Pneumographie d’impedance pour la mesure mini-invasive de la fréquence cardiaque dans les invertébrés de stade avancé

Résumé

La mesure de la fréquence cardiaque lors d’un défi thermique donne un aperçu des réponses physiologiques des organismes à la suite d’un changement environnemental aigu. Utilisant le homard américain (Homarus americanus) comme organisme modèle, ce protocole décrit l’utilisation de la pneumographie d’impedance comme approche relativement non invasive et non létale pour mesurer la fréquence cardiaque dans les invertébrés à un stade avancé.

Résumé

Les températures dans les océans augmentent rapidement en raison des changements généralisés des climats mondiaux. Comme la physiologie organisationnelle est fortement influencée par la température environnementale, cela a le potentiel de modifier les performances physiologiques thermiques dans une variété d’organismes marins. Utilisant le homard américain (Homarus americanus) comme organisme modèle, ce protocole décrit l’utilisation de la pneumographie d’impedance pour comprendre comment la performance cardiaque dans les invertébrés de stade avancé change sous le stress thermique aigu. Le protocole présente une technique mini-invasive qui permet la collecte en temps réel de la fréquence cardiaque au cours d’une expérience de montée en puissance de la température. Les données sont facilement manipulées pour générer une parcelle arrhenius qui est utilisé pour calculer la température de rupture Arrhenius (ABT), la température à laquelle la fréquence cardiaque commence à diminuer avec des températures croissantes. Cette technique peut être utilisée dans une variété d’invertébrés à un stade avancé (c.-à-d. crabes, moules ou crevettes). Bien que le protocole se concentre uniquement sur l’impact de la température sur la performance cardiaque, il peut être modifié pour comprendre le potentiel pour les facteurs de stress supplémentaires (par exemple, l’hypoxie ou l’hypercapnie) d’interagir avec la température pour influencer les performances physiologiques. Ainsi, la méthode a le potentiel pour des applications de grande envergure pour mieux comprendre comment les invertébrés marins réagissent aux changements aigus dans l’environnement.

Introduction

Au cours des dernières décennies, l’augmentation de l’apport de gaz à effet de serre (c.-à-d. le dioxyde de carbone, le méthane et l’oxyde nitreux) dans l’atmosphère a entraîné des tendances généralisées de changement environnemental¹. Les océans du monde se réchauffent rapidement²,^3,une tendance qui peut avoir de graves impacts sur la physiologie organisationnelle. La température influence fortement les taux physiologiques, et les organismes ont une plage de température optimale pour la performance^4,5,6. En tant que tel, les individus peuvent rencontrer des difficultés à maintenir la livraison appropriée d’oxygène aux tissus pendant que les températures s’éloignent en dehors de cette gamme. Cela a le potentiel de conduire à des baisses de la performance aérobique face au réchauffement des températures océaniques^5,7.

En laboratoire, une méthode pour comprendre les impacts physiologiques du changement environnemental consiste à examiner la performance cardiaque dans le contexte du stress thermique. Ceci fournit un aperçu de la façon dont l’exposition aux conditions de réchauffement prévues peut modifier les courbes de performance^5,6 ainsi que le potentiel de plasticité d’acclimation⁸. Diverses méthodes ont été mises en œuvre avec succès pour mesurer la fréquence cardiaque dans les invertébrés marins. Cependant, beaucoup de ces techniques impliquent l’ablation chirurgicale ou la manipulation majeure de l’exosquelette et l’implantation prolongée des dispositifs de mesure^9,10,11, qui introduit le stress supplémentaire au sujet de test et augmente le temps nécessaire pour une récupération réussie avant l’expérimentation. De plus, les techniques moins invasives (p. ex., observation visuelle, vidéographie) peuvent être limitées aux stades de l’histoire de la vie précoce lorsque les organismes peuvent être entièrement ou semi-transparents¹². En outre, d’autres défis peuvent être présentés aux chercheurs qui ne connaissent pas bien les méthodologies plus avancées sur le plan technologique (p. ex., observations par transducteurs infrarouges ou perfusion Doppler^8,11).

