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摘要

在这里，我们提出了一种用于冷冻保存单细胞胚胎的改良方法，以及一种用于使用冷冻解冻胚胎和电穿孔以有效生成转基因小鼠的协议。

摘要

转基因小鼠的使用已成为理解基因功能和破译人类疾病的基本机制的关键。CRISPR/Cas9 系统允许研究人员以前所未有的效率、保真度和简单性修改基因组。利用这项技术，研究人员正在寻求一种快速、高效和简单的生成转基因小鼠的协议。在这里，我们介绍了一种改进的单细胞胚胎冷冻保存方法，该方法导致冷冻解冻胚胎的发育速度更高。通过将其与优化的电镀条件相结合，该协议允许在短时间内生成高效率和低镶嵌率的挖空和敲敲小鼠。此外，我们逐步解释我们优化的协议，包括CRISPR试剂制备、体外受精、一细胞胚胎的冷冻保存和解冻、CRISPR试剂的电穿孔、小鼠的生成和创始人的基因分型。使用这种协议，研究人员应该能够以无与伦比的轻松、速度和效率制备转基因小鼠。

引言

集群定期间隔短蛋白重复（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）系统是一个科学突破，提供了前所未有的有针对性的修改在基因组1。CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白和引导RNA（gRNA）组成，含有两个分子成分:一个目标特异性CRISPRRNA（crRNA）和一个转激活的CRISPRRNA（气管RNA）2。gRNA将Cas9蛋白定向到基因组中的特定位点，20个核苷酸与crRNA互补，并靠近原间隔体相邻的图案（PAM）。Cas9蛋白与目标序列结合，并诱导双绞线断裂（DSBs），由容易出错的非同源端连接（NHEJ）或高保真同源定向修复（HDR）3，4，5修复。3,4,5NHEJ 导致插入或/和删除（indels），因此在编码序列被靶向时导致功能基因丧失。HDR导致在包含同源序列33，4，54,5的修复模板的情况下进行精确的基因组编辑。NHEJ 和 HDR 已分别用于生成敲敲小鼠和敲敲小鼠。

虽然CRISPR/Cas9系统显著加速了具有卓越功效和保真度的转基因小鼠的生成，但应用这些方法的科学家经常遇到技术挑战。首先，常规协议需要微注射，将CRISPR编辑工具引入受精卵66、77的排卵核。这种技术非常耗时，通常需要广泛的培训。因此，几个组取代显微注射与电穿孔898，9，10，11，12，13。,10,11,12,13,然而，在早期的电穿孔协议中，新鲜胚胎被用于电镀。这就引起了另一个问题，因为每次实验前准备新鲜胚胎是很困难的。

最近我们和其他人将冷冻解冻胚胎和电穿孔结合起来进行基因组编辑，这为转基因小鼠15、16,16的生成提供了便利。该协议使没有高级胚胎操作技能的研究人员能够高效快速生成人类疾病的动物模型。该协议还大大减少了在生成转基因小鼠方面的实际挑战，如创始人16中的遗传异质性。为了克服马赛克，我们在胚胎解冻后1小时内对CRISPR试剂进行电镀，以确保在基因组首次复制之前进行编辑。另一个改进包括使用Cas9蛋白代替Cas9 mRNA来减少不受欢迎的马赛克17。此外，我们开发了一种单细胞胚胎冷冻保存的最佳方法，将发育速率提高到双细胞第16阶段:使用胎儿牛血清（FBS）可以显著提高受精后冷冻解冻卵母细胞的存活率，或许通过使冷冻解冻未受精的卵母细胞更具弹性的18。

在这里，我们提出了一个全面的协议，为使用冷冻解冻胚胎的转基因小鼠的生成，包括单细胞C57BL/6J胚胎冷冻保存的改良方法。它包括1gRNA设计、CRISPR试剂制备和组装;2） 试管婴儿、冷冻保存和单细胞胚胎解冻;3） 将CRISPR试剂电化成冷冻解冻的胚胎;4） 胚胎移植成伪怀孕雌性小鼠的卵子;和5） F0创始人动物的基因分型和序列分析。

