組み合わせ前駆体等位同位体ラベリングとアイソバリックタギング(cPILOT)を使用した自動サンプル多重化

要約

前駆体同位体標識とアイソバリックタグ(cPILOT)は、利用可能なアイソバリックタグで同時に分析できるサンプル数を増やすことができる、強化されたサンプル多重化戦略です。ロボットプラットフォームの組み込みにより、実験のスループット、再現性、定量的精度が大幅に向上しました。

要約

我々は、高スループット定量プロテオミクスワークフローを導入し、タンデム質量タグまたは等圧N、N-ジメチルロイシン等圧タグをそれぞれ有する最大22または24サンプルの多重化が可能な前駆体同位体標識および同等圧タグ(cPILOT)を組み合わせた。この強化されたサンプル多重化は質量分析の獲得時間をかなり減らし、高価な商業イソバリック試薬の有用性を高める。ただし、この戦略のサンプル処理とピペッティング手順の手動プロセスは、労力を要し、時間がかかり、サンプルロスと定量誤差を発生させる可能性があります。これらの制限は、自動化の組み込みによって克服することができます。ここでは、手動cPILOTプロトコルを、大量のサンプル数(すなわち96サンプル)を並列に調製できる自動液体処理装置に移しました。全体的に、自動化はcPILOTの実現可能性および再現性を高め、同等のオートメーション装置を有する他の研究者による広い使用法を可能にする。

概要

質量分析(MS)ベースのプロテオミクスは、疾患特有のバイオマーカーの同定、疾患進行の理解、治療開発のリードの創出に欠かせない研究ツールです。これは、血清/血漿、近位体液、および組織^1、2などの疾患関連の臨床サンプルの範囲から達成することができる。プロテオミクスバイオマーカーの発見と検証は、サンプル多重化戦略^3,4のパワーのために最近大きな検討を得^ています。サンプル多重法は、単一のMSインジェクション^5,6内で2つ以上のサンプル条件を同時に比較および定量できる技術である。サンプル多重化は、化学、酵素、または代謝タグを含む複数のサンプルからペプチドまたはタンパク質をバーコード化し、1回のMSまたはMS/MS実験ですべてのサンプルからMS情報を取得することによって達成されます。利用可能なアイソバリックタグの中には、イソバリックタグ付け試薬(iTRAQ)、市販のタンデム質量タグ(TMT)、および16-plex⁷および21-plex⁸までの機能を持つ家庭用合成イソバリックN、N-ジメチルロイシン(DiLeu)試薬があります。

前駆体同位体標識と同等圧タグ付け(cPILOT)は、多重化技術の強化されたサンプルです。cPILOTは、TMTを使用した後の高pH(8.5)同等体標識に使用できるリジン残基を維持する低pH(〜2.5)のペプチドN末語の同位体標識を光[−(CH_3)2]および重い[−−13C2H3)2]に結合する。 DiLeu、またはiTRAQタグ^{3、9、10、11、12、13、14。}cPILOT戦略の二重標識スキームは、例えばペプチドを用いた2つのサンプルを用いた補足図1に描かれている。MS2レベルでのTMTベース定量の精度と精度は、干渉効果¹⁵と呼ばれる汚染共分離および共断片化されたイオンの存在により損なわれる可能性がある。不正確なレポーターイオン比のこの制限は、トリブリッドオービトラップ質量分析計の助けを借りて克服することができます。例えば、干渉効果は、質量分析計で^MS1レベルのジメチル化対でピークを単離し、直線イオントラップで^MS2断片化に光または重いピークを施し、HCD-MS³に最も強い^MS2断片を施して定量的情報を得ることによって克服することができる。レポーターイオンを生成するために利用できるリジンアミンを使用せずにペプチドを選択する機会を増やすために、y-1フラグメントに基づく選択的^MS3取得も使用でき、cPILOT9で定量可能なペプチドの割合が高くなるアプローチである。軽いラベルと重いラベリングの組み合わせは、個々のアイソバリックタグで達成される2倍の倍率でサンプル多重化能力を増加させます。我々は最近、diLeu試薬¹⁶との単一の実験で最大24のサンプルを組み合わせるためにcPILOTを使用しました。さらにcPILOTは、タンパク質ニトレーション¹⁷を含む酸化的翻訳後修飾^14、他のグローバルプロテオーム⁹を研究するために使用され、アルツハイマー病マウスモデル¹¹における複数の組織サンプルにわたる応用を実証している。