Ce protocole utilise le homard américain (Homarus americanus) comme modèle d’invertébrés marins à un stade avancé pour démontrer l’utilisation de la pneumographie d’obstacle pour évaluer les changements de fréquence cardiaque au cours d’une expérience de montée en puissance de la température. La pneumographie d’impedance implique le passage d’un courant électrique oscillant (AC) sur deux électrodes placées de chaque côté du péricarde pour mesurer les changements de tension pendant que le coeur se contracte et détend^13,14. Cette technique est peu invasive, car elle utilise de petites électrodes (c.-à-d., 0,10-0,12 mm de diamètre) qui sont doucement implantées juste sous l’exosquelette. Enfin, il fournit des évaluations en temps réel de la fréquence cardiaque et de la température de l’eau pendant la rampe grâce à l’utilisation d’un enregistreur de données.

Le protocole fournit également des instructions pour calculer la température de rupture arrhenius (ABT), la température à laquelle la fréquence cardiaque commence à diminuer avec des températures croissantes^13,15. L’ABT sert d’indicateur non létal de la limite thermique de capacité dans les sujets d’essai qui peuvent être favorisés sur la mesure du maximum thermique critique (CT_max, la limite supérieure de la fonction cardiaque^5,6), que les limites mortelles sont souvent extrêmes et rarement rencontrés dans l’environnement naturel⁵.

Protocole

1. Configuration de l’équipement

1. Enveloppez les tubes clairs et malléables autour d’elle-même pour créer une bobine d’échange de chaleur d’environ 8 à 10 cm de diamètre et dont les extensions mesurent de 40 à 70 cm de long. Fixez la bobine à l’aide de ruban électrique.
2. Attachez la bobine d’échange de chaleur à l’approvisionnement externe et retournez les raccords d’un bain d’eau circulant de refroidissement/chauffage. Assurez-vous que la connexion est sécurisée à l’aide de pinces à tuyaux.
3. Remplissez le puits du bain d’eau circulant de refroidissement/chauffage avec de l’osmose inverse (RO) et branchez le cordon d’alimentation dans une prise. Allumez le bain d’eau et assurez-vous qu’il n’y a pas de fuites dans sa connexion à la bobine d’échange de chaleur.
4. Configurez le convertisseur d’obstacles en branchant le câble BNC noir à la sortie AC sur l’appareil et en le connectant au enregistreur de données(tableau des matériaux) à l’aide du port de Channel 1.
5. Branchez la sonde thermocouple (enregistreur de température) dans la nacelle de type T, puis branchez la nacelle de type T dans le port du canal 2 du enregistreur de données.
6. Branchez le cordon d’alimentation de l’enregistreur de données dans une alimentation et connectez le enregistreur de données à un ordinateur PC à l’aide du connecteur de câble USB.
7. Remplissez la chambre d’acclimation et l’arène expérimentale de 7,5 L d’eau de mer artificielle (salinité de 35 ppt, pH à 8,1, température et C).
   REMARQUE : Le volume, la température et la chimie de l’eau nécessaire à la chambre d’acclimation et les conditions de départ dans l’arène expérimentale dépendent de la conception expérimentale. Il est important de noter que ces contenants doivent être suffisamment grands pour submerger confortablement le sujet d’essai.

