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요약

결합된 전구체 동위원소 라벨링 및 동위원소 태그(cPILOT)는 사용 가능한 동면 태그와 함께 동시에 분석할 수 있는 샘플 수를 증가시킬 수 있는 향상된 샘플 멀티플렉스 전략입니다. 로봇 플랫폼의 통합은 실험 처리량, 재현성 및 정량적 정확도를 크게 증가시켰습니다.

초록

당사는 높은 처리량 정량적 프로테오믹스 워크플로우, 결합된 전구체 동소라벨링 및 동위원소 태깅(cPILOT)을 결합하여 탠덤 매스 태그 또는 동소바릭 N, N-N-디메틸 류신 이소바릭 태그가 있는 최대 22또는 24개의 샘플을 멀티플렉싱할 수 있는 단일 실험에서 각각 도입했습니다. 이 향상된 샘플 멀티플렉스는 질량 분광법 획득 시간을 상당히 줄이고 고가의 상업용 동소리 시약의 유용성을 증가시킵니다. 그러나, 시료 처리 및 파이프팅 단계의 수동 프로세스는 노동 집약적, 시간이 많이 소요될 수 있으며, 샘플 손실 및 정량적 오류를 소개할 수 있다. 이러한 제한은 자동화의 통합을 통해 극복 될 수있다. 여기서 우리는 수동 cPILOT 프로토콜을 대량 샘플 수(즉, 96 개의 샘플)를 병렬로 준비할 수있는 자동화 된 액체 처리 장치로 옮겼습니다. 전반적으로 자동화는 cPILOT의 타당성과 재현성을 증가시키고 유사한 자동화 장치를 사용하는 다른 연구진의 광범위한 사용을 가능하게 합니다.

서문

질량 분광법(MS)기반 프로테오믹스는 질병 특정 바이오마커를 식별하고, 질병 진행을 이해하고, 치료 개발을 위한 리드를 만드는 데 필수적인 연구 도구입니다. 이는 혈청/혈장, 근해 액액 및 조직1,2와같은 다양한 질병 관련 임상 샘플로부터 달성될 수 있다. 프로테오믹스 바이오마커 의 발견 및 검증은 최근 샘플 멀티플렉스 전략3,4의힘으로 인해 상당한 고려를 얻고 있다. 샘플 멀티플렉싱은 단일 MS 주입5,6내에서 두 개 이상의 샘플 조건의 동시 비교 및 정량화를 가능하게 하는 기술이다. 샘플 멀티플렉싱은 화학, 효소 또는 대사 태그로 여러 샘플의 펩티드 또는 단백질을 바코딩하고 단일 MS 또는 MS/MS 실험에서 모든 샘플에서 MS 정보를 획득함으로써 달성됩니다. 사용 가능한 등소 태그 중에는 iTRAQ(iTRAQ), 상업용 탠덤 질량 태그(TMT), 및 집에서 합성된 이소바릭 N, N-디메틸 류신(DiLeu) 시약이 각각 16-플렉스7 및 21-plex8까지기능한다.

결합된 전구체 동위원소 라벨링 및 동위원소 태그(cPILOT)는 향상된 샘플 멀티플렉싱 기술입니다. cPILOT은 펩타이드 N-테르미니의 등소 라벨링을 빛과 결합 [−(CH3)2]및 무거운 [−(13 C2H3)2]동위원소는 낮은 pH (2.5)에서 동위원소로, 이는 TMT를 사용하여 후속 고pH(8.5) 동위원소 라벨링에 사용할 수 있도록 유지합니다. DiLeu, 또는 iTRAQ 태그3,9,10,11,12,13,14. cPILOT 전략의 이중 라벨링 방식은 예 펩티드를 사용하여 2개의 샘플을 가진 보충 도 1에서 묘사된다. MS2 수준에서 TMT 기반 정량화의 정확도와 정밀도는 간섭효과(15)로불리는 공동 절연 및 공동 단편화 이온을 오염시키는 존재로 인해 손상될 수 있다. 부정확한 리포터 이온 비율의 이러한 제한은 삼중 궤도랩 질량 분광계의 도움으로 극복할 수 있다. 예를 들어, 간섭 효과는 질량 분광계에서 MS1 수준에서 정점에 피크를 격리하고, 선형 이온 트랩에서 MS2 단편화로 빛 또는 무거운 피크를 적용한 다음 HCD-MS3에 대해 가장 강렬한 MS2 단편을 적용하여 정량적 정보를 얻을 수 있다. 리포터 이온생성에 사용할 수 있는 리신 아민 없이 펩티드를 선택할 확률을 높이기 위해, y-1단편을 기반으로 한 선택적 MS3 획득도 사용될 수 있으며, cPILOT9로정량화 가능한 펩타이드의 높은 비율을 초래할 수 있는 접근법이다. 빛과 무거운 라벨링의 조합은 개별 동소 막대 태그로 달성되는 2배의 비율로 샘플 멀티플렉싱 기능을 증가시킵니다. 우리는 최근에 DiLeu 시약16을가진 단 하나 실험에서 24개의 견본까지 결합하기 위하여 cPILOT를 이용했습니다. 또한 cPILOT은 단백질질화(17)및 기타 글로벌 프로테옴(9)을 포함한 산화후 번역 후 변형을 연구하는 데 사용되었으며, 알츠하이머병 마우스모델(11)에서여러 조직 샘플에 걸쳐 응용 프로그램을 시연하고 있다.

