後期無脊椎動物における低侵襲性心拍数測定のためのインピーダンス肺撮影

要約

熱的な挑戦の間に心拍数を測定する急性環境変化の結果として生物の生理学的応答への洞察を提供する。モデル生物としてアメリカのロブスター(ホマルス・アメリカヌス)を使用して、このプロトコルは、インピーダンス・ニューモグラフィーの使用を、後期無脊椎動物の心拍数を測定するための比較的非侵襲的で非致死的なアプローチとして記述する。

要約

世界の気候の広範な変化の結果として、海洋の気温は急速に上昇しています。生物生理学は環境温度の影響を大きく受けているため、さまざまな海洋生物の熱生理学的性能を変化させる可能性があります。アメリカのロブスター(ホマルス・アメリカヌス)をモデル生物として使用して、このプロトコルは、急性熱ストレス下での後期無脊椎動物の心臓性能がどのように変化するかを理解するためにインピーダンス肺撮影の使用を記述する。このプロトコルは、温度ランピング実験中に心拍数のリアルタイム収集を可能にする最小限の侵襲的な技術を提示する。データは、アレニウス破断温度(ABT)、心拍数が温度の上昇に伴って低下し始める温度を計算するために使用されるアレニウスプロットを生成するために簡単に操作されます。この技術は、さまざまな後期無脊椎動物(すなわち、カニ、ムール貝、またはエビ)で使用することができます。プロトコルは、心臓のパフォーマンスに対する温度の影響のみに焦点を当てていますが、追加のストレッサー(例えば、低酸素症または高カプニア)が温度と相互作用して生理学的性能に影響を与える可能性を理解するように変更することができます。したがって、この方法は、海洋無脊椎動物が環境の急激な変化にどのように反応するかをさらに理解するために、幅広い応用が可能である。

概要

ここ数十年で、温室効果ガス(すなわち、二酸化炭素、メタン、および亜酸化窒素)の大気中への流入の増加は、環境変化の広範なパターンを生じてきた^1。世界の海洋は急速に温暖化している^2,,3,生物生理学に深刻な影響を与える可能性がある傾向.温度は生理学的速度に大きく影響し、生物はパフォーマンス^44、5、65,に最適な温度範囲を有^する。したがって、個人は、この範囲外の温度が外れたため、組織への適切な酸素供給を維持する際に困難に遭遇する可能性があります。これは、温暖化する海洋温度^5、7に直面して有酸素性能の低下につながる可能性⁵を^{秘めています}。

実験室での環境環境における、環境変化の生理的影響を理解する方法は、熱ストレスの状況で心臓の性能を調べることである。これにより、予測された温暖化条件への暴露がパフォーマンス曲線^55,66を変化させる方法と、順応可塑性8の可能性についての洞察が得^られます。海洋無脊椎動物の心拍数を以前に測定するために、様々な方法がうまく実施されています。しかし、これらの技術の多くは、外骨格の外科的除去または主要な操作を伴い、測定装置^{99、10、1110}の長期移植を伴い、被験者にさらなるストレスを与え^、11実験前の回復に必要な時間を長くする。さらに、侵襲性の低い技術(例えば、視覚観察、ビデオ撮影)は、生物が完全または^{半透明である}可能性がある初期の生命史段階に制限されてもよい。さらに、より技術的に高度な方法論(例えば、赤外線トランスデューサーまたはドップラー灌流^8,8、11)に精通していない研究者にさらなる課題が提示される可能性がある。

このプロトコルは、温度暴走実験中の心拍数の変化を評価するためのインピーダンス肺分圧の使用を実証するために、後期の海洋無脊椎動物モデルとしてアメリカのロブスター(ホマルス・アメリカヌス)を使用する。インピーダンスニューモグラフィは、心膜の両側に配置された2つの電極に振動電流(AC)を通過させ、心臓が収縮して^13,14,14に弛緩する際の電圧の変化を測定することを含む。この技術は、外骨格のすぐ下に穏やかに埋め込まれた小さな電極(すなわち、0.10〜0.12 mm)を使用するので、低侵襲である。最後に、データロガーを使用してランプ中の心拍数と水温の両方をリアルタイムで評価します。