2. Implantation d’électrodes

1. Placez le homard sur une grille en plastique qui s’insère facilement dans l’arène expérimentale de telle sorte que le corps fait confortablement une forme Y à une extrémité du rectangle.
2. Fixer soigneusement les griffes et l’abdomen du homard à la grille en plastique à l’aide de petites attaches de câble. Les attaches de câble devraient être assez serrées pour empêcher le mouvement mais laisser la place pour des ciseaux chirurgicaux pour les enlever à la fin de l’expérience.
3. Sécher la carapace avec un essuie-tout et le nettoyer avec une boule de coton trempée dans 70% d’éthanol.
4. Créez les trous pour les électrodes.
   1. À l’aide d’un petit percet (p. ex., 1,6 mm), percez lentement et soigneusement deux petits trous (presque) à travers la carapace de chaque côté du péricarde.
   2. Terminer chaque trou en insérant doucement une aiguille de dissection stérile.
   3. Si l’aiguille ne passe pas facilement par la carapace, continuer à forer lentement à la main avant d’essayer l’aiguille à nouveau.
      REMARQUE : Pour minimiser le stress chez les animaux expérimentaux, la pratique de cette technique avant l’expérimentation est fortement recommandée. Au fil du temps, les utilisateurs peuvent facilement déterminer en se sentant quand le bit de forage est presque bien que la carapace et passer à l’aiguille. Le forage à la main est approprié pour les homards et les crabes, surtout si l’exosquelette est doux (c.-à-d. que l’animal a récemment mué). Toutefois, si le sujet d’essai a un exosquelette ou une coquille plus épais (c.-à-d. un bivalve), un outil Dremel est plus approprié.
5. Obtenez les électrodes (fil magnétique de 36 à 38 G, 0,10 à 0,12 mm de diamètre) et grattez un petit peu d’isolation à la pointe du fil à l’aide d’une lame de couteau disséquante. Pliez soigneusement la pointe de chaque fil dans un petit crochet à l’aide de forceps et insérez-en un dans chacun des trous nouvellement percés.
6. Fixez chaque plomb de fil à l’aide d’une petite goutte de colle cyanoacrylate et laissez-la sécher pendant 5 à 10 min.
   REMARQUE : Il est crucial d’utiliser la colle avec parcimonie, car l’ajout trop va réinsérer le fil et empêcher le signal d’être enregistré.
7. Une fois que la colle est sèche, attachez le fil conduit au convertisseur d’impedance et allumez-la. Placer le homard dans la chambre d’acclimation et lui permettre de s’acclimater aux électrodes implantées pendant 15-20 min.
   REMARQUE : Des mouvements rapides ou choquants, ainsi que de la colle incomplete séchée, peuvent faire en sorte que les électrodes se détachent de la carapace. Si cela se produit, retournez à l’étape 2.6.
8. Allumez l’enregistreur de données et ouvrez le logiciel LabChart sur l’ordinateur. Cliquez sur New Experiment et laissez l’écran Chart View ouvert.
9. Dans Chart View, localisez le menu Fonction Manche pour Channel 1 à partir de la section droite de l’écran. Choisissez Input Amplifier dans le menu et sélectionnez AC Coupling. Le signal entrant du sujet de test apparaîtra désormais à l’écran en temps réel.
   REMARQUE : La sensibilité du canal peut être ajustée en sélectionnant le menu pop-up Range. Ajuster la plage jusqu’à ce que les pics de signal soient de 25 % à 75 % de l’échelle complète. Fermez l’amplificateur d’entrée en cliquant sur OK.
10. Sur le convertisseur d’obstacle, ajustez le Gain (taille) et l’équilibre jusqu’à ce qu’un signal fort soit observé sur la sortie de l’enregistreur de données, visant à maintenir le solde près de zéro.
11. Sur Channel 2, sélectionnez la nacelle de type T pour enregistrer les données de température en temps réel.
12. Lorsque les deux canaux sont configurés correctement, cliquez sur le bouton Démarrer, et le enregistreur de données commencera à enregistrer les données.