견고한 샘플 준비는 cPILOT 실험에서 중요한 단계이며 시간이 많이 걸리고, 힘들고, 광범위할 수 있습니다. 향상된 샘플 멀티플렉스는 광범위한 파이펫팅과 고도로 숙련된 실험실 인력이 필요하며 실험의 재현성에 큰 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 요인이 있습니다. 예를 들어, 모든 샘플에 대해 유사한 반응 시간을 보장하고 빛과 무거운 절제된 시료에 적합한 버퍼 pH를 유지하기 위해 시료를 주의 깊게 다루어야 합니다. 또한 수십~수백 개의 시료를 수동적으로 준비하면 높은 실험 적 오류를 유발할 수 있습니다. 따라서 샘플 준비 가변성을 줄이고 정량적 정확도를 개선하며 실험 처리량을 높이기 위해 자동화된 cPILOT 워크플로우를 개발했습니다. 워크플로우의 여러 측면을 완료할 수 있는 로봇 액체 처리 장치를 사용하여 자동화가 달성됩니다(그림1). 단백질 정량화에서 펩타이드 라벨링에 대한 샘플 제제는 자동화된 액체 처리기에 수행되었다. 자동화된 액체 처리기는 고체 위상 추출(SPE) 플레이트, 궤도 셰이커 및 가열/냉각 장치 간의 완충 교환을 위한 양압 장치(PPA)와 통합됩니다. 로봇 플랫폼에는 플레이트와 버퍼를 수용할 수 있는 28개의 데크 위치가 포함되어 있습니다. 96채널 고정 볼륨 피펫팅 헤드(5-1100 μL)와 8채널 가변 볼륨 프로브(1-1000 μL)의 두 개의 포드가 데크 위치 내에서 플레이트를 전송합니다. 로봇 플랫폼은 소프트웨어를 사용하여 제어됩니다. 사용자는 로봇 액체 처리기를 사용하기 전에 전문적으로 교육을 받아야 합니다. 본 연구는 단일 일괄 처리로 12개 이상의 샘플을 처리하기 위한 노동 집약적일 수 있는 수동 cPILOT 워크플로우 자동화에 중점을 둡니다. cPILOT접근법(11)의처리량을 높이기 위해 cPILOT 프로토콜을 로봇 액체 처리기로 전송하여 10개 이상의 샘플을 병렬로 처리했습니다. 또한 자동화를 통해 샘플 준비 프로세스의 다양한 단계에서 각 샘플에 대해 유사한 반응을 허용하므로 고도로 숙련된 사용자가 수동 cPILOT 중에 수행해야 합니다. 이 프로토콜은 cPILOT을 수행하기 위해 자동화된 액체 처리 장치의 구현에 중점을 둡니다. 본 연구는 이 자동화된 시스템을 사용하기 위한 프로토콜을 설명하고 마우스 간 균질화의 22-plex "개념 증명" 분석을 사용하여 성능을 보여줍니다.

프로토콜

모든 동물 프로토콜은 피츠버그 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 한 남성 제어 마우스 (C57/BLJ) 상업적으로 구입 하 고 피츠버그 대학에서 실험실 동물 자원의 부서에 보관. 마우스는 표준 설치류 실험실 차우 광고 리비툼을 공급하고 12 h 빛 / 어두운 주기에 보관하였다. 간 조직은 수확하여 -80 °C에 저장하였다.

1. 단백질 추출

참고: 이러한 단계는 수동으로 수행됩니다.

  1. 용액 매트릭스 A 비드를 사용하여 기계적 균질화기를 사용하여 8M 우레아의 500 μL을 식염수와 균질화한 마우스 간(100 mg)을 세척하여 20s용 4m/s에 사용할 수 있습니다.
    참고: 본 연구에서, 프로테아제 또는 인산억제제는 첨가되지 않았지만 실험에 기초하여 필요한 경우 완충제에 첨가될 수 있다. 또한, 단백질 추출 단계는 다양한 샘플 유형에 따라 조정할 수 있다.
  2. 새로운 마이크로센심분리기 튜브로 균형화 조직을 옮기고, 헹구고, 용액튜브를 PBS의 100-500 μL과 8M 우레아로 결합한다.
  3. 원심분리기균화된 조직(12,800 x g,4°C 및 15분)을 수집하고 상류체를 수집한다.
    참고: 나머지 단계는 사용자 실험실에서 사용할 수 있는 로봇 액체 처리기에서 수행됩니다. 액체 처리기는 작업자참여가 최소화된 ANCI 지정 플레이트 유형에서 버퍼를 흡입하고 분배할 수 있어야 합니다.
  4. 제조 업체의 지침에 따라 bicinchoninic acid (BCA) 분석기를 사용 하 여 단백질 농도를 결정 합니다.
  5. PPA, 가열/냉각 장치 및 진공 펌프를 켜고 모든 액세서리를 액체 처리기와 연결합니다. 액체 처리기는 컴퓨터에 연결되어 작동할 준비가 되면 파란색 표시등을 표시합니다.
  6. 시약 플레이트 1(96웰 플레이트)은 각각 25mM 1,4-디티오트리톨(DTT), 시스테인 25m MM 30 μL, 25mMM 30 μL, 이오도아세타미드(IAA)의 25mM 30 μL을 각각 1, 2, 3행에 추가한다.
  7. 저수지 플레이트에 8M 우레아와 20m 트라이를 10mM CaCl 2(pH 8.2)로 넣습니다. 5mL의 500 μL을 2mL 깊이 의 우물 판에 넣고 트립신 플레이트 20 μL을 넣고 방법에 의해 지정된 대로 갑판 위치에 배치하십시오.
    참고: IAA와 트립신은 시료에 첨가하기 전에 96웰 플레이트에 첨가하였다.
  8. 간의 알리쿼트 300 μL은 500 μL 튜브로 동형화되어 2mL 깊이의 우물 판에 놓고 프로토콜이 시작될 때까지 4°C에 놓습니다. 이 실험을 위해, 22 개의 알리쿼트가 단일 간 균주에서 생성되었다.
    참고: 내부 품질 관리 표준(예: 소 알파 카제인 또는 기타 외인성 단백질)을 비율 1 μg 표준: 100 μg 단백질 샘플로 추가합니다.
  9. 테이블 1에따라 가변 이름과 값으로 샘플에 추가할 버퍼 볼륨을 정의합니다. BCA에 기초하여 스프레드시트에 샘플 및 정규화 버퍼(8M urea)의 부피를 입력하고소프트웨어(표 2)에부착한다.
    참고: 단백질 농도가 너무 높으면 완충액을 추가로 희석해야 할 수 있습니다. 간 조직에서 샘플에 대한 결과 농도는 10 μg/μL이었다. 완충제의 양은 100 μg 단백질에 최적화되었다.
  10. 4°C에서 샘플 튜브를 제거하고, 자동 액체 처리기의 지정된 데크 위치에 배치하고, 10 분 동안 따뜻하게 할 수 있습니다.
  11. 메서드를 열고 지침에 따라 필요한 팁(1070, 90 및 230 μL) 및 랩웨어를 원하는 위치에 배치합니다. 모든 labware와 팁이 제자리에 있으면 최종 덱 레이아웃을 교차 확인하고 다음을 클릭하여 프로토콜을 계속합니다.
    참고: 가이드 설정은 유지될 프로토콜 및 데크 위치에 따라 특정 랩웨어에 필요한 버퍼 볼륨을 추가하도록 사용자에게 알립니다.