プロトコルはまた、アレニウス破断温度(ABT)、心拍数が上昇温度^13、15と共に減少し始める温度を計算するための指示^を15提供します。ABTは、臨界熱最大(CT_マックス、心機能^5、66の上限)を測定する上で好まれる可能性のある被験者における能力の熱限界の非致死⁵的指標として機能し、致死的限界はしばしば極端であり、自然環境⁵ではめったに遭遇しない。

プロトコル

1. 機器のセットアップ

1. ラップクリアで可鍛性のチューブを囲んで、直径約8〜10cmの熱交換コイルを作成し、長さ40〜70cmの延長線を持ちます。電気テープを使用してコイルを固定します。
2. 熱交換コイルを外部電源に取り付け、冷却/加熱循環水浴のフィッティングを返します。ホースクランプを使用して接続が確実に固定されていることを確認します。
3. 冷却/加熱循環水浴の井戸に逆浸透(RO)水を充填し、電源コードをコンセントに差し込みます。水浴をオンにし、熱交換コイルに接続して漏れがないことを確認します。
4. インピーダンス・コンバートをセットアップするには、黒色のBNCケーブルをユニットのAC出力に差し込み、チャンネル1ポートを使用してデータロガー(表)に接続します。
5. 熱電対プローブ(温度レコーダー)をT型ポッドに差し込み、Tタイプのポッドをデータロガーのチャンネル2ポートに差し込みます。
6. データロガーの電源コードを電源に接続し、USBケーブルコネクタを使用してデータロガーをPCコンピュータに接続します。
7. 7.5 Lの人工海水(海水量=35 ppt、pH=8.1、温度=〜12°C)で順応チャンバーと実験場を充填します。
   注:順応室に必要な水の体積、温度、および化学と実験場の開始条件は、実験計画に依存しています。重要なことに、これらの容器は、被験者を快適に水没させるのに十分な大きさでなければならない。

2. 電極の埋め込み

1. 体が快適に長方形の一端にY字型になるように、実験的なアリーナに簡単に収まるプラスチック製の格子にロブスターを置きます。
2. 小さなケーブルタイを使用して、ロブスターの爪と腹部をプラスチック製の格子に慎重に固定します。ケーブルタイは動きを防ぐのに十分タイトであるべきですが、実験が完了したときに外科用ハサミが取り除く余地を与えます。
3. ペーパータオルでカラパスを乾かし、70%エタノールに浸した綿のボールできれいにします。
4. 電極の穴を作成します。
   1. 小さなドリルビット(例えば、1.6mm)を使用して、心膜の両側のカラパスを通して2つの小さな穴(ほぼ)をゆっくりと慎重に手で掘削します。
   2. 滅菌解剖針をそっと挿入して、各穴を仕上げます。
   3. 針がカラパスを簡単に通過しない場合は、針をもう一度試す前にゆっくりと手でドリルを続けてください。
      注:実験動物のストレスを最小限に抑えるために、実験前にこの技術を実践することを強くお勧めします。時間が経つにつれて、ユーザーはドリルビットがカラパスとほぼ同時に針に切り替わったときに感じることによって簡単に判断することができます。手掘りは、特に外骨格が柔らかい場合(すなわち、動物が最近溶融している)、ロブスターやカニに適しています。しかし、被験者がより厚い外骨格またはシェル(すなわち二枚貝)を有する場合、ドレメルツールがより適切である。
5. 電極(直径0.10~0.12mm)の電極を取得し、解剖ナイフブレードを使用してワイヤの先端の絶縁材を少し削り取ります。各ワイヤの先端を鉗子を使用して小さなフックに慎重に曲げ、新しく掘削された穴のそれぞれに1つを挿入します。
6. 各ワイヤリードを、シアノアクリル酸接着剤の小さな滴を使用して固定し、5〜10分間乾燥させます。
   注:接着剤を控えめに使用することは重要です, あまりにも多くを追加すると、ワイヤを再絶縁し、信号が記録されるのを防ぐために、.
7. 接着剤が乾いたら、ワイヤをインピーダンス変換器に取り付け、電源を入れます。ロブスターを順応室に入れ、埋め込み電極に15〜20分間順応させます。
   注:速い動きや耳障りの動きだけでなく、不完全に乾燥した接着剤は、電極がカラパスから切り離される原因になることがあります。この場合は、ステップ 2.6 に戻ります。
8. データロガーをオンにして、コンピュータ上のLabChartソフトウェアを開きます。[新しい実験] をクリックし、[チャート ビュー ] 画面を開いたままにします。
9. [チャート ビュー] で、画面の右側のセクションからチャネル 1 のチャネル機能メニューを探します。メニューから入力アンプを選択し、ACカップリングを選択します。テスト対象からの着信信号がリアルタイムで画面に表示されます。
   注: チャンネルの感度は、[範囲] ポップアップメニューを選択して調整できます。信号のピークがフルスケールの25%~75%になるまで範囲を調整します。[OK]をクリックして入力アンプを閉じます。
10. インピーダンス・コンダクタで、データ・ロガー出力で強い信号が観測されるまでゲイン(サイズ)とバランスを調整し、バランスをゼロに近く保つことを目指します。
11. チャンネル2で、リアルタイムの温度データを記録するためにTタイプポッドを選択します。
12. 両方のチャネルが正しく設定されたら、[開始]ボタンをクリックすると、データ ロガーがデータのログを開始します。