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研究方案

本研究中执行的所有动物护理和程序都是根据《实验室动物护理和使用指南》的规则和条例进行的。实验方案经富山大学动物动物委员会、东京大学、吉池大学和马克斯·普朗克佛罗里达神经科学研究所批准。有关所有试剂的信息都显示在材料表中。

1. CRISPR 试剂设计

  1. crRNA 设计
    1. 访问 CRISPR 直接19 （https://crispr.dbcls.jp/），以设计具有减少非目标站点的特定 crRNA。
      注: 还有许多其他有用的工具来设计 crRNA20 （https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/wereview/crisprtools/）。
    2. 插入目标核苷酸序列并进行以下更改:
      PAM 序列要求 = NGG
      特异性检查 = 小鼠（肌肉）基因组，GRCm38/mm10（2011 年 12 月）
      注:作为一个例子，为了生成酪氨酸酶（Tyr）敲除小鼠，针对exon 2（9476-9692的核苷酸序列）。
    3. 单击"设计"，对于高度特定的点击次数，标记"仅显示高度特定的目标"。
    4. 要减少潜在的非目标效应，请选择"12 mer_PAM"和"8 mer_PAM"列中值最低的目标序列。
      注: 在这些列中，（"1"）表示序列与预期目标站点只有一个完全匹配，数字大于一个表示存在潜在的非目标站点。
    5. 从crRNA合成公司订购产生的寡核苷酸（乘法表1）。
      注:对于外子2Tyr基因，使用了以下目标序列:GGACCACTATTACGTAATCC，以+TGG作为PAM序列（图2A）。
  2. 单股寡氧核苷酸（ssODN）设计，用于HDR中介编辑实验（即敲鼠生成）。
    1. 将 ssODN 长度设计为约 80~180 bp，包括两侧 30~60 个核苷酸 （nt） 同源臂。
      注: ssODN 75~85 nt长度，包括30~35nt和号臂和gRNA的补充，显示高敲击编辑效率21。
    2. 在 PAM 序列或（如果可能）在 PAM 的 5° 相邻基座插入预期修饰和静默突变，以阻止基因组编辑后的重切。
      注:本研究中使用的crRNA和ssODN列在补充表1中。

2. 体外受精、胚胎冷冻保存和冷冻解冻

  1. 体外受精
    1. 超级排卵C57BL/6J雌性小鼠（4或8周大）通过IP注射与怀孕的母马血清促生蛋白（PMSG），然后注射7.5 IU人类胆囊性促性腺激素（hCG）后48小时。
      注:使用超超排卵22，排卵卵卵细胞的数量可增加约3倍。
    2. 从性成熟C57BL/6J雄性小鼠（3-5个月大）中去除卡达表皮。
      注:在不牺牲雄性小鼠的情况下收集精子。
    3. 用解剖针提取精子凝块，并在CO2培养箱中200μL的人类输卵管液（HTF）中孵育1.5小时，用于翻药。
    4. 在 hCG 注射后从卵管 16-18 h 中收集积液-卵石复合物 （COCs），并在 CO2培养箱（5% CO 2， 37 °C）中用新的 200 μL 滴的 HTF 介质（5% CO2，37 °C）孵育，不超过 2 小时。
      注:最好在麻醉下通过宫颈脱位来牺牲小鼠，因为通过CO2吸入的安乐死会影响IVF和胚胎发育23。
    5. 将1~5 μL的精子悬浮液从孵育介质的边界加入含有COCs的HTF介质的200μL滴，并在CO2培养箱中孵育3小时。
    6. 用富含钾的单纯优化介质 （KSOM） 3x 清洗卵母细胞，去除剩余的精子和积细胞。
    7. 使用倒置显微镜检查原核形成和单细胞胚胎的等级。
  2. 单细胞胚胎的冷冻保存
    1. 在CO 2培养箱中孵育含有20%FBS（未覆盖石蜡液体）的200μL HTF滴中的单细胞胚胎10分钟。
    2. 将20~100个胚胎转移到50μL的1M二甲基亚硫酸盐溶液24。
    3. 将含有100个胚胎的溶液的5μL转移到冷冻管底部，在0°C下使用冷水机组或冰冷5分钟。
    4. 沿着管壁缓慢加入45 μL的DAP213（2M二甲基亚硫酸盐、1M乙酰胺和3M丙二醇）溶液，盖住管，并在0°C的冷水机组或冰上保持5分钟。
      注:请勿将盖子紧紧固定，使其在样品解冻期间容易取下。
    5. 将管迅速储存在液氮中。
  3. 胚胎解冻
    1. 打开冷冻管盖，丢弃剩余的液氮，加入900 μL的0.25M蔗糖溶液预热至37°C。
      注:0.25 M蔗糖溶液必须提前加热至37°C，因为使用冷溶液会降低解冻后的胚胎生存能力。
    2. 快速吸管10倍，并将低温管的内容转移到塑料盘中。
      注:移液应小心进行，以免产生气泡并损坏胚胎。
    3. 在覆盖石蜡液体的KSOM介质中清洗形态正常受精卵母细胞2倍，并将其保存在CO2培养箱中，直到电化。