堅牢なサンプル調製は、cPILOT実験の重要なステップであり、時間がかかり、手間がかかり、広範囲に及ぶ可能性があります。強化されたサンプル多重化には、広範なピペット処理と高度に熟練した研究室の人員が必要であり、実験の再現性に大きく影響する要因がいくつかあります。例えば、サンプルの慎重な取り扱いは、すべてのサンプルに対して同様の反応時間を確保し、軽く、重いジメチル化されたサンプルのための適切な緩衝液pHを維持するために必要である。さらに、数十から数百のサンプルの手動調製は、高い実験誤差を導入することができます。そこで、サンプル調製のばらつきを低減し、定量的精度を向上させ、実験スループットを向上させるため、自動化されたcPILOTワークフローを開発しました。自動化は、ワークフローの多くの側面を完了できるロボット液体ハンドリング装置を使用して達成される(図1)。タンパク質定量からペプチド標識までのサンプル調製を、自動液体ハンドラ上で行った。自動液体ハンドラは、固相抽出(SPE)プレート、軌道シェーカー、および冷暖房装置との間のバッファ交換用の正圧装置(PPA)と統合されています。ロボットプラットフォームは、プレートとバッファに対応する28のデッキ位置を含みます。デッキの位置の版を移すグリッパーが付いている2つのポッドがある:96チャネル固定容積のピペットリングヘッド(5-1100 μL)および8チャネル可変容積の調査(1-1000 μL)。ロボットプラットフォームはソフトウェアを使用して制御されます。ロボット液体ハンドラを使用する前に、ユーザーは専門的に訓練を受ける必要があります。本研究では、1つのバッチで12以上のサンプルを処理するために労力を要する手動cPILOTワークフローを自動化することに焦点を当てています。cPILOTアプローチ¹¹のスループットを向上させるために、cPILOTプロトコルをロボット液体ハンドラに移し、10以上のサンプルを並列に処理した。また、この自動化により、サンプル調製プロセスのさまざまなステップで各サンプルに対して同様の反応が可能となり、高度な訓練を受けたユーザーは手動のcPILOT中に達成する必要がありました。このプロトコルは、cPILOTを実行する自動液体処理装置の実装に焦点を当てています。本研究では、この自動化システムを使用するためのプロトコルを説明し、マウス肝ホモジナートの22プレックス「概念実証」分析を使用してその性能を実証する。

プロトコル

すべての動物のプロトコルは、ピッツバーグ大学の制度的動物管理および使用委員会によって承認されました。1つの男性コントロールマウス(C57 /BLJ)は、商業的に購入され、ピッツバーグ大学の実験動物資源部門に収容されました。マウスは、標準的なげっ歯類の実験室チャウアドリビタムを与え、12時間の明暗サイクルに保たれた。肝臓組織を収穫し、−80°Cで保存した。

1. タンパク質抽出

注: これらの手順は手動で実行されます。

1. マウス肝臓(100mg)を生理液で洗浄し、20m用4 m/sのライジングマトリックスAビーズを使用したメカニカルホモジナイザーを使用して、500 μLの8 M尿素でホモゲネートします。
   注:本研究では、プロテアーゼまたはホスファターゼ阻害剤は添加されなかったが、実験に基づいて、必要に応じてバッファーに添加することができる。また、タンパク質抽出工程は、様々なサンプルタイプに応じて調整することができる。
2. 組織ホモジネートを新しいマイクロ遠心チューブに移し、すすいで、PBSの100-500 μLと8 M尿素を使用して溶出管を組み合わせます。
3. 均質化組織(12,800 x g、4°C、および15分)を遠心分離し、上清を収集します。
   注: 残りの手順は、ユーザーの研究室で利用可能なロボット液体ハンドラで実行されます。液体ハンドラは、最小限のオペレータ参加で、ANCI指定プレートのタイプとの間でバッファを吸引し、分配できる必要があります。
4. メーカーの指示に従って、バイチンチオン酸(BCA)アッセイを使用してタンパク質濃度を決定します。
5. PPA、加熱/冷却装置、真空ポンプをオンにし、すべてのアクセサリを液体ハンドラで接続します。液体ハンドラは、コンピュータに接続され、動作する準備が整うと、青色の光を示します。
6. 試薬プレート1(96ウェルプレート)に、25 mM 1,4-ジチオスライトール(DTT)の30μL、システイン25mM 30μL、ヨドアセトアミド(IAA)の25 mM 30 μLをそれぞれ行1、2、3に加えます。
7. 8 M尿素と20 mMトリス(10 mM CaCl 2(pH 8.2)を貯留プレートに加えます。5%のギ酸の500 μLを2mL深いウェルプレートに加え、20 μLのトリプシンをトリプシンプレートの1行目に加え、方法で指定されたデッキの位置に配置します。
   注:IAAとトリプシンは、サンプルに追加する前に96ウェルプレートに追加されました。
8. 肝臓のアリコート300 μLは500 μLのチューブにホモジュネイトし、2 mL深いウェルプレートに置き、プロトコルが始まるまで4°Cに置きます。この実験では、22のアリコートが単一の肝臓ホモジネートから生成された。
   注:比1 μg標準:100 μgタンパク質サンプルを使用して、内部品質管理基準(例えば、ウシアルファカゼインまたは他の外因性タンパク質)を追加します。
9. テーブル 1に示すように、変数名と値によってサンプルに追加されるバッファーのボリュームを定義します。BCAに基づいて、スプレッドシート上のサンプルと正規化バッファ(8 M尿素)の体積を入力し、ソフトウェアに接続します(表2)。
   注:タンパク質濃度が高すぎる場合は、バッファーを使用してさらに希釈が必要になることがあります。肝臓組織からのサンプルの結果として得られた濃度は10 μLであった。バッファーの容量は100 μgのタンパク質に最適化されました。
10. 4°Cからサンプルチューブを取り外し、自動液体ハンドラの指定されたデッキの位置に置き、10分間温めます。
11. メソッドを開き、指示に従って必要なヒント(1070、90、230 μL)を配置し、ラボウェアを希望の位置に配置します。すべてのラボウェアとヒントが配置されたら、最終的なデッキレイアウトをクロスチェックし、[ 次へ ]をクリックしてプロトコルを続行します。
    注: ガイド付きセットアップでは、プロトコルとデッキの場所に応じて、必要なバッファのボリュームを特定のラボウェアに追加するようユーザーに通知します。