3. Montée en puissance des températures

1. Après la période d’acclimation, placez la grille en plastique avec le homard attaché soigneusement dans l’arène expérimentale et placez la bobine d’échange de chaleur sur le dessus de la grille.
2. Placez la sonde thermocouple près du homard, en veillant à ce qu’elle soit complètement submergée avant de placer le couvercle sur l’arène expérimentale pour réduire le stress visuel au sujet d’essai.
3. Ajuster le solde au besoin et faire un commentaire sur la sortie indiquant que l’essai a commencé.
4. La sortie peut et doit être enregistrée périodiquement tout au long de l’expérience.
   1. Cliquez sur Fichier et sélectionnez Enregistrer Comme pour enregistrer initialement la sortie à l’ordinateur.
   2. Lors de l’enregistrement au cours de l’expérience, cliquez sur Fichier et sélectionnez Enregistrer.
      REMARQUE : Bien que le logiciel LabChart puisse récupérer des fichiers en cas d’arrêt accidentel du programme (p. ex., une panne de courant), il est recommandé d’enregistrer des fichiers actifs tous les 15 à 20 minutes pendant l’expérience afin de prévenir la perte de données.
5. Augmenter la température de l’eau de l’arène expérimentale à un taux de 1,5 oC toutes les 15 minutes pour atteindre une rampe de 12 à 30 oC sur une période de 2,5 h en ajustant la température du bain d’eau recirculant.
   REMARQUE : La répartition géographique du homard américain s’étend sur un gradient thermique de 25 oC, et les individus peuvent s’acclimater et survivre à des températures allant jusqu’à 30 oC^16. À ce titre, 30 oC a été choisi comme limite supérieure pour cette rampe de température, car il garantit que les homards connaissent un scénario stressant qui n’atteint pas le maximum thermique critique^{de 13}, ce qui pourrait conduire à la mortalité. Le taux spécifique de réchauffement a été choisi parce qu’il s’inscrit dans une gamme de taux de réchauffement mis en œuvre dans les études utilisant d’autres espèces^8,14 ainsi que des recherches antérieures sur le homard américain^13,27. Avant la mise en œuvre de ce protocole, il est important de 1) de déterminer la plage de température appropriée pour une expérience donnée et 2) effectuer une rampe de température pré-procès avec une arène expérimentale vide, car cela aidera à déterminer l’ajustement de température nécessaire du bain d’eau pour atteindre la rampe désirée. Cela peut également différer en fonction du volume d’eau dans l’arène.
6. Tout au long de la rampe de température, enregistrez chaque fois qu’un ajustement qui peut avoir un impact sur la sortie se produit.
   1. Notez que l’équilibre sur le convertisseur d’obstacle devra probablement être ajusté tout au long de l’expérience, et ce faisant peut causer une pointe involontaire dans la sortie.
   2. Comme la température dans l’arène expérimentale commence à atteindre des niveaux en dehors de la plage thermique préférée du sujet d’essai, les contractions musculaires involontaires peuvent entraîner un «pic» erroné dans la sortie. Si cela se produit, faites un commentaire pour identifier les zones de la sortie qui devraient être supprimées au cours du processus de conversion des données.
7. Lorsque la rampe est terminée, retirer le homard de l’arène expérimentale et le placer dans un bain de récupération (12 oC) pendant 20 minutes. Si désiré, continuez à surveiller la fréquence cardiaque du homard jusqu’à ce qu’il revienne à des niveaux basiques.
8. Après 20 min, appuyez sur le bouton Stop sur la sortie PowerLab et enregistrez le fichier. Retirez soigneusement les électrodes et coupez les attaches du câble avec des ciseaux chirurgicaux avant de renvoyer le sujet d’essai à son réservoir de retenue.
   REMARQUE : Plutôt que de placer un homard directement dans le bain de récupération, une autre option consiste à ramener lentement l’arène expérimentale à sa température de départ. Ceci est accompli en refroidissant l’arène expérimentale de 1,5 oC toutes les 15 minutes au cours d’un supplément de 2,5 h.