3. CRISPR试剂的组装和电镀

注:对于电穿孔，我们使用铂板电极（高度:0.5 毫米，长度:10 毫米，宽度:3 毫米，间隙:1 毫米）和一步型电穿孔器，前面描述的8 （材料表）。也可以使用两步型电波器（材料表）。

  1. CRISPR试剂的制备和组装
    1. 如果进行HDR介导的编辑实验（材料表和补充表1），则订购CRISPR试剂（即crRNA、气管和Cas9蛋白）和ssODN。
    2. 准备退火溶液，如下所示。
      1. 在减少血清最小基本介质溶液（材料表）中制备1 μg/μL crRNA和1 μg/μL气管RNA，并将每种溶液的6μL加入42μL的无核酸酸缓冲液。
      2. 在 95°C 下在干式加热器中孵育混合物 3 分钟，在 RT 处冷却 5 分钟。
      3. 制备 1 μg/μL HiFi Cas9 蛋白，在 Opti-MEM I 中稀释，并将 6 μL 添加到以前的混合物中，总体积为 60 μL。
      4. 在进行HDR介导的编辑实验中，加入6μL的1μg/μLssODN。由于最终体积应为 60 μL，因此在步骤 3.1.2.1 中使用 36 μL 无核酸酶。
        注:crRNA、气管RNA、Cas9蛋白和ssODN的最终浓度为100纳克/μL。
      5. 将多达100个胚胎转移到一孔滑动玻璃中最终混合物（RNP复合物）的25μL，并在37°C下孵育10分钟。
  2. 穿孔
    1. 用CRISPR试剂新混合物的6μL填充电极间隙，并将20~25个胚胎添加到混合物中。
      注:重要的是要避免胚胎和电镀电极之间的任何接触，这可以在电脉冲期间损坏胚胎。
    2. 在以下条件下为单步型电穿孔器执行电穿孔:
      电压: 25 V，脉冲方向 （Pd） |
      开: 3 毫秒， 关闭: 97 ms
      重复: 5x
      注:解冻后应进行电穿孔不超过1小时，以确保在第一次DNA复制之前进行基因组编辑，以防止马赛克。
    3. 对于两步型电波器，请按如下方式设置条件:
      波波脉冲 = 40V，Pd |
      打开 = 1 或 2.5 毫秒;脉冲间隔 = 50 毫秒
      重复: 4x， 衰减 10%

      传输脉冲 = 5 或 7V;Pd +/-。
      打开: 50 毫秒;脉冲间隔 = 50 毫秒
      重复 = 5 倍;衰减 = 40%。
      注: 调整音量以在制造商指定的特定范围内保持阻抗非常重要。
    4. 用经过改良的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液2（M2）介质清洗胚胎3倍，然后用一滴覆盖石蜡液体的KSOM介质清洗两个洗涤液。
    5. 将洗净的胚胎（KSOM介质）孵育在CO2培养箱中过夜，以便进一步移植。