2. サンプル還元、アルキル化、消化

1. 230 μL の先端をロードし、貯留槽から 8 M 尿素 90 μL を吸引し、黒の 2 mL 深いウェルプレートの 1 行目に分配します。ヒントをアンロードします。このステップを繰り返し、22個のサンプルに対応するすべてのウェルに8 M尿素を添加します。
   注:変性バッファーは、トリプシンが効果的に作用し、タンパク質を破壊できるように、タンパク質の三次元構造を巻き戻して一次構造を得る。8チャネルピペットは8チャンネルのために異なるボリュームを吸引することができ、ラボウェア内の異なる場所に分配することができます。このステップでは、すべてのチャンネルがソフトウェアで定義されているのと同じボリュームを吸引しました。
2. 変性バッファーを追加した後、8チャンネルピペットを使用してマウス肝臓ホモネートの90 μLチップと吸気10μL(100 μgに相当)を黒2 mL深いウェルプレートにロードします。ヒントをアンロードします。22 個のサンプルがすべて転送されるまで、この手順を繰り返します。
3. 各転写後、50μLのウェルコンテンツを吸引し、分注して、タンパク質とバッファーを確実に混合し、1:1の比率を示すように混合工程を行います。
   注:ストックホモジネートサンプルを取り外し、-80°Cに配置してください。
4. 変性タンパク質を減らすには、90 μLチップの1列をロードし、試薬プレート1から3μLのDTTを吸引します。DTTを黒の2 mL深いウェルプレートの行1と2に分配し、先端をアンロードします。
   注:タンパク質:DTTモル比は、二硫化結合の減少のために1:40に維持されます。モル比の計算は、66.5 x 10³ g/molであるウシ血清アルブミン(BSA)のタンパク質量に基づいています。
5. サンプルプレートをアルミホイルで密封し、300rpmで600sの37°Cでインキュベートします。
6. 使用直前に0.25 M IAMの30 μLを試薬プレート1の3行に追加し、デッキに配置します。サンプルプレートをアンシールし、デッキに戻ります。
   注: IAM は光に敏感です。
7. 90 μLチップの1行をロードし、試薬プレート1から6μLのIAMを第3行に吸引し、サンプルプレートの1行目に塗布します。ヒントをアンロードします。
   注: タンパク質: IAM モル比は、サンプルごとに 1:80 に維持されます。この反応は暗闇の中で行われなければなりません。
8. サンプルプレートを密封し、冷暖房装置で300rpmで30分間4°Cでインキュベートします。
   注:プレートの密封は、サンプルが光、蒸発、および井戸からこぼれるのを防ぐために行われます。
9. サンプルプレートをアンシールし、90 μLチップの1行をロードし、5μLのシステインをロー2の試薬プレート1から吸引します。サンプルプレートの1行と2行に塗布し、先端をアンロードします。室温で30分間インキュベートします。
   注:タンパク質:L-システインモル比は1:40に維持されます。
10. サンプルプレートを軌道シェーカーに置き、1800 rpmの時振りを30分間行います。
11. サンプルプレートのウェルごとに10 mM CaCl2(pH_8.2) の20mM Trisバッファーの800 μLを加え、尿素濃度を2 Mに希釈します。
    注:トリプシン活性は尿素濃度が高くなると妨げられ、したがって2M未満に減少させなければならない。本研究は、14時間に対して50:1のトリプシンモル比をタンパク質で行った。
12. トリプシンの20 μLを96ウェルプレートの1~12列目に追加し、デッキ上の指定した位置に配置します。
13. 90 μLチップの1列をロードし、トリプシンプレート行1から2μLのトリプシンを吸引し、サンプルプレートの行1と2に分配します。ヒントをアンロードします。
14. プレートを密封し、冷暖房装置で600rpmで37°Cで14時間インキュベートします。
15. インキュベーション後、サンプルプレートをアンシールし、深いウェルコレクションプレートの3列目、列1~12列に5%のギ酸を加え、指定されたデッキに置きます。
16. ギ酸プレートの行3から5%のギ酸の150 μLを加えて消化を止め、行1と2のサンプルプレートに分配します。ヒントをアンロードします。

3. 脱塩工程1

1. 20mgのタルガC-18材料を含むSPEプレートでペプチドを脱塩する。すべてのバッファー交換のボリュームを600 μLに固定し、圧力を100 mbarに固定します。
2. 1070 μL のチップをロードし、アセトニトリルの 600 μL を吸引し、SPE プレートの行 1 と 2 に分配します。SPEプレートをPPAに置き、圧力を加えます。
3. 同じチップを使用して、600 μLのアセトニトリルを吸引し、SPEプレートの行1と2に分配します。SPEプレートをPPAに置き、圧力を加えます。
   注:フロースルーは、吸引ポンプを使用して廃棄物に排水することができます。
4. 1070 μL のチップをロードし、600 μL のバッファー A (0.1 % ギ酸の 100 % 水) を SPE プレートの行 1 と 2 に分配します。SPEプレートをPPAに置き、圧力を加えます。
   メモ:バッファの体積が大幅に減少しない場合は、圧力または時間を増やしてみてください。
5. 1070 μL チップの 2 行をロードし、534 μL の消化されたサンプルを吸引し、SPE プレートの行 1 と 2 に分配します。SPEプレートをPPAに置き、圧力を加えます。すべてのサンプルがロードされるまで、この手順を繰り返します。
   注:ギ酸を加えた後の総容積は1068 μLで、サンプルは2つのパスで加えられた。
6. 使用済みの1070 μLチップを2行ロードし、600 μLのバッファAを吸引し、SPEプレートの行1と2に分配します。SPEプレートをPPAに置き、圧力を加えます。
7. 上記の手順を 1 回繰り返して、サンプルをクリーニングします。
8. 1070 μL チップの 1 行をロードし、ACN の 600 μL を吸引して、水 (60:40) を SPE プレートの行 1 と 2 に分配します。SPEプレートを回収プレートの上に置き、PPAを使用してペプチドを溶出し、圧力を加えます。
9. 上記のステップを繰り返して、回収プレート内のペプチドを溶出する。回収プレートを乾燥させて乾燥させ、さらに処理するまで-80°Cで保管します。