2. 샘플 감소, 알킬레이션 및 소화

  1. 230 μL 팁을 적재하고 저수지에서 8M 우레아의 90 μL을 흡인하고 검은 색 2 mL 깊이 우물 플레이트의 행 1에 분배합니다. 팁을 언로드합니다. 8M 우레아가 22개의 샘플에 해당하는 모든 우물에 추가될 때까지 이 단계를 반복한다.
    참고: 데나션 버퍼는 단백질 3차원 구조를 풀어 트립신이 단백질을 효과적으로 작용하고 분해할 수 있도록 1차 구조를 산출합니다. 8채널 파이펫은 8채널에 대해 서로 다른 볼륨을 흡인할 수 있으며 랩웨어의 다른 위치에 분배할 수 있습니다. 이 단계에서 모든 채널은 소프트웨어에 정의된 것과 동일한 볼륨을 흡인시켰습니다.
  2. 데나처레이션 버퍼를 추가한 후, 8채널 파이펫을 사용하여 마우스 간 균형의 90 μL 팁과 흡인 10 μL(100 μg에 해당)을 블랙 2 mL 딥 웰 플레이트에 적재한다. 팁을 언로드합니다. 모든 22개의 샘플이 전송될 때까지 이 단계를 반복합니다.
  3. 각 전달 후, 1:1 비율을 나타내기 위해 단백질을 완충액과 혼합할 수 있도록 잘 내용물의 50 μL을 흡인하고 분배하는 혼합 단계를 수행한다.
    참고 : 재고 균형 샘플을 제거하고 -80 ° C에 배치합니다.
  4. 변성 단백질을 줄이기 위해 시약 판 1에서 90 μL 팁의 한 행을 적재하고 DTT의 3 μL을 흡인합니다. DTT를 블랙 2mL 딥 웰 플레이트의 1과 2열로 분배하고 팁을 언로드합니다.
    참고: 단백질: DTT 어금니 비율은 이황화물 결합의 감소를 위해 1:40에 유지됩니다. 어금니 비율에 대한 계산은 66.5 x 103 g/mol인 소 혈청 알부민(BSA)의 단백질 질량을 기반으로 합니다.
  5. 300 rpm에서 37 °C에서 37 °C에서 알루미늄 호일로 샘플 플레이트를 밀봉하십시오.
  6. 사용 직전에 시약 플레이트 1의 3열에 0.25 M IAM의 30 μL을 추가하고 갑판에 놓습니다. 샘플 플레이트의 봉인을 풀고 갑판으로 돌아갑니다.
    참고: IAM은 빛에 민감합니다.
  7. 90 μL 팁의 한 행을 로드하고, 시약 판 1에서 IAM의 6 μL을 3행에서 흡면하고, 샘플 플레이트의 1행으로 분배한다. 팁을 언로드합니다.
    참고: 단백질: IAM 어금니비는 각 시료에 대해 1:80에 유지됩니다. 이 반응은 어둠 속에서 이루어져야 합니다.
  8. 시료 판을 밀봉하고 가열/냉각 장치에서 300rpm에서 30분 동안 4°C에서 배양하십시오.
    참고 : 플레이트를 밀봉하면 샘플이 빛, 증발 및 우물에서 유출되는 것을 방지하기 위해 수행됩니다.
  9. 샘플 플레이트의 봉인을 풀고 90 μL 팁의 한 행을 로드하고 2행2에서 시약 판 1에서 시스테인 5 μL을 흡인합니다. 샘플 플레이트의 1과 2 행에 분배하고 팁을 언로드합니다. 실온에서 30분 동안 배양하십시오.
    참고: 단백질: L-시스테인 어어 비율은 1:40에 유지됩니다.
  10. 시료 판을 궤도 셰이커에 놓고 30분 동안 1800rpm의 시간 제비 쉐이크를 수행합니다.
  11. 20m TS 버퍼의 800 μL을 샘플 플레이트의 각 웰에 10mM CaCl2(pH 8.2)를 추가하여 우레아 농도를 2M로 희석하여 팁을 언로드합니다.
    참고: 트립신 활동은 더 높은 우레아 농도에서 방해되므로 2M 미만으로 감소해야 합니다. 이 연구는 50: 14h의 트립신 어금니 비율을 트립신 어금니 비율로 수행하였다.
  12. 트립신 20 μL을 행 1에 넣고, 96개의 웰 플레이트의 열 1-12를 추가하고 갑판에 지정된 위치에 놓습니다.
  13. 90 μL 팁의 한 행을 로드하고, 트립신 플레이트 행 1에서 트립신 2 μL을 흡인하고, 샘플 플레이트의 행 1과 2로 분배합니다. 팁을 언로드합니다.
  14. 플레이트를 밀봉하고 가열/냉각 장치에서 600rpm에서 37°C에서 14시간 동안 배양합니다.
  15. 인큐베이션 후, 샘플 플레이트를 봉인 해제하고 행 3, 깊은 우물 수집 플레이트의 열 1- 12에 5 % 포릭 산을 추가하고 지정된 갑판에 배치합니다.
  16. 포믹산판 3행으로부터 5% 포믹산의 150 μL을 첨가하여 소화를 멈추고 1열과 2열에서 시료판에 분배한다. 팁을 언로드합니다.