4. Conversion de données

1. Open Data Pad. Définissez la colonne A à l’heure en cliquant en double sur la colonne A et en cliquant sur Selection et Active Point sur le côté gauche du menu De configuration de la colonne de tapis de données A. Sélectionnez Le temps du côté droit du menu et fermez la fenêtre en cliquant sur OK.
2. Définissez la colonne B à la température moyenne en cliquant deux fois sur la colonne B et en sélectionnant l’option Statistiques à partir du côté gauche du menu d’installation de la colonne B de Data Pad. Sélectionnez Mean à partir du côté droit du menu et du canal 2 comme source de calcul au bas de la fenêtre du menu. Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre.
3. Convertir la tension enregistrée en battements par minute
   1. Double-cliquez sur la colonne C et sélectionnez Sélection et Point actif sur le côté gauche du menu. Sélectionnez Durée de sélection à partir du côté droit du menu et cliquez sur OK pour fermer la fenêtre.
   2. Double-cliquez sur la colonne D et sélectionnez les mesures cycliques sur le côté gauche du menu. Sélectionnez le compte d’événements à partir du côté droit du menu, et Le canal 1 comme source de calcul. Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre. Cela comptera les pics des données pour déterminer la fréquence cardiaque dans une partie sélectionnée des données.
      REMARQUE : Si nécessaire, sélectionnez le bouton Options du bas du menu et ajustez les paramètres de détection pour lire plus précisément les données. Examinez le fichier de données et déterminez si les options de forme « Sine » ou « Spikey » entraînent des comptages seulement des principaux pics de la sortie du rythme cardiaque. En outre, ajustez le seuil d’ajustement de détection sur le côté droit du menu pour ignorer le bruit dans le fichier de sortie.
   3. Double-cliquez sur la colonne E et sélectionnez les mesures cycliques sur le côté gauche du menu. Sélectionnez le taux cyclique moyen, et le canal 1 comme source de calcul. Ajuster les paramètres de détection et l’ajustement de détection pour correspondre aux paramètres de la colonne D (s’ils sont manipulés à l’étape 4.4.2). Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre. Cela fournit l’estimation finale de la fréquence cardiaque (comme battements par minute) sur une partie sélectionnée des données.
4. Lorsque les colonnes sont configurées, retournez au fichier de données et mettez en évidence les sections souhaitées de la sortie, en omettant les zones de données erronées telles qu’identifiées par les commentaires de la section 3.6.
   1. Sélectionnez commandes et ajouter plusieurs à Data Pad.
   2. Sélectionnez Time from the Find à l’aide d’un menu de dépôt et tirez des données tous les 30 s en cochant chaque case et en entrant « 30 » sous le menu Select.
   3. Cliquez sur l’option de sélection actuelle à partir du menu Étape à travers et cliquez sur Ajouter.
5. Revenez à l’écran Data Pad et sélectionnez Fichier et Enregistrer pour enregistrer la sortie sous forme de fichier Excel.
   REMARQUE: Ici, la fréquence cardiaque est signalée (en battements par minute) tous les 30 s par opposition à chaque minute basée sur la recherche précédente^8,27. Cela permet également de capturer plus précisément les changements dans les données de tension recueillies en temps réel. Il est possible de sélectionner des données à des intervalles de temps plus courts ou plus longs en fonction des préférences individuelles.