4. ジメチル化標識(ペプチドN末分)

1. 必要なヒント(1070、90、230 μL)とラボウェアをソフトウェアの所望の位置に配置します。すべてのラボウェアとヒントが配置されたら、最終的なデッキレイアウトをクロスチェックし、[ 次へ ]をクリックしてプロトコルを続行します。
2. 試薬プレート2に、1%の酢酸の450 μL、50 μLの軽ホルムアルデヒド(CH₂O)、50μLの重ホルムアルデヒド⁽¹³CD₂O)、および150μLのギ酸を行1、2、3および4に加える。
3. 試薬プレート3に50μLの光CB、重いCBの50μL、行3および4にアンモニアの行1および2および50μLに加える。
4. 230 μLの先端を2行にロードし、1%の酢酸の100μLをサンプルプレート2の行から1%の酢酸を吸引し、サンプルプレート2(脱塩工程からの回収板)行1と2の乾燥したペプチドに分配し、1800rpmで5分間のタイミング振盪を行う。
5. 90 μL チップと吸気 16 μL 60 mM (4%)試薬プレート₂の行2からCH2O(37%wt/v)を、サンプルプレートの行1に分配する。ヒントをアンロードします。
6. 90 μL チップの 1 行をロードし、吸引 16 μL 60 mM (4%) ¹³試薬プレート₂の行3からCD2O(20%wt/v)を、サンプルプレートの行2に分配する。ヒントをアンロードします。
   注: この調査では、行 1 は光に対応し、行 2 は重いジメチル化サンプルに対応しています ( 図 1を参照)。
7. 試薬プレート3の行1と2から90 μLのチップを2行、24 mM NaBH₃CNと24 mM NaBD₃CNを吸引し、サンプルプレートの行1と2にそれぞれ分配します。
8. 先端をアンロードし、軌道シェーカーを使用して1800 rpmで15分間の時振りを実行します。
   注:シアンボローヒドナトリウムを添加すると、このステップは、バッチごとに一度実行される実験間の変動性を減少させるために、反応を開始します。
9. 試薬プレート3の行3および4から90μLの先端と1%アンモニアの32μL(〜28〜30%v/v)を吸い込み、サンプルプレート2の行1と2にそれぞれ分配する。ヒントをアンロードします。
   注:アンモニアを追加すると、このステップは、バッチごとに一度実行される実験間の変動を減らすために、反応を停止します。
10. 等量の軽い、重い(1:1)ジメチル化されたペプチドを新しい2 mLの深い井戸プレートに組み合わせて脱塩する。
    注:この研究では、行1からのウェル内容物の90 μLを、サンプルプレート2から新しい2mLコレクションプレート(サンプルプレート3)までの90 μLの行2と組み合わせました。光の比:重い混合は実験プロトコルに依存し、この研究では1:1比が使用された。
11. 230 μL チップの 2 行をロードし、5%のギ酸の 32 μL を組み合わせたサンプルに吸い込み、1800 rpm で 30 s のタイミング振動を実行します。
    注:ジメチル化効率は反応混合物のpHに依存し、緩衝液pHの変化はペプチドN末分の不完全な標識をもたらす。ジメチル化効率は、ペプチドN末分で動的修飾として検索した場合、97%より大きいはずです。本研究では、軽いペプチドと重いペプチドの標識効率はそれぞれ99.7%と99.5%であった。

5. 脱塩工程2

1. 結合サンプルに対して、脱塩ステップ1と同様のサンプル脱塩を行う。
2. サンプルプレート内のサンプルを速めで乾燥させ、さらに処理するまで-80°Cで保管します。

6. 等圧タグ(Lys残基)

