急性呼吸窮迫症候群(ARDS)のダブルヒットモデルとしてのブタにおける気管支肺胞洗浄とオレイン酸注射

要約

急性呼吸窮迫症候群(ARDS)の病態生理学を研究するために、さまざまな複雑な動物モデルが存在します。気管支肺胞洗浄とオレイン酸注射による肺損傷は、急性呼吸窮迫症候群を研究するための新しいダブルヒット動物モデルとして適しています。

要約

ARDSの治療は、21世紀の集中治療医にとって引き続き大きな課題であり、重症例では死亡率が依然として最大50%に達しています。この疾患の複雑な病態生理学をより深く理解するためには、さらなる研究努力が必要である。急性肺損傷を誘発するためのさまざまな確立された動物モデルがありますが、ARDSの複雑な病因メカニズムを適切に模倣できるものはありません。この状態の発症の最も重要な要因は、歯槽毛細血管ユニットの損傷です。2つの確立された肺損傷モデルの組み合わせにより、根本的な病態メカニズムをより詳細に模倣することができます。気管支肺胞洗浄(BAL)は、界面活性剤の枯渇と肺胞の虚脱につながります。体液量の繰り返し点滴は、その後の低酸素血症を引き起こします。界面活性剤の枯渇は、ヒトのARDSの重要な要因です。BALはしばしば他の肺損傷アプローチと組み合わされますが、2回目のヒットとそれに続くオレイン酸注射(OAI)はまだありません。オレイン酸注射は、ガス交換の深刻な障害、肺の仕組みの悪化、および肺胞毛細血管バリアの破壊につながります。OAIは、肺胞の漏出とガス交換障害の増加を伴う肺組織の炎症の延長からなるARDSの予想される影響のほとんどを模倣しています。異なるモデルの組み合わせの欠点は、BAL単独、OAI単独、または両方が一緒に引き起こされる肺損傷への影響を判断するのが難しいことです。このレポートで提示されたモデルは、新しいダブルヒット肺損傷モデルとしてのBALとOAIの組み合わせを表しています。この新しいモデルは実装が容易で、将来的にARDSでさまざまな治療アプローチを研究するための代替手段となります。

概要

急性呼吸獅迫症候群(ARDS)は、ガス交換障害と肺浸潤からなる疾患であり、多くの場合、集中治療が必要です。重度のARDSの死亡率は、ほぼ50年にわたる^{広範な研究にもかかわらず}、世界中で高いままです(最大50%)1。ARDS は、タイミング、胸部画像、浮腫および低酸素血症^{の起源 2} などの診断基準を含むベルリン定義によって定義されています。ARDSの重症度が異なる患者をより適切に分類するために、軽度(200 mmHg < PaO₂/FIO₂ ≤ 300 mmHg)、中等度(100 mmHg < PaO₂/FIO₂ ≤ 200 mmHg)、および重度(PaO₂/FIO₂ ≤ 100 mmHg)²の3つの異なる程度が定義されています。肺損傷に焦点を当てたさまざまな動物モデルが広く使用され、受け入れられています^ARDS3の病態生理学的変化とさまざまな治療アプローチ。

エンドトキシンを使用した動物モデル(例:細菌の静脈内注入、敗血症誘発性肺損傷を模倣するための盲腸結紮および穿刺)、虚血/再灌流モデル、喫煙/熱傷ARDSモデル、オレイン酸の注入、および気管支肺胞洗浄モデルが知られています³。各モデルは、^{研究結果3}に長所と短所があるいくつかの病態生理学的変化を表しています。これは、ARDS疾患の複雑さを反映していません。2つの実証済みモデルの組み合わせにより、ARDSの病態生理学についてより的確な結論を導き出すことができます。提示されたモデルでは、気管支肺胞洗浄とオレイン酸注入を組み合わせて、ヒトの ARDS の複雑さを模倣しました。オレイン酸は不飽和脂肪酸であり、自然免疫受容体の活性化を引き起こし、その後好中球の蓄積、炎症誘発性サイトカイン産生、および細胞死を引き起こすことにより、肺の肺胞毛細血管単位に直接作用します^4,5。オレイン酸注入は、重度の低酸素血症、肺動脈圧の上昇、血管外肺水の蓄積を誘発します。右心室不全による低血圧や心筋抑制がよく起こります。バランスの取れた電解質溶液による気管支肺胞洗浄(BAL)の繰り返しによる肺損傷の誘発は、肺胞界面活性剤の脂質濃度を低下させます³。界面活性剤は歯槽面張力を減少させ、歯槽骨の虚脱を防ぎます。BALは即時の低酸素血症を引き起こし、肺胞と動脈の酸素差の増加^{を引き起こします3}。ヒトARDSは、界面活性剤の枯渇にも関連しています³。この組み合わせモデルの欠点は、中心静脈アクセス、挿管、全身麻酔が必要であることです。さらに、翻訳の側面に対する疑わしい機構的関連性(例えば、オレイン酸注入)は不明のままです。少なくとも、肺損傷のどの部分(BALとOAI、またはその両方)が肺損傷に寄与しているかどうかを判断することは困難です。このモデルの利点は、人間の患者と同様の身近なモニタリングと機器を備えた大型動物での有用性(特別な機器は不要)、ARDSの主要な側面の良好な再現、および全身性炎症を伴わない単離されたARDSの研究の可能性(エンドトキシンモデルなど)です。次の記事では、ブタのダブルヒット(BALおよびOAI)肺損傷について詳細に説明し、肺機能の妥協の安定性を特徴付けるための代表的なデータを提供します。