3. 탈염 단계 1

  1. 타르가 C-18 물질의 20 mg을 포함하는 SPE 플레이트로 펩티드를 탈염. 모든 버퍼 교환의 체적을 600 μL로 수정하고 압력을 100mbar로 수정합니다.
  2. 1070 μL 팁을 적재하고 아세토닐릴600 μL을 흡인하고 SPE 플레이트 1과 2행에 분배합니다. SPE 플레이트를 PPA에 놓고 압력을 가합니다.
  3. 동일한 팁을 사용하여 아세토닐릴60μL을 흡인하고 SPE 플레이트 1과 2행으로 분배합니다. SPE 플레이트를 PPA에 놓고 압력을 가합니다.
    참고: 유동은 흡입 펌프를 사용하여 낭비하도록 배수할 수 있습니다.
  4. 1070 μL 팁과 버퍼 A의 흡면 600 μL(0.1% 포믹산의 100% 물)을 적재하고 SPE 플레이트 1과 2행에 분배합니다. SPE 플레이트를 PPA에 놓고 압력을 가합니다.
    참고: 버퍼의 부피가 크게 감소하지 않으면 압력이나 시간을 크게 늘려보십시오.
  5. 1070 μL 팁의 2 행을 적재하고, 소화된 시료의 534 μL을 흡인하고, SPE 플레이트 1과 2행에 분배합니다. SPE 플레이트를 PPA에 놓고 압력을 가합니다. 모든 샘플이 로드될 때까지 이 단계를 반복합니다.
    참고: 포믹산을 첨가한 후 총 부피가 1068μL이 되고 시료가 두 번의 패스에 추가되기 때문에.
  6. 사용된 1070 μL 팁의 2행을 적재하고, 버퍼 A의 600 μL을 흡인하고, SPE 플레이트 1과 2행에 분배합니다. SPE 플레이트를 PPA에 놓고 압력을 가합니다.
  7. 위의 단계를 한 번 반복하여 샘플을 청소합니다.
  8. 1열 1070 μL 팁, ACN 의 600 μL 을 흡인합니다: 물(60:40) 및 SPE 플레이트 1과 2행에 분배합니다. SPE 플레이트를 수집 판 위에 놓고 PPA를 사용하여 펩티드를 엘테우하고 압력을 가합니다.
  9. 상기 단계를 반복하여 수집 판에서 펩티드를 엘로트한다. 수집 판을 건조시키고 추가 처리가 될 때까지 -80 ° C로 보관하십시오.

4. 디메틸화 라벨링(펩타이드 N-테르미니)

  1. 필요한 팁(1070, 90 및 230 μL)과 랩웨어를 소프트웨어의 원하는 위치에 배치합니다. 모든 labware와 팁이 제자리에 있으면 최종 덱 레이아웃을 교차 확인하고 다음을 클릭하여 프로토콜을 계속합니다.
  2. 시약 플레이트 2에, 1 % 아세트산의 450 μL, 50 μL 라이트 포름알데히드 (CH2O), 무거운 포름 알데히드(13CD 2O), 및 1,2,3 및 4 행에 포름산의 150 μL을 추가합니다.
  3. 시약 플레이트 3은 50 μL의 빛 CB, 무거운 CB의 50 μL을 암모니아의 행 1 과 2 및 50 μL에 3 및 4 행에 추가합니다.
  4. 230 μL 팁의 2행을 적재하고 시약판 2의 1열에서 1% 아세트산1%의 아세트산을 흡인하고, 샘플 플레이트 2(탈염 단계로부터 의한 수집판)에서 말린 펩티드에 분배하고 1800rpm에서 5분 동안 시간적 흔들림을 수행한다.
  5. 적재 90 μL 팁과 흡인 16 μL 60 mM (4%) CH2O (37% wt/v) 시약 플레이트 2의 행 2에서 샘플 플레이트의 행 1에 분배한다. 팁을 언로드합니다.
  6. 90 μL 팁의 1 행로드 및 흡인 16 μL 60 mM (4%) 13 CD2O (20% wt/v) 시약 플레이트 2의 행 3에서 샘플 플레이트의 행 2에 분배한다. 팁을 언로드합니다.
    참고: 이 스터디 행 1은 빛과 행 2에 해당하며 무거운 절제된 샘플에 해당합니다(그림 1참조).
  7. 90 μL 팁의 2행과 흡면 16 μL의 2열은 24m NaBH3CN 및 24m NaBD3CN에서 시약 판 3의 행 1 과 2CN에서 각각 1 및 2행으로 분배한다.
  8. 팁을 내리고 궤도 셰이커를 사용하여 1800 rpm에서 15분 동안 시간 조정된 쉐이크를 수행합니다.
    참고: 시아노보로하이드라이드 나트륨을 첨가하면 이 단계가 일괄 처리당 한 번 수행되는 실험 간의 가변성을 감소시키기 위해 반응을 개시합니다.
  9. 90 μL 팁의 2행과 흡인 32 μL 1% 암모니아(~28-30% v/v)를 시약판 3행과 4개행에서 적재하고 샘플 플레이트 2의 1및 2열에 각각 분배한다. 팁을 언로드합니다.
    참고: 암모니아를 추가하면 반응이 중지되므로 실험 간의 가변성을 감소시켜 이 단계는 일괄 처리당 한 번 수행됩니다.
  10. 동일한 양의 빛과 무거운 (1:1) 디메틸화 된 펩타이드를 새로운 2 mL 깊이의 우물 판에 결합하여 탈염을 합니다.
    참고: 이 연구에서행 1에서 의 우물 내용물의 90 μL은 샘플 플레이트 2에서 새로운 2mL 수집 플레이트(샘플 플레이트 3)까지 행 2의 90 μL과 결합되었다. 빛의 비율: 무거운 혼합은 실험 프로토콜에 따라 다르며, 이 연구에서는 1:1 비율이 사용되었다.
  11. 230 μL 팁의 2 행을 적재하고 결합 된 샘플에 5 % 포믹 산의 32 μL을 흡인하고 1800 rpm에서 30 s에 대한 시간 적 흔들림을 수행합니다.
    참고: 디메틸화 효율은 반응 혼합물의 pH에 따라 달라지며 완충pH의 변화는 펩타이드 N-테르미니의 불완전한 라벨링을 초래할 것이다. 펩타이드 N-테르미니에서 동적 수정으로 검색할 때 디메틸화 효율은 97% 이상이어야 한다. 이 연구에서는 빛과 무거운 펩타이드의 라벨링 효율이 각각 99.7% 및 99.5%였다.

5. 탈염 단계 2

  1. 결합된 견본을 위한 디솔트 단계 1과 유사한 견본 탈염을 수행합니다.
  2. 속도 진공 을 사용하여 샘플 플레이트의 샘플을 건조하고 추가 처리 될 때까지 -80 °C에서 저장합니다.