1. ガイド付きのラボウェアのセットアップに従い、必要なヒント(1070、90、230 μL)を適切なバッファとともに配置します。すべてのラボウェアとヒントが配置されたら、最終的なデッキレイアウトをクロスチェックし、[ 次へ ]をクリックしてプロトコルを続行します。
2. 250 μLの100 mMトリエチル炭酸アンモニウム(TEAB)、30 μLのヒドロキシルアミン(10%w/v)を行1に加え、2個の試薬プレート4を加えます。 表 3のスプレッドシートに従って、TMT チューブを 2 mL 深層プレートに配置します。
3. タグ付きペプチドをプールするためのチューブラックホルダーに空の1.5 mLチューブを保管してください。P9とTMT処理プレートのP14に乾燥したサンプルプレートを置きます。
4. ペプチドを再構成するには、230 μLの先端をロードし、100 mMトリエチル・アンモニウム(TEAB)バッファー(pH〜8.5)をTEABプレートの行1から100μLの吸引し、サンプルプレート3の行3で乾燥したペプチドに分配する。プレートを軌道シェーカーの上に30 s 1800 rpmで置きます。
   注:1μg/μLの濃度で100μgのジメチル化ペプチドを再構成してください。
5. TMTプレートのH12から90μLの先端と吸気10μLの無水アセトニトリルをロードし、乾燥したTMTチューブのそれぞれに分配します。
6. TMTチューブ、渦を取り外し、チューブを素早く回転させ、深い井戸プレートでデッキに戻ります。
7. 結合されたジメチル化ペプチドの90 μLチップと吸気12.5 μLの1行をロードし、TMT処理プレートの行1に分配します。ヒントをアンロードします。
   注:TMT:ペプチド比は、この実験のために1:8に維持されました。
8. TMTチップの90 μLチップと吸気10μLの1行をロードし、TMT加工プレートの行1に塗布します。チップをアンロードし、1800 rpmで1時間の時刻みで行います。
9. TEABプレートの2行から90μLチップの1行をロードし、8μLのヒドロキシルアミン(10%w/v)をTMT加工プレートの行1に分配します。チップをアンロードし、1800 rpmで15分間タイミング振動を行います。
10. TMT標識ペプチドをTMT処理プレートから1.5 mLチューブに30.5 μL組み合わせます。各転送の後にヒントをアンロードします。
11. プールされたサンプルでチューブを取り出し、乾燥させてアセトニトリルを蒸発させます。0.2 mLの水で0.1%のギ酸でペプチドを再構成し、デッキに戻ります。
    注:アイソバリックタグのラベルの効率もpHに固有であり、ラベルの効率はメーカーの指示ごとに98%以上でなければなりません。本研究では、リジン終止光ペプチドと重ペプチドのTMT標識効率はそれぞれ99.4%および99.5%であった。

7. 脱塩工程

1. 1つのサンプルに対して、脱塩1と同様のサンプル脱塩を行う。
2. サンプルを乾燥し、分析まで-80°Cで保管してください。

8. 液体クロマトグラフィー- タンデム質量分析 (LC-MS/MS) および MS³

1. 0.1%FAでMSグレード水中のペプチドを再構成し、〜1μg/μL濃度を得る。0.65 μmフィルターを含むマイクロ遠心チューブを用いたフィルターサンプル。遠心分離機ペプチドは12,000 x g で3分間、オートサンプラーバイアルに流れ込みます。
   注:ペプチド濃度は、必要に応じてこの段階で確認することができます。ペプチドは、LC-MSグレードの水で再構成し、BCAペプチドアッセイの対象となる必要があります。本研究では、ペプチドBCAアッセイは行われなかったが、全てのペプチド量は初期タンパク質BCAアッセイに基づいていた。
2. 移動相バッファーを次のように準備します: 100% (v/v) 水と 0.1% FA (A) と 100% Fa (B) を持つ ACN。
3. 2 cmのC₁₈ 素材(3μm、100Å孔サイズ)を詰めたトラップカラムに1μLのサンプルを注入します。
   注: トラップのサンプルクリーニングは次のとおりです: 10 分、100% A;2D液体クロマトグラフィーシステムを使用した2μL/分。
4. 分析分離方法を実行します。100 μm i.d. x 26 cm レーザーのレーザー先端はC₁₈ 材料(2.5 μm、100 Å)が詰められたシリカの毛管柱を融合させた。勾配は:0-10分、10%B;10-30分、10-15%B;30-75分、15-30%B;75-88分、30-60%B;88-92分、60-90%B;92-99分、90%B;99-100分、90-10%B、100-120分、10%B;300 nL/分、120分
5. 分析分離法の実行中に質量分析計のデータ取得を実行します。
   1. MS 調査スキャンには、375-1,500 m/z、120,000 解像度、サイクルタイム 3 秒 (最高速度)、自動ゲイン制御 (AGC) ターゲット 4.0e5、最大射出時間 50 ミリ秒のパラメータを使用します。
   2. CID-MS/MS に対しては、結果ごとのデータ依存取得 (DDA) スキャン、2 m/z 分離幅、35% 正規化衝突エネルギー (NCE)、0.25 活性化 q、10 ms 活性化時間、1.0e4 AGC、100 ms 最大射出時間を使用します。
   3. HCD-MS3 SPS 10の次のパラメータを使用して:スキャン範囲100-400 m/z、依存スキャンの数10、AGC 5.0e4、最大射出時間118 ms、HCD衝突エネルギー55%、MS² 分離ウィンドウ2。