3. 温度の暴走

1. 順応期間の後、取り付けられたロブスターと一緒にプラスチック製の格子を慎重に実験場に入れ、熱交換コイルを火格子の上に置きます。
2. 熱電対プローブをロブスターの近くに置き、試験対象に対する視覚的ストレスを軽減するために、実験場に蓋を置く前に完全に水没していることを確認します。
3. 必要に応じて残高を調整し、トライアルが開始されたことを示すコメントを出力に配置します。
4. 出力は、実験全体を通して定期的に保存することができます。
   1. [ファイル] をクリックし、[名前を付けて保存]を選択して、最初に出力をコンピュータに保存します。
   2. 実験中に保存する場合は、[ファイル] をクリックし、[保存] を選択します。
      メモ:LabChartソフトウェアは、プログラムの偶発的なシャットダウン(停電など)が発生した場合にファイルを回復できますが、データの損失を防ぐために、実験中にアクティブなファイルを15〜20分ごとに保存することをお勧めします。
5. 実験場の水温を15分ごとに~1.5 °Cの速度で上昇させ、再循環水浴の温度を調整して2.5時間にわたって12°Cから30°Cのランプを達成します。
   注:アメリカのロブスターの地理的分布は25°Cの熱勾配に及び、個人は30°C¹⁶までの温度で順応し、生き残ることができます。したがって、30°Cは、ロブスターが臨界熱最大¹³に達しないストレスの多いシナリオを経験し、死亡率につながる可能性があるため、この温度ランプの上限として選択されました。温暖化の具体的な速度は、他の種^8、14を使用した研究で実施された温暖化率⁸の範囲内に収まるだけでなく、アメリカのロブスター^13、27に関する以前の研究に該当するため^13選択27された。このプロトコルを実装する前に、1)所定の実験のための温度の適切な範囲を決定し、2)空の実験場で公判前温度ランプを行うことが重要であり、これは所望のランプを達成するために水浴の必要な温度調整を決定するのに役立ちます。これは、アリーナ内の水の量によっても異なる場合があります。
6. 温度ランプ全体で、出力に影響を与える可能性のある調整が発生するたびに記録します。
   1. インピーダンス 変換器のバランスは実験全体を通して調整する必要が生じ、その結果、意図しないスパイクが出力される可能性があることに注意してください。
   2. 実験場の温度が被験者の好ましい熱範囲の外のレベルに達し始めると、不随意筋収縮は出力に誤った「スパイク」をもたらす可能性がある。この場合は、データ変換プロセス中に削除する出力の領域を識別するコメントを作成します。
7. ランプが完成したら、実験場からロブスターを取り出し、約20分間回収浴(12°C)に入れ、必要に応じて、ロブスターの心拍数が基底レベルに戻るまで監視し続けます。
8. 20 分後、PowerLab 出力の停止ボタンを押してファイルを保存します。慎重に電極を取り外し、試験対象物を保持タンクに戻す前に、外科用ハサミでケーブルの接続を切断します。
   注:ロブスターを直接回収浴に入れるのではなく、実験的なアリーナをゆっくりと開始温度に戻す方法もあります。これは、さらに2.5時間の間に15分ごとに〜1.5 °Cの実験場を冷却することによって達成される。

