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要約

ここでは、1細胞胚の凍結保存のための改変方法と、遺伝子組換えマウスの効率的な生成のための凍結解凍胚とエレクトロポレーションの使用を組み合わせたプロトコルを提示する。

要約

遺伝子組み換え(GM)マウスの使用は、遺伝子機能を理解し、ヒト疾患の基礎となるメカニズムを解読するために重要になっています。CRISPR/Cas9システムにより、研究者は前例のない効率、忠実性、シンプルさでゲノムを改変することができます。この技術を活用して、研究者はGMマウスを生成するための迅速で効率的で簡単なプロトコルを求めています。ここでは、凍結解凍胚の発達率を高める一細胞胚の凍結保存のための改良された方法を紹介する。このプロトコルは、最適化されたエレクトロポレーション条件と組み合わせることで、短時間で高効率で低いモザイクレートでノックアウトマウスとノックインマウスを生成することができます。さらに、CRISPR試薬の調製、体外受精、1細胞胚の凍結保存と解凍、CRISPR試薬のエレクトロポレーション、マウス生成、および創始者のジェノタイピングをカバーし、最適化されたプロトコルの段階的な説明を示します。このプロトコルを使用して、研究者は比類のない容易さ、速度、および効率でGMマウスを準備することができるはずです。

概要

クラスター化された定期的に間隔をあけられた短いパリンドローム反復(CRISPR)/CRISPR関連タンパク質9(Cas9)システムは、ゲノム1に前例のない標的修飾を提供する科学的ブレークスルーである。CRISPR/Cas9システムはCas9タンパク質およびガイドRNA(gRNA)と2つの分子成分で構成される:標的特異的CRISPR RNA(crRNA)およびトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)2。2gRNAは、Cas9タンパク質をゲノム中の特異的な遺伝子座に導き、crRNAに相補的な20ヌクレオチド、およびプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接する。Cas9タンパク質は、標的配列に結合し、エラーが起こりやすい非相同末端結合(NHEJ)または高忠実相同症指向修復(HDR)3、4、5のいずれかによって修復される二本鎖破断(DSB)を誘導する。3,4,5NHEJは挿入および/および/および欠失(インデル)を導き、したがって、コード配列が標的とされるときの機能の遺伝子喪失につながる。HDRは、相同性配列,3、4、54を含む修復テンプレートの存在3下で正確なゲノム編集を導く。NHEJとHDRは、ノックアウトマウスとノックアウトマウスをそれぞれ生成するために利用されています。

CRISPR/Cas9システムは、優れた有効性と忠実度を持つGMマウスの生成を著しく加速していますが、これらの方法を適用する科学者はしばしば技術的な課題に遭遇します。まず、従来のプロトコルは、受精卵6、7の前核にCRISPR編集ツールを導入するためのマイクロインジェクションを必要とします。この手法は時間がかかり、通常は多くのトレーニングが必要です。したがって、いくつかのグループは、エレクトロ,ポレーション8、9、10、11、12、139,10,11でマイクロインジェクション12を13置き換えました。8しかし、初期のエレクトロポレーションプロトコルでは、新鮮な胚がエレクトロポレーションに使用された。これは、各実験の前に新鮮な胚を準備することは困難であるので、別の問題を引き起こした14.

最近、我々および他の人々は、ゲノム編集のための凍結解凍胚とエレクトロポレーションの使用を組み合わせ、GMマウス15,16,16の生成を容易にする。このプロトコルは、高度な胚操作スキルを持たない研究者が、高効率でヒト疾患の動物モデルを迅速に生成することを可能にする。このプロトコルはまた、創業者16における遺伝的不均一性などのGMマウスの生成における実用的な課題を大幅に軽減する。モザイクを克服するために、ゲノムの最初の複製の前に編集が行われることを確実にするために、胚解凍後1時間以内にCRISPR試薬のエレクトロポレーションを行います。別の改善は望ましくないモザイク化を減らすためにCas9 mRNAの代わりにCas9タンパク質の使用を含む17.さらに、2細胞段階16に対する発達速度を高める一細胞胚凍結保存法の最適な方法を開発しました:胎児ウシ血清(FBS)の使用は、凍結解凍未受精卵母細胞をより弾力性のある18にする同じメカニズムによって、受精後の凍結解凍卵母細胞の生存を劇的に改善します。