9. データ分析

1. 適切なデータベースに対するタンパク質分析ソフトウェアを使用して、タンパク質およびペプチドのリストを生成したRAWファイルを検索します。
   注: この調査で生成された RAW ファイルは、マウスの Uniprot データベースに対して検索されました。
2. 1つのRAWファイルには軽いラベルと重いラベリングの両方があるため、軽くて重いジメチル化ペプチドの2つのワークフローを持つ各ファイルを検索します。
3. 次のパラメータを持つ53035配列を持つマウスUniprotデータベース(07/13/2019)に対してRAWファイルを検索します:最大2回の切断を逃したトリプシン切断、最小6アミノ酸長のペプチド、15ppm親質量耐性、1 Da断片化耐性静的修飾:軽二メチル化(+28.031、ペプチドN末語) ペプチドN末端、カルバミドメチル(+57.021 Da、C)、動的修飾:酸化(+15.995 Da、M)、11プレックスイソバリックタグ(229.163 Da、K)、1%FDR、レポーター、イオン定量30ppmピーク積分耐性、統合のための最も自信のあるセントロイドード。
   注:重いジメチル化ピークはまた、〜7 Da(+35.069 Da、ペプチドN末語)である光ジメチル化ピークから別の改変を含み、したがって、別の検索ノードもこの修飾を含むように組み込むべきである。
4. 強度に基づいてレポーターイオン定量を行い、65%SPS質量一致、平均S/N比10、同位体補正、正規化及びスケーリングを行わない。
   注:正規化とスケーリングは、サンプルに添加されたペプチド量の合計または特定のタンパク質に基づいて実行できます。QC サンプルは、両側の内部参照スケーリング¹⁸に基づいて、バッチ間またはバッチ内の正規化のチャネルに含めることもできます。異なるTMTチャネルの同位体汚染は検索に提供されなかったが、ユーザは異なるレポーターイオンの同位体汚染を加えることを勧める。

結果

図2は、ワークフロー複製を含む22-plex cPILOT実験から22個のレポーターイオンチャネルすべてで同定されたペプチドの代表的なMSデータを示す。図2(上)は、ペプチドに組み込まれた単一のジメチル基を示す4Da m/z間隔で分離された二重に荷電したピーク対を示す。軽くかつ重いジメチル化されたピークペアを分離し、独立して断片化してペプチドの配列を得た。ペプチドの配列はG(ジメチル)AAELMQQK(TMT-11plex)であり、タンパク質ベタインホモシステインS-メチルトランスレポナーゼに相当する。軽いジメチル化ピークと重いジメチル化ピーク(図示せず)の両方に対する最も強烈なフラグメントイオンは、MS³断片化のためにさらに単離され、レポーターイオン(m/z 126-131)が図2(下)に示されている。レポーターイオン強度は、サンプル中のペプチドの存在量に直接比例する。サンプルのペプチドの豊富さは、ロボットプラットフォームのピペット能力が22のサンプルにわたってかなり均一であることを意味します。全体として、この22-plex cPILOT実験は、3098(6137光/5872重)ペプチドから生じた1326(1209-light/1181-ヘビー)タンパク質同定をもたらした(表4)。図3は、全22チャンネルのlog10の豊富さと総レポーターイオン強度の箱ひげ図を示し、より少ないウェル/サンプル間変動性を示しています。全自動化の評価は、22個のサンプル中の各タンパク質におけるレポーターイオン量の誤差を調べることによって行われた。図 4は、ロボット プラットフォームでのサンプル処理の結果、CV 値が非常に低い結果となったことを示しています。具体的には、レポーターイオンの量の平均CVを同定した3098ペプチドは、それぞれ軽いジメチル化ペプチドと重いジメチル化ペプチドに対して12.36%と15.03%であった。これらのペプチドのうち2032個のペプチドは、レポーターイオンシグナルが最小閾値を超えており、定量可能と見なされた。

図 1.自動化されたcPILOTプロトコルと並行して22サンプルを処理する実験的なワークフロー。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.22サンプルにわたるペプチドの定量化。 例えば、ペプチドG(ジメチル)AAELMQQK(TMT-11plex)のサンプルMS(上)および^MS3( 下段)スペクトルは、22プレックスの自動cPILOT実験で、軽二メチル化(左下)および重ジメチル化(右下)ピークに対する定量化した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3.プロテオーム発見器2.3を用いた22サンプルの総レポーターイオン強度対log10の豊富さの箱ひげ図。 RAWファイルは、軽くて重いペプチド、動的修飾としてTMTと別々にタンパク質ID、光(+28.031 Da)および重い(+36.076&+35.069 Da)のジメチル化を静的修飾として2回検索した。上記の全ての修飾との組み合わせ検索を、Proteome Discover 2.3を使用して、すべてのチャネルにわたって10個のペプチド強度のログを得るために実行しました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 4.チャンネル全体のレポーターイオン強度の合計からペプチドの豊富さの変化の共効率のバイオリンプロット 126-131 m/z. このペプチドは、光(2373)および重い(2533)定量可能なペプチドに対して12.36および15.03の平均CV値で定量化した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足図 1.単一のペプチドを有するcPILOTの図示。TMT¹²⁶を用いた2つの異なるサンプルと同一体型タグ付けの同位体標識を示し、得られた混合物をLC-MS3用のMSに注入した。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

変数名	値	説明
デソルトサンプ1	1065	デソルトの手順 1 に使用するボリューム
デソルトサンプ2	392	デソルト・ステップ 2 に使用するボリューム
デソルトサンプ3	100	デソルトの手順 3 に使用するボリューム
Devmode	False	False はインキュベーション時間を 30 秒に短縮します- True はプロトコルのインキュベーションタイミングに従います。
DTTVol	3	DTT の体積
フィルタープレート	タルガ	脱塩に使用されるプレート
フィルタープレートボル	600	脱塩量
ハウォーターワッシュ	False	SPEプレートの水の水の打ち上げられる回数
イマサイアボル	2	ヨウドアセアセタミドの体積
ペプチドTMTVol	12.5	TMTラベリング用ペプチドの体積
圧力	100	PPAでのmbar圧力
一時オフセット	1	温度変化
TMTVol	10	追加するアイソバリックタグボリューム
トリスボル	800	消化前にサンプルを希釈する量
トリプシンボル	2	トリプシンの体積
使用ポタイマー	True	True は、必要に応じてプレートに圧力を適用するオプションを表示します。