4. データ変換

1. データパッドを開きます。列 A をダブルクリックし、データ パッド列A の設定メニューの左側にある[選択とアクティブポイント] をクリックして、列 A を時間に設定します。メニューの右側から [時間] を選択し、[OK]をクリックしてウィンドウを閉じます。
2. 列 B をダブルクリックし、データ パッド列B の設定メニューの左側から[統計情報] オプションを選択して、列 B を平均温度に設定します。メニューの右側から[平均]を選択し、メニューウィンドウの下部にある計算ソースとしてチャンネル2を選択します。[OK] をクリックしてウィンドウを閉じます。
3. 記録された電圧を毎分拍に変換する
   1. 列 Cをダブルクリックし、メニューの左側にある[選択とアクティブポイント] を選択します。メニューの右側から選択期間を選択し、「OK」をクリックしてウィンドウを閉じます。
   2. 列 Dをダブルクリックし、メニューの左側にある[周期的測定] を選択します。メニューの右側から[イベント数] を選択し、[計算ソース] として[チャネル 1]を選択します。[OK] をクリックしてウィンドウを閉じます。これにより、データのピークがカウントされ、データの選択した部分の心拍数が決定されます。
      注: 必要に応じて、メニューの下部にある[オプション]ボタンを選択し、データをより正確に読み取るように[検出設定]を調整します。データ ファイルをスキャンし、"Sine" または "Spikey" シェイプ オプションがハートビート出力の主要なピークのカウントのみを発生するかどうかを判断します。さらに、出力ファイルのノイズを無視するように、メニューの右側の検出調整しきい値を調整します。
   3. 列 Eをダブルクリックし、メニューの左側にある[周期的測定] を選択します。[平均循環レート] を選択し、[計算ソース] として[チャネル 1]を選択します。[検出設定]と [検出の調整]を列 D の設定と一致するように調整します(手順 4.4.2 で操作した場合)。[OK] をクリックしてウィンドウを閉じます。これにより、データの選択された部分に対する心拍数の最終的な推定値 (1 分あたりの拍数) が得られます。
4. 列が設定されたら、データ ファイルに戻り、出力の目的のセクションを強調表示し、セクション 3.6 のコメントで識別されるエラー データの領域を省略します。
   1. [コマンド] および [データ パッドに複数追加]を選択します。
   2. [検索方法] ドロップダウン メニューから [時間] を選択し、[すべての値] ボックスをオンにして[選択] メニューの下に「30」と入力して、30 s ごとにデータをプルします。
   3. [ステップスルー ] メニューの[現在の選択]オプションをクリックし、[追加] をクリックします。
5. [データ パッド] 画面に戻り、[ファイル] と[名前を付けて保存]を選択して、出力を Excel ファイルとして保存します。
   注:ここでは、心拍数は、以前の研究^,8、27に基づいて毎分ではなく、30秒ごとに(毎分の⁸拍動で)報告されます。また、リアルタイムに収集された電圧データの変化をより正確にキャプチャするのにも役立ちます。個々の好みに基づいて、より短い時間間隔またはより長い時間間隔でデータを選択することが可能です。