5. Calcul de la température de rupture d’Arrhenius

1. Ouvrez le fichier de données dans Excel et manipulez la sortie du logiciel LabChart.
   1. Convertir la température de Celsius à la réciprocité de Kelvin en utilisant l’équation suivante : [1000/(température c à 273,15 K)].
   2. Obtenir le journal naturel de la fréquence cardiaque: ln(BPM).
2. Générer une parcelle arrhenius en traçant la fréquence cardiaque en fonction de la température, exprimée comme ln(BPM) vs réciproque (K)^13,15.
3. Dans SigmaPlot, adaptez les données avec une régression dans le sens des pièces et déterminez le point d’intersection, qui est l’ABT.
   1. Copiez et collez les données transformées en un nouveau cahier de travail. Sélectionnez l’option Statistiques dans le menu principal et Regression Wizard de la liste déroulante.
   2. Dans la fenêtre Equation, sélectionnez pièce dans le menu de la catégorie Equation et 2 segment linéaires sous la case Nom d’équation. Cliquez sur Next.
   3. Dans la fenêtre Variables, sélectionnez les données de température transformées pour être la variable t et les données de fréquence cardiaque transformées pour être la variable y, en utilisant les options de drop-down dans le menu des colonnes variables. Assurez-vous que XY Paire est sélectionné dans les données du menu avant de cliquer sur Next.
   4. Après avoir passé en revue la fenêtre Fit Results, cliquez sur Next et cochez la case pour créer le rapport dans la fenêtre Des options de sortie numériques. Cliquez sur Next.
   5. Dans la fenêtre Options graphiques, vérifiez la nouvelle option de graphique Créer sous la section Fit Results Graph, et ajoutez l’équation au titre graphique sous la section des caractéristiques graphiques. Cliquez sur Finition.
   6. Sur la page de sortie des résultats, récupérer les équations et les valeurs de paramètres pour les deux régions de la régression sur le plan de la pièce, ainsi que la sortie statistique de la régression (p. ex., R², F-statistique et p-value).
   7. À l’aide des valeurs de paramètres et des équations générées, définissez les deux segments égaux l’un à l’autre et résolvez-le pour la variable « t » pour déterminer l’ABT. Convertir cette valeur en Celsius en utilisant l’équation suivante : 'C ' (1000/t) - 273.15.
      REMARQUE: L’ABT peut également être calculé dans l’environnement de calcul statistique R à l’aide du paquet "segmenté"¹⁷ dans le programme SAS¹⁸, ou en utilisant la routine "Régression linéaire segmentaire" dans Prism8¹⁹.

Résultats

Ce protocole décrit l’utilisation de la pneumographie de l’obstacle pour obtenir des données en temps réel pour la fréquence cardiaque (en tension) et la température au cours d’une expérience de montée en puissance de la température. Lors de la perforation de cette technique, l’amplitude des tensions et des températures enregistrées variera en fonction de la conception expérimentale et des espèces focales. Cependant, la sortie de tension affichée en temps réel suit une distribution de sinus généri...

Discussion

Ce protocole décrit l’utilisation de la pneumographie d’obstacle pour mesurer les changements dans la fréquence cardiaque des invertébrés de stade avancé pendant une expérience de montée en puissance de la température. L’avantage principal de cette technique par rapport à d’autres approches en laboratoire^9,10,11 est qu’elle est mini-invasive et n’implique pas une manipulation chirurgicale majeure de l’exos...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.6 mm (1/16 in) drill bit	Milwaukee Tool at Home Depot	1001294900	This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores.
38 AWG Copper Magnet Wire	TEMCo	MW0093	This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes.
Cyanoacrylate glue	Loctite	852882	This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace.
Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade	Fisher BioReagents	BP82931GAL	This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation.
Excel	Microsoft	N/A	This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems.
Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit	Fisher Scientific	08-855	This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol.
Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz	Fisher Scientific	13-874-180	This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use.
Fisherbrand Sterile Cotton Balls	Fisher Scientific	22-456-885	These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation.
Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK	Grainger	5WHE6	Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors.
Impedance converter	UFI	Model 2991	Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three.
LabChart software	ADInstruments	N/A	Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes.
LED Soldering Iron	Grainger	28EA35	This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes.
PowerLab datalogger	ADInstruments	ML826	There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel.
Prism8	GraphPad	N/A	This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems.
R	R Project	N/A	This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website.
Rosin Core Solder	Grainger	331856	This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes).
SAS	SAS Institute	N/A	This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems.
SigmaPlot	Systat Software, Inc.	N/A	This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers.
T-type Pod	ADInstruments	ML312	Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples.
T-type Thermocouple Probe	ADInstruments	MLT1401	Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m.
UV Cable Tie, Black	Home Depot	295813	This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store.