ここでは、1細胞C57BL/6J胚の凍結保存のための改変方法を含む、凍結解凍胚を用いたGMマウスの生成のための包括的なプロトコルを提示する。それは1)gRNA設計、CRISPR試薬の調製およびアセンブリを含んでいる;2)IVF、凍結保存、および一細胞胚の解凍。3) CRISPR試薬を凍結解凍胚にエレクトロポレーションする。4)偽妊娠雌マウスの卵管への胚移植;そして5)F0の創始動物のジェノタイピングとシーケンス分析。

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プロトコル

本研究で行われたすべての動物のケアと手順は、実験動物のケアと使用のためのガイドの規則と規則に従って行われました。実験プロトコルは、東京都立大学、東京大学、吉知大学、マックスプランクフロリダ神経科学研究所の動物実験委員会によって承認されました。すべての試薬に関する情報は、材料表に示されています。

1. CRISPR試薬の設計

  1. crRNA設計
    1. CRISPRダイレクト19(https://crispr.dbcls.jp/)にアクセスして、ターゲット外サイトを削減した特定のcrRNAを設計してください。
      注:crRNA20(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/wereview/crisprtools/)を設計するための他の多くの便利なツールがあります。
    2. 標的の塩基配列を挿入し、次の変更を行います。
      PAM シーケンス要件 = NGG
      特異性チェック=マウス(筋肉筋)ゲノム、GRCm38/mm10(2011年12月)
      注:一例として、チロシナーゼ(Tyr)ノックアウトマウスを生成するために、エキソン2(9476~9692の塩基配列)を標的とした。
    3. [デザイン] をクリックし、特定のヒット数が多い場合は、[高度に特定のターゲットのみを表示] をオンにします。
    4. 潜在的なターゲット外の影響を減らすために、"12 mer+PAM"と"8 mer+PAM"の列の中で最小値を持つターゲット シーケンスを選択します。
      注: これらの列では、("1")シーケンスが意図したターゲット サイトと完全に一致する場合は 1 つだけ、1 より大きい番号は、潜在的な対象外サイトの存在を示します。
    5. 得られたオリゴヌクレオチドをcrRNA合成企業(サプリメンタリー表1)から注文する。
      注: エキソン 2 Tyr 遺伝子の場合、次の標的配列が使用されました: GGACCACTATTACGTAATCC、+TGG を PAM 配列として使用します (図 2A)。
  2. HDR媒介編集実験のための一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN)設計(すなわち、ノックインマウス生成)。
    1. ssODNの長さは、両側に30-60ヌクレオチド(nt)相同性アームを含む約80〜180 bpに設計します。
      注: 75-85 nt の長さの ssODN は、30-35 nt 相同性アームを含み、gRNA を補完し、高いノックイン編集効率21を示しました。
    2. 意図された改変とサイレント変異をPAM配列に挿入するか、可能でない場合は、ゲノム編集後に再切削をブロックするためにPAMの5′隣接基盤に挿入します。
      注: この研究で使用される crRNA および ssODN は補足表 1に記載されています。