6. 이소바릭 태그 (리스 잔류물)

  1. 가이드 랩웨어 설정을 따라 필요한 팁(1070, 90 및 230 μL)을 적절한 버퍼로 배치합니다. 모든 labware와 팁이 제자리에 있으면 최종 덱 레이아웃을 교차 확인하고 다음을 클릭하여 프로토콜을 계속합니다.
  2. 100m 트리에틸 암모늄 중탄산염(TEAB), 30 μL 의 하이드록실라민(10%w/v)을 1열에 넣고 시약판 42를 250μL에 추가합니다. 표 3의스프레드시트에 따라 2mL 깊이 플레이트에 TMT 튜브를 놓습니다.
  3. 태그된 펩티드를 풀링하기 위해 튜브 랙 홀더에 빈 1.5mL 튜브를 보관하십시오. 건조된 샘플 플레이트를 P9 및 TMT 처리 플레이트에 P14에 놓습니다.
  4. 펩티드를 재구성하기 위해, 230 μL 팁과 100 μL의 흡인 100 μL 100 μL 100 μL (TEAB) 버퍼 (pH ~8.5) TEAB 플레이트에서 열 1에서 1 행에서 건조 펩티드에 분배 3 샘플 플레이트 3. 1800 rpm에서 30 s의 궤도 셰이커에 플레이트를 놓습니다.
    참고: 1 μg/μL의 농도로 100 μg의 디메틸화 펩티드를 재구성합니다.
  5. TMT 플레이트의 H12에서 90 μL 팁과 흡인 10 μL의 분해10 μL을 건조 한 TMT 튜브각각에 분배합니다.
  6. TMT 튜브, 소용돌이를 제거하고 튜브를 빠르게 회전하고 깊은 우물 판으로 갑판으로 돌아갑니다.
  7. 90 μL 팁의 1행을 적재하고 합산 된 디메틸화 펩타이드의 12.5 μL을 흡인하고 TMT 처리 플레이트의 행 1에 분배합니다. 팁을 언로드합니다.
    참고: TMT: 펩티드 비율은 이 실험을 위해 1:8에서 유지되었다.
  8. 90 μL 팁의 1 행을 적재하고 TMT의 10 μL을 흡인하고 TMT 처리 플레이트의 행 1에 분배합니다. 팁을 내리고 1800 rpm에서 1 시간 동안 시간 조정 된 쉐이크를 수행합니다.
  9. 90 μL 팁의 1 행을 적재하고 TEAB 플레이트에서 2행에서 하이드록실라민(10% w/v)을 흡인하고 TMT 처리 플레이트의 행 1에 분배합니다. 팁을 내리고 1800 rpm에서 15 분 동안 시간 조정 된 흔들림을 수행합니다.
  10. TMT 프로세싱 플레이트에서 1.5mL 튜브에 TMT 표지 펩타이드의 30.5 μL을 결합합니다. 각 전송 후 팁을 언로드합니다.
  11. 풀이 된 샘플로 튜브를 제거하고 아세토닐을 증발시키기 위해 건조하십시오. 0.2mL의 물에서 펩티드를 0.1% 포름산으로 재구성하고 갑판으로 돌아갑니다.
    참고: 동종 태깅의 라벨링 효율은 pH에 특정하며 라벨링 효율은 제조업체의 지침당 98% 이상이어야 합니다. 본 연구에서는 리신의 TMT 라벨링 효율이 각각 99.4% 및 99.5%였다.

7. 탈염 단계

  1. 한 샘플에 대해 탈염 1과 유사한 시료 탈솔화를 수행합니다.
  2. 시료를 건조시키고 분석할 때까지 -80°C에 보관하십시오.

8. 액체 크로마토그래피 - 탠덤 질량 분광법 (LC-MS / MS) 및 MS3

  1. MS 급수에서 펩티드를 0.1% FA로 재구성하여 ~1 μg/μL 농도를 얻습니다. 0.65 μm 필터를 포함하는 마이크로 센트심분리기 튜브로 샘플을 필터링합니다. 원심분리기 펩타이드는 12,000 x g에서 3분 동안 자동 샘플러 바이알로 흐름을 배치합니다.
    참고: 펩티드 농도는 원하는 경우 이 단계에서 확인할 수 있다. 펩티드는 LC-MS 급수에서 재구성되어야 하며 BCA 펩티드 분석의 대상이 될 것입니다. 이 연구에서는 펩타이드 BCA 분석이 수행되지 않았으며 모든 펩티드 양은 초기 단백질 BCA 분석에 기초했다.
  2. 다음과 같이 이동 상 버퍼를 준비하십시오 : 0.1 % FA (A)와 100 % ACN이있는 물 100 % (v / v)와 0.1 % FA (B)로.
  3. C18 재질 2cm(3 μm, 100 Å 모공 크기)로 포장된 트랩 컬럼에 1 μL의 샘플을 주입합니다.
    참고 : 트랩의 샘플 청소는 다음과 같습니다 : 10 분, 100 % A; 2ΜL/min 2D 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하.
  4. 분석 분리 방법을 실행합니다. C18 재료 (2.5 μm, 100 Å)로 포장 된 100 μm i.d. x 26cm 레이저 당겨진 팁 융합 실리카 모세관 컬럼을 사용하십시오. 그라데이션은 0-10분, B 10%; 10-30 분, 10-15 % B; 30-75 분, 15-30% B; 75-88 분, 30-60% B; 88-92 분, 60-90 % B; 92-99 분, 90% B; 99-100 분, 90-10 % B, 100-120 분, 10 % B; 300 nL/분, 120 분.
  5. 분석 분리 방법이 실행되는 동안 질량 분광계에 대한 데이터 수집을 실행합니다.
    1. MS 측량 스캔에 대한 다음 매개변수를 사용하십시오: 375-1,500 m/z,120,000 해상도, 사이클 시간 3 s(최고 속도), 자동 게인 제어(AGC) 대상 4.0e5, 최대 주입 시간 50 ms.
    2. 이온 트랩을 사용하는 CID-MS/MS에 대해 다음과 같은 매개 변수를 사용합니다: 결과당 데이터 종속 수집(DDA) 스캔, 2m/z 격리 폭, 35% 정규화된 충돌 에너지(NCE), 0.25 활성화 Q, 10ms 활성화 시간, 1.0e4 AGC, 100ms 최대 주입 시간.
    3. HCD-MS3 SPS 10에 대한 다음 매개 변수를 사용: 스캔 범위 100-400 m/z,종속 스캔 수 10, AGC 5.0e4, 최대 사출 시간 118 ms, HCD 충돌 에너지 55%, MS2 격리 창 2.