プロトコル

ここに記載されているすべての動物実験は、施設および州の動物管理委員会(Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Germany; 承認番号G18-1-044)によって承認されており、ヨーロッパおよびドイツ実験動物学会のガイドラインに従って実施されています。

1.麻酔、挿管、人工呼吸器

1. 麻酔の6時間前には食事を控えて誤嚥のリスクを減らしますが、ストレスを軽減するために水を自由に利用できるようにします。
2. 動物が動物の箱にいる間に、ケタミン(4 mg・^kg-1)とアザペロン(8 mg・^kg-1)の組み合わせを筋肉内に注射して鎮静します。.
3. アルコールによる局所消毒後、耳の静脈に共通の末梢静脈カテーテル(20G)を使用して静脈ラインを確立します。
4. センサーを動物の片方の耳または尾にクリップして、末梢酸素飽和度(SpO₂)の監視を開始します。
5. 麻酔導入のためにフェンタニル(4μg・^kg-1)、プロポフォール(3mg・^kg-1)、アトラクリウム(0.5mg・^kg-1)を注入します。
6. 豚をストレッチャーの仰臥位に置きます。
7. ピーク吸気圧が20 cmH₂O未満、PEEPが5 cmH₂O、周波数が14〜16 /分、FiO₂ が1.0の動物に適したマスクでブタを換気します。
8. バランスの取れた電解質溶液(5 mL・^kg-1・^h-1)、プロポフォール(8-12 mg・^kg-1・^h-1)、フェンタニル(0.1-0.2 mg・^kg-1・^h-1)を持続注入して麻酔を維持します。
9. 挿管には、動物に適した一般的な気管内チューブ(体重25-30 kg、気管内チューブID 6-7など)を使用し、気管内チューブイントロデューサーを装備した一般的な喉頭鏡をMacintosh Blade 4で使用します。2人必要です。
   1. 人1:片手で舌を抜き、もう片方の手で鼻を押し下げます。
   2. 人物2:喉頭鏡を挿入し、喉頭蓋が視覚化できるようになるまで通常どおり進めます。
10. 喉頭鏡を上に引っ張って、声帯を視覚化します。時々、喉頭蓋が柔らかい口蓋に「くっつく」ことがあります。その場合は、チューブの先端で動員します。
11. 声帯にチューブを挿入し、イントロデューサーを引き出します。
12. チューブのバルーンをブロックします。
13. チューブを人工呼吸器に接続し、カプノグラフィーと聴診で正しい位置を確認します。
14. 人工呼吸器を開始します(潮汐量6-8 mL/kg、PEEP 5 cmH₂O、FiO₂ 0.4、etCO₂ を35〜45 mmHgに保つ頻度)。