2. 体外受精、胚凍結保存、凍結融解

  1. 体外受精
    1. 妊娠した雌性ゴナドトロピン(PMSG)を用いたIP注射によるC57BL/6J雌マウス(4または8週齢)をスーパーボヴレートし、その後7.5 IUヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を48時間後に注射した。
      注:排卵卵細胞の数は、超超排卵22を使用して約3倍増加させることができます。
    2. 性成熟したC57BL/6J雄マウス(3〜5ヶ月)からカウダ精巣上体を取り除く。
      注:雄マウスを犠牲にすることなく精子を採取することが可能です。
    3. 解剖針で精子の血栓を抽出し、1.5時間のCO2インキュベーターでヒト卵管液(HTF)の200 μLドロップで、容量を培養します。
    4. hCG注入後16~18時間の卵管からcumulus-oocyte複合体(COC)を回収し、CO2インキュベーター(5%CO2,37°C)でパラフィン液で覆われた200μLの新しい滴で2時間以内2にインキュベートします。
      注:CO2吸入による安楽死はIVFおよび胚発生に影響を及ぼすため、麻酔下での頚部脱臼によってマウスを犠牲にすることが好ましい。
    5. インキュベーション培地の境界からCOCsを含むHTF培地の200 μLドロップに1〜5μLの精子懸濁液を加え、3時間のCO2インキュベーターにインキュベーターします。
    6. 卵母細胞をカリウム添加シンプレックス最適化培地(KSOM)3xで洗浄し、残りの精子および乳液細胞を除去します。
    7. 逆顕微鏡を用いて、原核形成と1細胞胚のグレードを確認します。
  2. 一細胞胚の凍結保存
    1. CO2インキュベーターで10分間、20%FBS(パラフィン液で覆われない)を含むHTFの200μLドロップで1細胞胚を10分間インキュベートします。
    2. 20~100個の胚を50μLの1Mジメチルスルホキシド(DMSO)溶液24に移す。
    3. 100個の胚を含む溶液を5μLをクライオチューブの底に移し、チラーまたは氷上で0°Cで5分間冷却します。
    4. DAP213(2Mジメチルスルホキシド、1 Mアセトアミド、3 Mプロピレングリコール)溶液をチューブウォールに沿ってゆっくりと加え、チューブをキャップし、チラーまたは氷上で0°Cで5分間保ちます。
      注:サンプルの解凍中に簡単に取り除くためにキャップをしっかりと締めすぎないでください。
    5. 液体窒素で急速にチューブを保管してください。
  3. 胚解凍
    1. 凍結管の蓋を開け、残りの液体窒素を捨て、37°Cに予熱した0.25Mスクロース溶液の900μLを加えます。
      注:冷たい溶液を使用すると解凍後の胚の生存率が低下するため、0.25 Mショ糖溶液は37°Cに事前に温める必要があります。
    2. 10xのために素早くピペットし、クリオチューブの内容物をプラスチック皿に移します。
      注意:気泡が発生し、胚に損傷を与えないように、ピペット処理は慎重に行う必要があります。
    3. パラフィン液で覆われたKSOM培地で形態学的に正常な受精卵母細胞2xを洗浄し、エレクトロポレーションまでCO2インキュベーターに保管します。

3. CRISPR試薬の組立とエレクトロポレーション

メモ:エレクトロポレーションには、白金板電極(高さ:0.5mm、長さ:10mm、幅:3mm、ギャップ:1mm)と、前述のワンステップ型エレクトロポレーター8(材料表)を使用しました。2段階型エレクトロポレーターも使用できます (表)。

  1. CRISPR試薬の調製と組立
    1. CrispR試薬(すなわち、crRNA、tracrRNA、およびCas9タンパク質)およびSsODNをオーダーしてHDR媒介編集実験を行う場合(材料表および補足表1)。
    2. 焼鈍液を以下のように準備する。
      1. 1 μg/μL crRNAと1 μg/μL tracrRNAを還元血清最小必須培地溶液(材料表)に調製し、各溶液の6 μLをヌクレアーゼフリーバッファーの42 μLに加えます。
      2. 95°Cの乾燥ヒーターで混合物を3分間インキュベートし、RTで5分間冷却します。
      3. オプティ-MEM Iで希釈した1 μg/μL HiFi Cas9タンパク質を調製し、前の混合物に6 μLを加えて、合計60 μLの容量を得ます。
      4. HDRを介した編集実験を行う場合は、6 μLの1 μg/μL ssODNを追加します。最終容積は60μLでなければならないので、ステップ3.1.2.1でヌクレアーゼを含まない水を36μL使用してください。
        注意: crRNA、トラクルRNA、Cas9タンパク質、およびssODNの最終濃度は100 ng/μLになります。
      5. 1ホールスライドガラスに最大100個の胚を25μLの最終混合物(RNP複合体)に移し、37°Cで10分間インキュベートします。
  2. エレクトロポレーション
    1. CRISPR試薬の新しい混合物の6 μLで電極ギャップを埋め、混合物に20-25胚を加えます。
      注:電気パルス中に胚に損傷を与える可能性のある胚とエレクトロポレーション電極との接触を避けることは重要です。
    2. ワンステップ式エレクトロポレーターの次の条件でエレクトロポレーションを行います。
      電圧:25V、パルス方向(Pd) +
      オン: 3 ミリ秒、オフ: 97 ms
      繰り返し: 5倍
      注: エレクトロポレーションは、モザイクを防ぐために最初のDNA複製の前にゲノム編集が行われるように解凍後に1時間以上実行する必要があります。
    3. 2段階型エレクトロポレーターの場合、次のように条件を設定します。
      ポーリングパルス = 40V、Pd +
      ON = 1 または 2.5 ミリ秒。パルス間隔 = 50 ミリ秒
      繰り返し:4倍、ディケイ10%