表 1.自動化された cPILOT プロトコルで使用される変数のリスト。

ディルソース	ディルウェル	Dest	デストウェル	ディルボリューム	ストックソース	ストックウェル	サンプルボル	サンプル ID
8M_Urea	1	サンプル	A1	90	Stock_Samples	A1	10	1
8M_Urea	1	サンプル	A2	90	Stock_Samples	A1	10	2
8M_Urea	1	サンプル	A3	90	Stock_Samples	A1	10	3
8M_Urea	1	サンプル	A4	90	Stock_Samples	A1	10	4
8M_Urea	1	サンプル	A5	90	Stock_Samples	A1	10	5
8M_Urea	1	サンプル	A6	90	Stock_Samples	A1	10	6
8M_Urea	1	サンプル	A7	90	Stock_Samples	A1	10	7
8M_Urea	1	サンプル	A8	90	Stock_Samples	A1	10	8
8M_Urea	1	サンプル	A9	90	Stock_Samples	A1	10	9
8M_Urea	1	サンプル	A10	90	Stock_Samples	A1	10	10
8M_Urea	1	サンプル	A11	90	Stock_Samples	A1	10	11
8M_Urea	1	サンプル	A12	90	Stock_Samples	A1	10	12
8M_Urea	1	サンプル	B1	90	Stock_Samples	A1	10	13
8M_Urea	1	サンプル	B2	90	Stock_Samples	A1	10	14
8M_Urea	1	サンプル	B3	90	Stock_Samples	A1	10	15
8M_Urea	1	サンプル	B4	90	Stock_Samples	A1	10	16
8M_Urea	1	サンプル	B5	90	Stock_Samples	A1	10	17
8M_Urea	1	サンプル	B6	90	Stock_Samples	A1	10	18
8M_Urea	1	サンプル	B7	90	Stock_Samples	A1	10	19
8M_Urea	1	サンプル	B8	90	Stock_Samples	A1	10	20
8M_Urea	1	サンプル	B9	90	Stock_Samples	A1	10	21
8M_Urea	1	サンプル	B10	90	Stock_Samples	A1	10	22
8M_Urea	1	サンプル	B11	90	Stock_Samples	A1	10	23
8M_Urea	1	サンプル	B12	90	Stock_Samples	A1	10	24

表 2.マウス肝ホモジネートおよび8 M尿素の体積。

ソースウェル	ソースウェル2	レポーターイオン	デストウェル1	デストウェル2	ボリューム	サンプル ID
A1	C1	126	A1	E1	10	1
A3	C3	127N	A2	E2	10	2
A5	C5	127C	A3	E3	10	3
A7	C7	128N	A4	E4	10	4
A9	C9	128C	A5	E5	10	5
A11	C11	129N	A6	E6	10	6
B2	D2	129C	A7	E7	10	7
B4	D4	130N	A8	E8	10	8
B6	D6	130C	A9	E9	10	9
B8	D8	131N	A10	E10	10	10
B10	D10	131C	A11	E11	10	11

表 3.ペプチド、タンパク質、ペプチドスペクトルマッチ(PSM)の総数。

	自動cPILOT
	光	重い
タンパク質	1209	1181
ペプチド	6137	5872
PSM	14948	16762

表 4.軽くて重いラベル付きサンプルを使用して、アイソバリックタグをバーコード化します。

ディスカッション

cPILOT は、1 回の実験で最大 24 個のサンプルを分析できる、拡張多重化戦略です。多重化容量は、使用可能な同位体および同位体のタグ付けの組み合わせの数によって異なります。TMTpro⁷の導入は、1回の実験で16個のサンプルをタグ付けすることができるが、cPILOTの限界を32-plexに押し上げることができる。cPILOTは複数のピペットステップで構成され、サンプル調製を行うために広範な注意とユーザーのスキルを必要とします。エキスパートユーザーでも、手動エラーは避けられず、ロボットプラットフォームを使用してcPILOT戦略のサンプルを処理します。cPILOTはペプチドのpH依存的なタグ付けを利用するので、pHは光および重いジメチル化されたサンプルのセットのために維持される必要がある。軽度の酸性塩基性pHは、N末分およびリジン残基の両方のジメチル化をもたらすことができます。cPILOTの利点は、ペプチドN末端がジメチル基で占められるため、イソバリックタグの半分しか必要としないためです。これにより、より多くのサンプルを半分のコストでラベル付けできます。より大きなサンプル数を処理するには、試薬の暴露時間がバッチ内の最初のサンプルと最後のサンプルに対して類似している必要があります。最大32個のサンプルを並列に収容できるピペットディスペンサーは、ロボット液体ハンドリングデバイスを使用することで最適に達成できます。