9. 데이터 분석

  1. 적절한 데이터베이스에 대한 단백질 분석 소프트웨어를 사용하여 단백질 및 펩타이드 목록에 대해 생성된 RAW 파일을 검색합니다.
    참고: 이 연구에서 생성된 RAW 파일은 마우스 Uniprot 데이터베이스에 대해 검색되었습니다.
  2. 하나의 RAW 파일에 빛과 무거운 라벨이 모두 있기 때문에 가볍고 무거운 절제된 펩타이드에 대한 두 개의 워크플로우로 각 파일을 검색합니다.
  3. 마우스 Uniprot 데이터베이스 (07/13/2019)에 대 한 RAW 파일을 검색 53035 다음 매개 변수와 순서: 트립신 분열 최대 두 놓친 분열, 최소 6 개의 아미노산 길이, 15 ppm 부모 질량 내성, 1 다 단편화 허용 오차 정적 수정: 빛 디메틸화 (+28.031, 펩타이드 N-테르미누스) 또는 무거운 디메틸레이션 (+36.076 Da, 펩타이드 N-테르미누스), 카르바미도미틸 (+57.01 Da) C), 동적 수정: 산화 (+15.995 다, M), 11-플렉스 이소바릭 태그 (229.163 Da, K), 1 % FDR, 기자 이온 정량화 30 ppm 피크 통합 허용 오차, 통합 방법에 대한 가장 자신감 있는 센트로이드.
    참고: 무거운 디메틸화 피크는 또한 빛 동전 피크에서 ~7 Da (+35.069 Da, 펩타이드 N-terminus)인 또 다른 수정을 포함하고 따라서 다른 검색 노드도이 수정을 포함하도록 통합되어야한다.
  4. 강도에 따라 리포터 이온 정량화를 수행, 65% SPS 질량 일치, 평균 S/N 비율 10, 동위원소 보정, 정상화 및 스케일링이 수행되지 않았다.
    참고: 정규화 및 스케일링은 시료에 첨가된 총 펩티드 양 또는 특정 단백질에 기초하여 수행될 수 있다. QC 샘플은 두 꼬리 내부 참조 배율18을기반으로 배치 간 또는 배치 내 정규화를 위한 채널에 포함될 수도 있습니다. 다른 TMT 채널의 동위원소 오염은 검색에 제공되지 않았으며, 사용자는 상이한 리포터 이온의 동위원소 오염을 추가하는 것이 좋습니다.

결과

도 2는 워크플로 복제를 포함하는 22-플렉스 cPILOT 실험으로부터 모든 22 리포터 이온 채널에서 확인된 펩티드의 대표적인 MS 데이터를 나타낸다. 도 2(상단)는 펩티드에 편입된 단일 디메틸 그룹을 나타내는 4Da m/z 간격으로 분리된 이중 충전 피크 쌍을 묘사한다. 가볍고 무거운 절제된 피크 쌍은 펩티드의 서열을 산출하기 위해 독립적으로 분리되고 단편화되었다. 펩타이드의 서열은 G(디메틸)AAELMQQK(TMT-11plex)이며 단백질 베타인 호모시스테인 S-메틸 트랜스퍼라제에 해당한다. 빛과 무거운 디메틸화피크(도시되지 않음)에대해 가장 강렬한 단편이 MS3 단편화및 리포터 이온(m/z 126-131)을 위해 더 격리되었다(m/z 126-131)는 도 2(아래)에 도시되었다. 리포터 이온 강도는 샘플내펩타이드 풍부에 직접 비례한다. 샘플의 펩타이드 풍부는 로봇 플랫폼의 파이펫팅 능력이 22개의 샘플에서 상당히 균일하다는 것을 의미합니다. 전반적으로, 이 22-플렉스 cPILOT 실험결과 1326 (1209 빛/1181 무거운) 단백질 식별 3098 (6137 빛/5872 무거운) 펩티드(표 4). 그림 3은 로그10 풍부함과 전체 리포터 이온 강도의 상자 플롯을 보여 주며, 22개 채널에서 샘플 간 가변성이 적다. 총 자동화에 대한 평가는 22개의 샘플에서 각 단백질에 걸쳐 리포터 이온 풍부의 오차를 검사하여 수행하였다. 도 4는 로봇 플랫폼을 사용하여 샘플 처리가 CV 값이 매우 낮게 생성되었다는 것을 보여줍니다. 구체적으로, 3098펩타이드를 통해 리포터 이온 풍부의 평균 CV는 각각 12.36% 및 15.03%로 가볍고 무거운 디메틸화 펩타이드에 대해 확인되었다. 이들 펩타이드 중 2032는 최소 임계값 이상의 리포터 이온 신호를 가지고 있으며 정량화 가능한 것으로 간주되었다.

figure-results-1133
그림 1. 자동화된 cPILOT 프로토콜과 병행하여 22개의 샘플을 처리하는 실험 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-1472
그림 2. 22개의 견본에 걸쳐 펩티드의 정량화. 실시예 MS(위)와 MS3(하단) 펩티드 G(디메틸)AAELMQQK(TMT-11plex)의 스펙트럼은 22-플렉스 자동 cPILOT 실험에서 정량화되어 가벼운 디메틸화(왼쪽 아래) 및 무거운 디메틸화(오른쪽 아래) 피크이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-1922
그림 3. 총 리포터 이온 강도대비 100개의 풍부한 22개의 샘플이 프로테오메 디스커버러 2.3을 사용한다. RAW 파일은 동적 수정으로 TMT와 별도로 빛과 무거운 펩티드, 단백질 ID를 두 번 검색, 빛 (+28.031 Da) 및 무거운 (+36.076 & +35.069 Da) 정적 수정으로 펩타이드 N-테르미니에서 디메틸화. 위의 모든 수정과 결합된 검색은 Proteome Discover 2.3을 사용하여 모든 채널에서 펩타이드 강도의 로그 10 풍부를 획득하여 실행하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2479
그림 4. 126-131 m/z채널에 걸쳐 합계 기자 이온 강도에서 펩티드 풍부의 변화의 공동 효율적인 바이올린 플롯. 펩타이드는 빛(2373)과 중성(2533)의 평균 CV 값12.36 및 15.03으로 정량화되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 1. 단일 펩타이드를 곁들인 cPILOT의 일러스트레이션. TMT126을사용하여 두 개의 상이한 샘플 및 동위원소 태깅의 등소 라벨링을 나타내고, 결과 혼합물은 LC-MS3에대한 MS에 주입되었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