      転送パルス = 5または7V;Pd +/-.
      オン: 50 ミリ秒;パルス間隔 = 50 ミリ秒
      繰り返し = 5x;減衰 = 40%
      メモ:インピーダンスをメーカーが指定した範囲内に保つためには、音量を調整することが重要です。
    4. 改変クレブスリンガー重炭酸水素緩衝液2(M2)培地で胚3倍を洗浄し、続いてパラフィン液で覆われたKSOM培地を滴下して2回洗浄する。
    5. 洗浄した胚(KSOM培地中)をCO2インキュベーターで一晩インキュベートし、さらなる移植を行う。

4. 胚の移動

  1. 疑似妊娠雌マウスを準備します。胚移植(ET)の1日前に精管切除された雄マウスを有するICR雌マウス(3~6ヶ月)
    注:マウスは、交付プラグのために翌朝チェックする必要があります。プラグを持つマウスは疑似妊娠と見なされ、ETに使用することができます。
  2. 吸気空気とKSOM(パラフィン液なし)は、移植を成功させるためのマーカーとしてガラスキャピラリーに2〜3mmの交互間隔で行った。
  3. 20~24個の胚をKSOM(パラフィン液なし)の200μLドロップに導入し、10~12個の胚をガラスキャピラリーに引き込み、各卵管に移植します。
  4. イソフルラン(吸入)またはメデトミジン/ミダゾラム/ブトルファンノール(0.3mg/kg、4.0 mg/kg、5.0mg/kg)を組み合わせた溶液のIP注入によって雌マウスを麻酔する。麻酔マウスを加熱パッドの腹側に置きます。保湿ゲルで麻酔マウスの目を保護します。
  5. 背側中線の下部に沿って剃り、ポビドーネで領域を消毒し、その後70%エタノールを使用します。
  6. 長い〜1cmの切開を、後線に平行にします。
  7. 卵管を取り出し、無菌プラスチックドレープの上に置きます。暖かい滅菌生理生理を使用して湿った状態に保ちます。
  8. 立体顕微鏡の下に卵管を置きます。
  9. インファンディブラムとアンフェッラの間の卵管の壁にマイクロスプリングハサミでアンフェッラの数ミリメートル上流に穴を開けます。
  10. 穴に胚を含むガラスの毛細血管の先端を挿入し、アンフリーに気泡が見えるまで胚を排出するために毛管ホルダーのマウスピースに穏やかに吹き込みます。
    注:卵管あたり10〜12胚の間の移動。
  11. ガラスの毛細管を卵管の壁から引き出し、生殖器官を体腔にそっと押し込みます。
  12. 前のプロセスを繰り返して、他の卵管に胚を導入します。
  13. ET手順を完了すると、腹膜を単純な中断縫合パターン(50、吸収可能、編組合成縫合)で縫合し、単純な中断パターンまたは埋め込まれた切り込み縫い目パターン(60)を持つ皮膚を縫合します(60非吸収性、単合成縫合糸)。
  14. 麻酔から回復するまで、37°Cの温めプレートでマウスを暖かく保ちます。
  15. 手術後7日間、動物の健康状態を毎日監視する。