cPILOTで複数のサンプルを処理するために、手動ワークフローは自動化を組み込むために修正されました。この研究で使用されるロボット液体ハンドラは、96チャンネルと8チャンネルピペット能力を持つ2つのポッドを備えており、グリッパーは利用可能な28デッキの場所にプレートを配置します。液体ハンドラは、陽圧装置、軌道シェーカー、および96ウェルプレートのサンプルを加熱/冷却する装置と統合されています。正圧装置は、クリーンアップ中にSPEプレートでのバッファ交換を補助し、軌道シェーカーはサンプルの渦/混合に役立ちます。ロボットプラットフォームは、バッファとサンプルを96ウェルプレート、インキュベート、渦サンプル、および転写プレートに吸引し、分配するようにプログラムされました。アセトニトリルや水など、粘度が異なる液体は、この方法にプログラムすることもできる特定のピペット処理の考慮事項を必要とします。

cPILOTワークフローは、BCAによるタンパク質定量から、ペプチドをアイソバリックタグ(すなわちTMT)で標識することまで、液体ハンドラシステム上で行った。完全なプロトコルは、ウェルあたり2 mLを保持できる96の深い井戸プレートを使用するようにスケーリングされました。実験開始前にバッファーを用意し、並列サンプル処理を可能にするように96ウェルプレートに添加した。本研究では、マウス肝臓ホモジネートの22のワークフロー複製を深いウェルプレートに添加し、cPILOTプロトコルを介して取られた。最後に、22-plex等量マウス肝臓タグ付きペプチドからなる単一サンプルを質量分析計に注入した。サンプル中のペプチドの存在量に対応するレポーターイオン強度は、液体ハンドラで処理されたサンプルが手動プロトコル(図示されていないデータ)よりも低いCVを有することを示した。ロボットプラットフォームもサンプル処理の再現性を大幅に向上させました。再現性と堅牢性は、多数のサンプルを処理しながら非常に重要な要素です。ピペットエラーはデータの完全な誤解釈につながる可能性があり、ここではロボットプラットフォームが低いサンプル間変動を提供しました。また、ロボットプラットフォームを使用してcPILOTを行い、サンプルの準備に必要な時間を短縮しました。例えば、自動化された方法を開発した後、手動cPILOTの場合は7.5hと比較して22サンプルを処理するために2.5時間が必要でした。本マニュアルと自動のcPILOTワークフローの比較をさらに評価するための実験が当研究室で行われています。当研究室からの以前の報告に基づいて、手動cPILOTのタンパク質レポーターイオン強度のCV%は平均20%であり、外れ値がこの値¹²を超えた。

cPILOTは、細胞、組織、体液などの任意のサンプルタイプに使用することができるペプチドレベルでの化学的誘導体化戦略です。cPILOTは、サンプル多重化を強化し、自動化を組み込むことで、プロテオミクスにおけるハイスループットサンプル多重化を容易にします。このスループットは、さらに疾患と生物学的理解とバイオマーカー発見を進めるために必要です。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk	Fisher Scientific	05-408-120	Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units	EMD Millipore	UFC30DV00
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk	Fisher Scientific	05-408-129	Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
2 ml black deep well plate	Analytical Sales and Services, Inc.	59623-23BKGC	Any brand of black 96-well plate is sufficient
2 ml clear deep well plate	VWR	75870-796
Acetic Acid	J.T. Baker	9508-01
Acetonitrile - MS Grade	Fisher Scientific	A955-4	4 L quantity is not necessary
Agilent 500µL plate	Agilent	203942-100	Reagent plate for adding buffers
Ammonium formate	Acros Organics	208-753-9
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)	Sigma Aldrich	320145-500ML
Analytical balance	Mettler Toledo	AL54
BCA protein assay kit	Pierce Thermo Fisher Scientific	23227
Biomek i7 hybrid	Beckmann		Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples.
C18 packing material (2.5 µm, 100 Å)	Bruker		This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
Centrifuge with plate rotor	Thermo Scientific	69720
Micro 21R Centrifuge	Sorval	5437
Dionex 3000 UHPLC	Thermo Scientific		This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
Dithiothreiotol (DTT)	Fisher Scientific	BP172-5
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C	Sigma Aldrich, Chemistry	596388-1G
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O	Sigma Aldrich, Life Science	F8775-25ML
Formic Acid	Fluka Analytical	94318-250ML-F
Fusion Lumos Mass Spectrometer	Thermo Scientific		This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Hydroxylamine hydrochloride	Sigma Aldrich, Chemistry	255580-100G
Iodoacetamide (IAM)	Acros Organics	144-48-9
Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex)	Thermo Fisher Scientific	90061
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas	Sigma Aldrich, Life Science	T1426-100MG
L-Cysteine	Sigma Aldrich, Chemistry	168149-25G
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)	MP Biomedicals	116005500
pH 10 buffer	Fisher Scientific	06-664-261	Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer	Fisher Scientific	06-664-260	Any brand pH buffer 7 is sufficient
pH meter (Tris compatiable)	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-183	Any brand of a pH meter is sufficient
Protein software (e.g. Proteome Discoverer)	Thermo Scientific
Reservior plate 200ml	Agilent	204017-100
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP	Sigma Aldrich, Chemistry	190020-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%	Sigma Aldrich	156159-10G
Speed-vac	Thermo Scientific	SPD1010	any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient
Stir plate	VWR	12365-382	Any brand of stir plates are sufficient
Targa 20 mg SPE plates	Nest Group, Inc.	HNS S18V	These are C18 cartridges
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer	Sigma Aldrich, Life Science	T7408-100ML
Tris	Biorad	161-0716
Biomek 24-Place Tube Rack Holder	Beckmann	373661
Urea	Biorad	161-0731
Water - MS Grade	Fisher Scientific	W6-4	4 L quantity is not necessary