변수 이름값설명
데솔삼11065디솔트 1 단계에 사용할 부피
디솔트삼2392디솔트 2 단계에 사용할 부피
데솔삼3100디솔트 단계 3에 사용할 부피
DevmodeFalse거짓은 인큐베이션 시간을 30초로 줄입니다- True는 프로토콜의 인큐베이션 타이밍을 따릅니다.
DTTVol3DTT 의 볼륨
필터 플레이트Targa탈염에 사용되는 플레이트
필터 플레이트Vol600탈염용 볼륨
하워터와세스FalseSPE 플레이트의 물 세초 수
IAMVol2요오도아세타미드의 부피
펩티드TMTVol12.5TMT 라벨링을 위한 펩타이드의 부피
압력100PPA의 mbar 압력
템오프셋1온도 변화
TMTVol10추가할 등부 태그 볼륨
트리스볼800소화 전에 샘플을 희석하는 부피
트립신볼2트립신의 볼륨
유즈팝타이머사실True는 필요한 경우 플레이트에 압력을 가할 수 있는 옵션을 표시합니다.

표 1. 자동화된 cPILOT 프로토콜에 사용되는 변수 목록입니다.

딜소스딜웰Dest데스트웰딜볼륨스톡소스스톡웰샘플Vol샘플 ID
8M_Urea1샘플A190Stock_SamplesA1101
8M_Urea1샘플A290Stock_SamplesA1102
8M_Urea1샘플A390Stock_SamplesA1103
8M_Urea1샘플A490Stock_SamplesA1104
8M_Urea1샘플A590Stock_SamplesA1105
8M_Urea1샘플A690Stock_SamplesA1106
8M_Urea1샘플A790Stock_SamplesA1107
8M_Urea1샘플A890Stock_SamplesA1108
8M_Urea1샘플A990Stock_SamplesA1109
8M_Urea1샘플A1090Stock_SamplesA11010
8M_Urea1샘플A1190Stock_SamplesA11011
8M_Urea1샘플A1290Stock_SamplesA11012
8M_Urea1샘플B190Stock_SamplesA11013
8M_Urea1샘플B290Stock_SamplesA11014
8M_Urea1샘플B390Stock_SamplesA11015
8M_Urea1샘플B490Stock_SamplesA11016
8M_Urea1샘플B590Stock_SamplesA11017
8M_Urea1샘플B690Stock_SamplesA11018
8M_Urea1샘플B790Stock_SamplesA11019
8M_Urea1샘플B890Stock_SamplesA11020
8M_Urea1샘플B990Stock_SamplesA11021
8M_Urea1샘플B1090Stock_SamplesA11022
8M_Urea1샘플B1190Stock_SamplesA11023
8M_Urea1샘플B1290Stock_SamplesA11024

표 2. 마우스 간 균형 및 8 M 우레아의 부피.

소스웰소스웰2기자 이온데스트웰1데스트웰2볼륨샘플 ID
A1C1126A1E1101
A3C3127NA2E2102
A5C5127CA3E3103
A7C7128NA4E4104
A9C9128CA5E5105
A11C11129NA6E6106
B2D2129CA7E7107
B4D4130NA8E8108
B6D6130CA9E9109
B8D8131NA10E101010
B10D10131CA11E111011

표 3. 펩타이드, 단백질 및 펩타이드 스펙트럼 일치(PSM)의 총 수.

자동화된 cPILOT
빛무거운
단백질12091181
펩 티 드61375872
PSM1494816762

표 4. 가볍고 무거운 라벨이 붙은 샘플로 동면 태그를 바코딩합니다.

토론

cPILOT은 단일 실험에서 최대 24개의 샘플을 분석할 수 있는 향상된 멀티플렉싱 전략입니다. 멀티플렉싱 용량은 사용 가능한 동위원소 및 동소바릭 태그 조합의 수에 따라 달라집니다. 단일 실험에서 16개의 샘플을 태그할 수 있는 TMTpro7의도입은 cPILOT의 한계를 32-플렉스로 밀어낼 수 있다. cPILOT은 여러 파이펫팅 단계로 구성되어 있으며 샘플 준비를 수행하기 위해 광범위한 관리 및 사용자 기술이 필요합니다. 전문 사용자도 마찬가지인 수동 오류는 불가피하며, 이는 로봇 플랫폼을 사용하여 cPILOT 전략에서 샘플을 처리하도록 유도합니다. cPILOT은 펩티드의 pH 의존적 태깅을 활용하기 때문에, pH는 빛과 무거운 절제된 시료 세트를 위해 유지되어야 한다. 온화한 산성 기본 pH는 N-테르미니와 리신 잔류물의 디메틸화를 초래할 수 있습니다. cPILOT의 장점은 펩타이드 N-테르미니가 디메틸 군으로 점유되기 때문에 동소바릭 태그의 절반만 필요하다는 것이다. 이렇게 하면 비용의 절반으로 라벨을 붙일 샘플수가 더 많이 듭니다. 더 큰 샘플 번호를 처리하려면 시약 노출 시간이 첫 번째 및 일괄 처리의 마지막 샘플과 유사해야 합니다. 로봇 액체 처리 장치를 사용하여 최대 32개의 샘플을 병렬로 수용할 수 있는 파이펫 디스펜서를 가장 잘 달성할 수 있습니다.

cPILOT에 의해 여러 샘플을 처리하기 위해 자동화를 통합하기 위해 수동 워크플로우가 개정되었습니다. 이 연구에 사용되는 로봇 액체 처리기는 96 채널 및 8 채널 파이펫 팅 능력을 가진 두 개의 포드를 가지고 있으며, 그리퍼는 플레이트를 사용 가능한 28 데크 위치에 배치합니다. 액체 처리기는 양압 장치, 궤도 셰이커 및 96 웰 플레이트에서 시료를 가열/냉각하는 장치와 통합됩니다. 양압 장치는 세척 중에 SPE 플레이트에서 완충교환을 수행하는 데 도움이 되며, 궤도 셰이커는 시료를 소용돌이/혼합하는 데 도움이 됩니다. 로봇 플랫폼은 버퍼와 샘플을 96웰 플레이트, 인큐베이션, 소용돌이 샘플 및 전송 플레이트로 흡인 및 분배하도록 프로그래밍되었습니다. 아세토닐릴 및 물과 같이 점도가 다른 액체에는 또한 방법으로 프로그래밍할 수 있는 특정 파이펫 팅 고려 사항이 필요합니다.