5. アレニウスブレーク温度の計算

1. Excel でデータ ファイルを開き、LabChart ソフトウェアからの出力を操作します。
   1. [1000/(温度 °C + 273.15 K)]の式を使用して、温度を摂氏からケルビンの逆数に変換します。
   2. 心拍数の自然対数を取得します: ln(BPM)。
2. 心拍数を温度の関数としてプロットして、ln(BPM)対逆^(K)13,15と表現して、アレニウスプロット^を15生成する。
3. SigmaPlot では、データを区分回帰に適合させ、ABT である交点を決定します。
   1. 変換されたデータをコピーして新しいブックに貼り付けます。メイン メニューの[統計]オプションを選択し、ドロップダウン リストから[回帰ウィザード] を選択します。
   2. [計算式]ウィンドウで、[計算式カテゴリ]メニューから区分を選択し、[計算式名]ボックスで2セグメントの線を選択します。[次へ] をクリックします。
   3. 変数ウィンドウで、変数列メニューのドロップダウン・オプションを使用して、変換された温度データをt変数に、変換された心拍数データをy変数として選択します。[次へ] をクリックする前に、[データの作成元] メニューで[XY ペア] が選択されていることを確認します。
   4. [結果の調整] ウィンドウを確認したら、[次へ] をクリックし、[数値出力オプション]ウィンドウの[レポートの作成] チェック ボックスをオンにします。[次へ] をクリックします。
   5. [グラフ オプション]ウィンドウで、[結果グラフの調整] セクションの [新しいグラフの作成] オプションをオンにし、[グラフ フィーチャ] セクションの [グラフ タイトルに数式を追加] をオンにします。[完了] をクリックします。
   6. 結果出力ページで、区分回帰の 2 つの領域の方程式とパラメーター値、および回帰の統計出力 (R^2、F統計、p 値など) を取得します。
   7. 生成されたパラメータ値と方程式を使用して、2つのセグメントを互いに等しく設定し、変数"t"を解いてABTを決定します。
      注: ABT は、プログラム SAS¹⁸のパッケージ "セグメント化" 17 を使用するか、Prism8¹⁹の "セグメント線形回帰" ルーチン¹⁹を使用して、R 統計計算環境で計算することもできます。

結果

このプロトコルは、温度上昇実験中の心拍数(電圧)と温度のリアルタイムデータを取得するためのインピーダンス・ニューモグラフィーの使用について説明しています。この技術を穿フォーする場合、記録される電圧と温度の振幅は、実験計画と焦点種に基づいて変化します。しかし、プロトコルが正しく実装されている場合、リアルタイムで表示される電圧出力は一般的な正気分布に従い?...

ディスカッション

このプロトコルは、温度ランピング実験中の後期無脊椎動物の心拍数の変化を測定するためのインピーダンス肺炎の使用について説明する。この技術の主な利点は、他の実験室ベースのアプローチ^{99、10、1110,11}と比較して、それが低侵襲であり、外骨格の大きな外科的操作を伴わないことであり、実験前に必要な回復時間?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm (1/16 in) drill bit	Milwaukee Tool at Home Depot	1001294900	This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores.
38 AWG Copper Magnet Wire	TEMCo	MW0093	This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes.
Cyanoacrylate glue	Loctite	852882	This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace.
Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade	Fisher BioReagents	BP82931GAL	This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation.
Excel	Microsoft	N/A	This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems.
Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit	Fisher Scientific	08-855	This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol.
Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz	Fisher Scientific	13-874-180	This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use.
Fisherbrand Sterile Cotton Balls	Fisher Scientific	22-456-885	These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation.
Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK	Grainger	5WHE6	Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors.
Impedance converter	UFI	Model 2991	Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three.
LabChart software	ADInstruments	N/A	Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes.
LED Soldering Iron	Grainger	28EA35	This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes.
PowerLab datalogger	ADInstruments	ML826	There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel.
Prism8	GraphPad	N/A	This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems.
R	R Project	N/A	This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website.
Rosin Core Solder	Grainger	331856	This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes).
SAS	SAS Institute	N/A	This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems.
SigmaPlot	Systat Software, Inc.	N/A	This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers.
T-type Pod	ADInstruments	ML312	Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples.
T-type Thermocouple Probe	ADInstruments	MLT1401	Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m.
UV Cable Tie, Black	Home Depot	295813	This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store.