4. 胚胎移植

  1. 准备伪怀孕的雌性小鼠。在胚胎移植（ET）前1天，将ICR雌性小鼠与输精管化雄性小鼠交配ICR（3~6个月）。
    注:第二天早上应检查老鼠的配合塞。带插头的小鼠被视为伪怀孕，可用于ET。
  2. 以2~3mm的交替间隔将空气和KSOM（不含石蜡液体）吸气到玻璃毛细管中，作为成功植入的标记。
  3. 将20~24个胚胎引入200μL的KSOM（不含石蜡液体），并将10~12个胚胎放入玻璃毛细管中，植入每个卵管中。
  4. 通过异丙酮（吸入）或IP注射结合甲二酰胺/米达索兰/但亚诺醇（0.3毫克/千克、4.0毫克/千克和5.0毫克/千克）的溶液对雌性小鼠进行麻醉。将麻醉小鼠放在其通风侧加热垫上。使用保湿凝胶保护麻醉小鼠的眼睛。
  5. 沿着背道中线的下部进行扫描，用波维多尼碘消毒该地区，然后用70%的乙醇消毒。
  6. 使一个长 ±1 厘米切口平行于背部中线。
  7. 拿出排卵管，放在无菌塑料窗帘上。使用温暖的无菌盐水保持湿润。
  8. 将排卵置于立体显微镜下。
  9. 用微弹簧剪刀在安普拉上游几毫米的电道和安普拉之间的电道壁上打一个洞。
  10. 将含有胚胎的玻璃毛细管尖端插入孔中，轻轻吹入毛细管支架的喉舌，以排出胚胎，直到气泡在气泡中可见。
    注:每排卵10~12个胚胎之间转移。
  11. 从排卵管壁中取出玻璃毛细管，将生殖器官轻轻推回体腔。
  12. 重复前一个过程，将胚胎引入其他排卵管。
  13. 完成 ET 程序后，用简单的中断缝合图案（50、可吸收、编织的合成缝合）缝合牙周，然后用简单的中断图案或埋藏的潜心中断缝合图案（60） 缝合肌周。不可吸收，单合成缝合）。
  14. 在37°C的加热板上保持鼠标温暖，直到它从麻醉中恢复过来。
  15. 手术后7天每天监测动物的健康状况。

5. 基因分型和序列分析

  1. 基因组DNA提取
    注:我们使用核素平组织DNA提取试剂盒，根据制造商的建议从小鼠耳组织中提取基因组DNA。
    1. 将180μL的缓冲液T1和25μL的蛋白酶K溶液加入样品中，通过旋涡10s混合。
    2. 在56°C孵育2小时或直到获得完全的解毒。旋涡每30分钟孵育10秒。
    3. 加入200μL的缓冲液B3，涡旋大力30秒，并在70°C孵育10分钟。
    4. 在样品中加入210μL的100%乙醇，并大力涡旋。
    5. 对于每个样本，将一个组织柱放入收集管中，并将样本应用于该列。
    6. 在 11，000 x g下离心 1 分钟，丢弃流通，并将柱放回收集管中。
    7. 加入500 μL的缓冲BW清洗样品（第一洗），在11，000 x g时离心机1分钟，丢弃流道，并将柱放回收集管。
    8. 将 600 μL 的缓冲液 B5 添加到柱（第二次清洗），在 11，000 x g时离心 1 分钟，丢弃流道，并将柱放回收集管中。
    9. 将柱离心1分钟，在11，000 x g下干燥硅膜，并将核素平组织柱放入1.5mL微离心管中。
    10. 加入100 μL的缓冲液BE，在室温下孵育1分钟，然后在11，000 x g下离心1分钟。
  2. PCR扩增和纯化
    1. 使用引漆3加网站（https://primer3plus.com/）设计引漆，以放大目标位点的400~500 bp序列。
    2. 设计新的PCR协议，并对其进行经验测试。
    3. 净化 PCR 产品，去除不需要的酶、核苷酸、底漆和缓冲成分。标准纯化方法可采用如下方法。
      1. 将50μL的苯酚加入PCR产品的50μL，并通过涡旋混合。
      2. 在 11，000 x g下离心 1 分钟，并将上透明层转移到新管中。
      3. 加入120 μL的99.5%乙醇和20μL的5M醋酸铵和旋涡30s。
      4. 在 RT 中保持 10 分钟，在 11，000 x g下保持离心机 10 分钟。
      5. 丢弃上清液，用1 mL70%乙醇清洗DNA颗粒。
      6. 在RT处干燥颗粒10分钟，溶解在10μL的无RNase无水中。
        注:基于PCR的基于列的净化试剂盒被重新注释，因为苯酚对人类有毒。
  3. 桑格测序
    1. 运行DNA定量分析（参见材料表），以量化纯化PCR放大。
    2. 将 PCR 产品和测序引物发送到测序服务提供商。
    3. 使用可用的在线网站分析序列。
      注:在本研究中，CRISP-ID25 25（http:/crispid.gbiomed.kuleuven.be/）用于序列分析。

