti quantici³³ per etichettare il tessuto, mentre nel metodo indiretto, un anticorpo primario non coniugato viene utilizzato per etichettare il tessuto seguito da un anticorpo secondario ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone (histological grade)	Fisher Scientific	A16F-1GAL	Fixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3	BioLegend	100212	Clone - 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20	ThermoFisher Scientific	53-0202-82	Clone - L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67	BD Biosciences	558617	Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3	BioLegend	300446	Clone - UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a	BioLegend	100758	Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a	BioLegend	372906	Clone - C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR)	BioLegend	141711	Clone - C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody	BioLegend	100426	Clone - GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 Mouse	Charles River Laboratories	27	Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin Jar	Sigma Aldrich	S6016-6EA	Rehydrating and washing slides
DAPI Solution	BD Biosciences	564907	Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged Slides	DOT Scientific	DW7590W	Adhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg)	Fisher Scientific	MT21031CV	Washing and diluent
Gold Seal Cover Slips	ThermoFisher Scientific	3306	Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block	AMSBio	AMS6023	Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1X	Gemini Bio-Products	100-512	Blocking and diluent for human tissues
inForm	Akoya Biosciences	Version 2.4.1	Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4	BioLegend	300529	Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b	BD Biosciences	550993	Clone - M1/70; primary conjugated antibody
Phenochart	Akoya Biosciences	Version 1.0.8	Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36965	Mounting medium
Research Cryostat	Leica Biosystems	CM3050 S	Sectioning tissues
Superblock 1X	ThermoFisher Scientific	37515	Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T Solution	Sakura Finetek	4583	Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide	Akoya Biosciences	CLS142568	Semi-automated multispectral imaging system
Vectra Software	Akoya Biosciences	Version 3.0.5	Software to operate microscope