5. ジェノタイピングとシーケンス解析

  1. ゲノムDNA抽出
    注:私たちは、メーカーの勧告に従って、マウスの耳組織からゲノムDNAを抽出するためにNucleoSpin組織DNA抽出キットを使用しました。
    1. バッファーT1の180 μLおよび25 μLのプロテイナーゼK溶液をサンプルに加え、10秒のボルテックスで混合します。
    2. 56°Cで2時間、または完全にリシスが得られるまでインキュベートする。インキュベーションの30分ごとに10 sのための渦。
    3. バッファーB3を200μL、30sの渦を激しく加え、70°Cで10分間インキュベートします。
    4. 210 μLのエタノールをサンプルに210μL、渦を激しく加えます。
    5. 各サンプルに対して、1つの組織カラムをコレクションチューブに入れ、サンプルをカラムに塗布します。
    6. 11,000 x gで1分間遠心分離機を使用し、フロースルーを破棄し、カラムを回収管に戻します。
    7. 500 μL のバッファー BW を加えてサンプルを洗浄(1st洗浄)、遠心分離機を11,000 x gで1分間、フロースルーを破棄し、カラムを回収管に戻します。
    8. 600 μL のバッファー B5 をカラムに加え(2回目の洗浄)、遠心分離機を 11,000 x gで 1 分間、フロースルーを破棄し、カラムを回収管に戻します。
    9. 柱を11,000 x gで1分間遠心分離し、シリカ膜を乾燥させ、ヌクレオスピン組織カラムを1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに入れる。
    10. バッファBEを100μL加え、室温で1分間インキュベートし、11,000x gで遠心分離機1分を加えます。
  2. PCR 増幅と精製
    1. プライマーを設計するには、対象となる軌跡を囲む400~500 bpの配列を増幅するために、プライマー3プラスウェブサイト(https://primer3plus.com/)を使用します。
    2. 新しい PCR プロトコルを設計し、それを実証的にテストします。
    3. PCR産物を精製して、不要な酵素、ヌクレオチド、プライマー、および緩衝成分を除去します。標準的な精製方法は以下のように使用することができる。
      1. 50 μL のフェノールを PCR 製品の 50 μL に加え、ボルテックスで混合します。
      2. 11,000 x gで1分間遠心分離機を使用し、上部透明層を新しいチューブに移します。
      3. 120 μLの99.5%エタノール、20 μLの酢酸アンモニウムと渦を30秒加えます。
      4. RTで10分間、遠心分離機を11,000 x gで10分間保管してください。
      5. 上清を捨て、70%エタノールの1mLでDNAペレットを洗浄します。
      6. ペレットをRTで10分間乾燥させ、RNaseフリーウォーターを10μLに溶かします。
        注: フェノールは人間に有毒であるため、PCR カラムベースの精製キットは再コメントされます。
  3. サンガーシーケンシング
    1. 精製したPCRアンプリコンを定量化するために、DNA定量分析(材料表を参照)を実行します。
    2. PCR 製品とシーケンスプライマーをシーケンシング サービス プロバイダに送信します。
    3. 利用可能なオンライン Web サイトを使用してシーケンスを分析します。
      注:この研究では、CRISP-ID25 25(http:/crispid.gbiomed.kuleuven.be/)が配列分析に使用されました。

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結果

10分間のFBSを20%含むHTFの培養を含む1細胞胚の凍結保存のための当社の改変方法、1M DMSOおよびDAP213溶液に凍結保存を行い、凍結解凍胚の発生率を2細胞段階に改善した(図1、p=0.009、学生のt検定)。凍結解凍胚はGMマウスの産生に使用され、エレクトロポレーション条件が最適化されました:プロトコルセクションに記載されているようにエレクトロポレーターを使用して25 V?...

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ディスカッション

記載されたプロトコルは、高効率かつ低いモザイク率を有するGMマウスの生成を可能にする(表1)。これは、生殖工学とゲノム編集技術の両方で最新かつ最も有用な進歩を利用して変異マウスを簡単に作成する高度な胚操作スキルを持たない研究者を可能にします: CRISPR/Cas9リボヌクレオプロテイン (RNP) と凍結解凍胚へのエレクトロポレーション.これらの進歩は、GMマウスの生成を?...

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開示事項

著者らは関連する財務上の開示を持っていません。

謝辞

澤田ひとみとエリザベス・ガルシアの動物ケアに感謝します。この研究は、KAKENHI(15K20134、17K11222、16H06276、16K01946)、北銀研究助成(H.N.)、吉地医科大学若手研究者賞(H.U.)によって支援されました。大塚と見学奨学財団は、M.D.を支援しました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25 M SucroseARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan)SUCROSE
1 M DMSOARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan)1M DMSO
ButorphanolMeiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan)Vetorphale 5mg
Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)1081060
C57BL/6J miceJapan SLC (Hamamatsu, Japan)N/A
DAP213ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan)DAP213
FBSSigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)ES-009-C
hCGMOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan)HCG Mochida 3000
HTFARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan)HTF
ICR miceJapan SLC (Hamamatsu, Japan)N/A
IsofluranePetterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO)07-893-1389
KSOMARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan)KSOM
LN2 TankChart Industries (Ball Ground, GA)XC 34/18
M2ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan)M2
MedetomidineNippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan)1124401A1060
MicroscopeNikon Co. (Tokyo, Japan)SMZ745T
MidazolamSandoz K.K. (Tokyo, Japan)1124401A1060
Nuclease free bufferIntegrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)1072570
Nucleospin DNA extraction kitTakara Bio Inc (Kusatsu, Japan)740952 .5
One-hole slide glassMatsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan)S339929
One-step type ElectroporatorBEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan)CUY21EDIT II
Paraffin LiquidNACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan)SP 26137-85
Platinum plate electrodeBEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan)LF501PT1-10, GE-101
PMSGASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan)SEROTROPIN 1000
Povidone iodideProfessional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY)C12400
Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM ISigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)22600134
Two-step type ElectroporatorNepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan)NEPA21

参考文献

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