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结果

我们改进的单细胞胚胎冷冻保存方法，包括在含有20%FBS的HTF中孵育10分钟，然后采用1 M DMSO和DAP213溶液进行冷冻保存，提高了冷冻解冻胚胎进入双细胞阶段的发育速率（图1，p= 0.009，学生的T-test）。冷冻解冻胚胎用于生产转基因小鼠，电穿孔条件得到优化:使用《议定书》部分所述的电穿孔器，使用25 V和3 ms脉冲和97 ms间隔的5次重复。该协议的适用性通过白化剂酪氨酸酶基因（...

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讨论

所述协议允许生成高效和低马赛克率的转基因小鼠（表1）。它使没有高级胚胎操作技能的研究人员能够轻松培育出突变小鼠，因为它利用了生殖工程和基因组编辑技术的最新和最有用的进步:CRISPR/Cas9核苷酸蛋白（RNP）和电穿孔进入冷冻解冻的胚胎。这些进步促进了转基因小鼠的生成，并加快了生产速度。如图3所示，生成转基因小鼠需要+4周。与其他采用类似方?...

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披露声明

提交人没有相关的财务披露。

致谢

我们要感谢希托米·萨瓦达和伊丽莎白·加西亚的动物护理。这项工作得到了KAKENHI（15K20134，17K11222，16H06276和16K06276和16K01946）和厚金研究补助金（至H.N.）和吉奇医科大学青年调查员奖（至H.U.）的支持。大须贺托希米奖学金基金会支持M.D.

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25 M SucroseARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan)SUCROSE
1 M DMSOARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan)1M DMSO
ButorphanolMeiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan)Vetorphale 5mg
Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)1081060
C57BL/6J miceJapan SLC (Hamamatsu, Japan)N/A
DAP213ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan)DAP213
FBSSigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)ES-009-C
hCGMOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan)HCG Mochida 3000
HTFARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan)HTF
ICR miceJapan SLC (Hamamatsu, Japan)N/A
IsofluranePetterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO)07-893-1389
KSOMARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan)KSOM
LN2 TankChart Industries (Ball Ground, GA)XC 34/18
M2ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan)M2
MedetomidineNippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan)1124401A1060
MicroscopeNikon Co. (Tokyo, Japan)SMZ745T
MidazolamSandoz K.K. (Tokyo, Japan)1124401A1060
Nuclease free bufferIntegrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)1072570
Nucleospin DNA extraction kitTakara Bio Inc (Kusatsu, Japan)740952 .5
One-hole slide glassMatsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan)S339929
One-step type ElectroporatorBEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan)CUY21EDIT II
Paraffin LiquidNACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan)SP 26137-85
Platinum plate electrodeBEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan)LF501PT1-10, GE-101
PMSGASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan)SEROTROPIN 1000
Povidone iodideProfessional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY)C12400
Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM ISigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)22600134
Two-step type ElectroporatorNepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan)NEPA21

参考文献

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