CPILOT 워크플로우는 BCA의 단백질 정량화에서 부터 이소바릭 태그(즉, TMT)로 펩티드를 라벨링하는 것까지 액체 처리기 시스템에서 수행되었다. 전체 프로토콜은 잘 당 2mL를 보유 할 수있는 96 깊은 우물 플레이트를 사용하도록 조정되었습니다. 버퍼는 실험의 시작 전에 준비되었고 병렬 샘플 처리를 허용하도록 96 웰 플레이트에 첨가하였다. 본 연구에서는, 마우스 간 균모의 22개의 워크플로복제를 깊은 우물 판에 첨가하고 cPILOT 프로토콜을 통해 취해졌다. 마지막으로, 22-플렉스 평형 마우스 간 태그 펩티드로 구성된 단일 샘플이 질량 분광계에 주입되었다. 샘플에서 펩타이드 풍부에 대응하는 리포터 이온 강도는 액체 처리기로 처리된 시료가 수동프로토콜(도시되지 않은 데이터)보다낮은 CV를 갖는 것으로 나타났다. 로봇 플랫폼은 또한 샘플 처리의 재현성을 크게 향상시켰습니다. 재현성과 견고성은 많은 수의 샘플을 처리하는 동안 매우 중요한 요소입니다. 파이프 팅 오류는 데이터의 완전한 잘못된 해석으로 이어질 수 있으며 여기에 로봇 플랫폼은 낮은 샘플 간 변형을 제공. 또한 cPILOT용 로봇 플랫폼을 사용하면 시료를 준비하는 데 필요한 시간이 단축되었습니다. 예를 들어, 자동화된 방법을 개발한 후 수동 cPILOT의 경우 7.5h에 비해 22개의 샘플을 처리하는 데 2.5h가 필요했습니다. 수동 및 자동화된 cPILOT 워크플로우의 비교를 추가로 평가하기 위한 실험이 실험실에서 진행 중입니다. 우리의 실험실에서 이전 보고서에 따르면, 매뉴얼 cPILOT에서 단백질 리포터 이온 강도의 CV%의 CV%는 이 값을 초과하는 일부 이상치와 평균 20%였다12.

cPILOT은 펩티드 수준에서 화학 유도 전략으로, 세포, 조직 및 체액과 같은 임의의 샘플 유형에 사용될 수 있다. cPILOT은 향상된 샘플 멀티플렉스를 제공하며 자동화를 통합하면 프로테오믹스에서 고처리량 샘플 멀티플렉스를 용이하게 할 수 있습니다. 이 처리량은 질병 및 생물학 이해 및 바이오마커 발견을 더 발전시키기 위하여 필요합니다.

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

저자는 밴더빌트 대학 스타트업 펀드와 NIH 상(R01GM117191)을 RASR에 수여합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pkFisher Scientific05-408-120Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter unitsEMD MilliporeUFC30DV00
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pkFisher Scientific05-408-129Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
2 ml black deep well plateAnalytical Sales and Services, Inc.59623-23BKGCAny brand of black 96-well plate is sufficient
2 ml clear deep well plateVWR75870-796
Acetic AcidJ.T. Baker9508-01
Acetonitrile - MS GradeFisher ScientificA955-44 L quantity is not necessary
Agilent 500µL plateAgilent203942-100Reagent plate for adding buffers
Ammonium formateAcros Organics208-753-9
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)Sigma Aldrich320145-500ML
Analytical balanceMettler ToledoAL54
BCA protein assay kitPierce Thermo Fisher Scientific23227
Biomek i7 hybridBeckmannAny liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples.
C18 packing material (2.5 µm, 100 Å)BrukerThis item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
Centrifuge with plate rotorThermo Scientific69720
Micro 21R CentrifugeSorval5437
Dionex 3000 UHPLCThermo ScientificThis model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
Dithiothreiotol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13CSigma Aldrich, Chemistry596388-1G
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2OSigma Aldrich, Life ScienceF8775-25ML
Formic AcidFluka Analytical94318-250ML-F
Fusion Lumos Mass SpectrometerThermo ScientificThis model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Hydroxylamine hydrochlorideSigma Aldrich, Chemistry255580-100G
Iodoacetamide (IAM)Acros Organics144-48-9
Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex)Thermo Fisher Scientific90061
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreasSigma Aldrich, Life ScienceT1426-100MG
L-CysteineSigma Aldrich, Chemistry168149-25G
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
pH 10 bufferFisher Scientific06-664-261Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 bufferFisher Scientific06-664-260Any brand pH buffer 7 is sufficient
pH meter (Tris compatiable)Fisher Scientific (Accumet)13-620-183Any brand of a pH meter is sufficient
Protein software (e.g. Proteome Discoverer)Thermo Scientific
Reservior plate 200mlAgilent204017-100
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CPSigma Aldrich, Chemistry190020-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%Sigma Aldrich156159-10G
Speed-vacThermo ScientificSPD1010any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient
Stir plateVWR12365-382Any brand of stir plates are sufficient
Targa 20 mg SPE platesNest Group, Inc.HNS S18VThese are C18 cartridges
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) bufferSigma Aldrich, Life ScienceT7408-100ML
TrisBiorad161-0716
Biomek 24-Place Tube Rack HolderBeckmann373661
UreaBiorad161-0731
Water - MS GradeFisher ScientificW6-44 L quantity is not necessary

참고문헌

  1. Diamandis, E. P. Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations. Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).
  2. Qian, W. -J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications. Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).
  3. Arul, A. B., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).
  4. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  5. Shiio, Y., Aebersold, R. Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).
  6. Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
  7. Thompson, A., et al. TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set. Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).
  8. Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. 21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).
  9. Evans, A. R., Robinson, R. A. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
  10. Robinson, R. A., Evans, A. R. Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging. Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).
  11. King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT). Journal of Visual Experiments. (123), e55406(2017).
  12. King, C. D., Robinson, R. A. S. Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease. Analytical Chemistry. , (2020).
  13. Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. Proteomics & Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).
  14. Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT. Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).
  15. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
  16. Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach. Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).
  17. Gu, L., Robinson, R. A. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
  18. Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver. Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227(2020).

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