2. 計装

1. 必要な血管をカテーテル挿入するために、包帯で後ろ足を引っ込めます。肺動脈カテーテル留置用の動脈ライン、動脈イントロデューサーシース、中心静脈ライン、静脈イントロデューサーシースが必要です。
2. アルコール消毒で大腿部をたっぷりと消毒します。計画された検査に応じて、多かれ少なかれ無菌的アプローチが使用されます。
3. カテーテルを生理食塩水で洗い流して準備します。
4. 超音波プローブを鼠径靭帯に置き、大腿骨血管をスキャンします。
5. プローブを90°回して、長軸の大腿動脈を完全に視覚化します。必要に応じて、さまざまな状況で短軸ビューを使用して大腿動脈を完全に視覚化することも可能です。
6. インライン超音波視覚化の下で大腿動脈をカニューレ挿入し、Seldingerの技術で設定されたイントロデューサーの針を使用します。脈動する明るい血液が流れ出したら、ガイドワイヤーを導入して針を引っ込めます。
7. 大腿静脈を視覚化し、インライン超音波視覚化とイントロデューサーセットの針による連続吸引の下で静脈をカニューレします。静脈血が吸引可能な場合は、シリンジを外してガイドワイヤーを挿入します。針を引っ込めます。
8. 超音波でワイヤーの位置を確認してください。
9. 配置されたガイドワイヤーの上に動脈線と静脈線を挿入します。
10. 反対側で動脈と静脈の句読点を繰り返し、上記のようにセルディンガーの技術に従ってイントロデューサーシースを挿入します。
11. 動脈ラインと静脈ラインをそれぞれトランスデューサーに接続します。
12. 両方のトランスデューサを心臓の高さに配置し、両方のトランスデューサの3方向ストップコックを大気に開いて切り替え、システムをゼロに校正します。
    注意: 妥当な値を生成するには、システム内の気泡や血痕を避ける必要があります。
13. プロポフォールとフェンタニルの注入を中心静脈ラインのポートの1つに切り替えます。
14. プローブを超高速pO₂測定用に校正し、動脈イントロデューサーシースに挿入します。
    注:超高速pO₂測定用のプローブによるpO₂の測定は必須ではありませんが、pO₂のリアルタイム変化を視覚化するのに役立ちます。

3. 肺動脈カテーテルの挿入

1. 肺動脈カテーテル(PAC)のバルーンに損傷がないか確認します。
2. トランスデューサーに接続し、校正します。
3. PACをイントロデューサーシースに挿入します(バルーンを収縮させます)。
4. PACがイントロデューサーシース(15-20 cm)を通過したら、バルーンを膨らませます。
5. PACを進め、典型的な波形(静脈血管、右心房、右心室、肺動脈、肺毛細血管くさび圧)を監視します。バルーンを収縮させ、PACのすべてのポートから血液を吸引できるかどうかを確認します。

4.肺損傷の誘発:気管支肺胞洗浄による最初の打撃

1. 滅菌平衡電解質溶液(ステロフンチンなど)を調製し、40°Cに温めます。
   注:滅菌バランスの取れた電解質溶液は、肺の汚染を避けるために使用されます。
2. 気管支肺胞洗浄を行う前に、FiO₂ を 0.4 から 1.0 に 10 分かけて変更します。
3. 超高速のpO₂測定を開始します。
4. 持続注入およびボーラス注射用のノルエピネフリンを準備します(平均動脈圧が60mmHgの場合<)。ノルエピネフリンシリンジポンプを始動せずに中心静脈カテーテルのポートの1つに接続します。
5. 温めた滅菌バランス電解質溶液から30mL・^kg-1 を漏斗に充填します。漏斗が気管内チューブに接続できることを確認してください。
6. 人工呼吸器からの吸気でPEEPが失われないようにチューブを外します。
7. 漏斗を気管内チューブに接続します。
8. 漏斗を手動で動物の1m上に上げます。
9. キャップを開け、温めたバランスの取れた電解質溶液の全量を漏斗から気管内チューブに静水圧を使用して30秒以上注入します。
10. 30秒後、漏斗を動物の1メートル下に下げて注入した溶液を取り出し、洗濯液を受動的に排出します。酸素供給のために動物を人工呼吸器に再接続します。
11. 取り除いた洗練液を回収し、量をメモします。歯槽液クリアランスを計算する必要があります。
    注意: 界面活性剤の洗い流しを最大化するために、洗浄後にバランスの取れた電解質溶液を再利用しないでください。
12. 吸引カテーテルを使用して、チューブ内の溶液の残りを吸引します。
13. 気管支肺胞洗浄後の血行動態を注意深く監視し、ノルエピネフリンを手元に置いておきます。.必要に応じて、ノルエピネフリンをボーラスまたは持続注入として投与して血圧を安定させます(ステップ4.4と比較してください)。
14. PaO₂ / FiO_2-比が250 mmHg未満になるまで、ステップ4.5-4.13で説明されているように、30 mL・^kg-1平衡電解質溶液の注入を繰り返します。.気管支肺胞洗浄を4〜5回繰り返す必要がある場合があります。.
15. PaO₂ / FiO₂比が250 mmHg未満の場合は、オレイン酸注射による肺障害の誘発から始めます。この手順中は、人工呼吸器の設定を変更することはありません。

5. 肺障害の誘発:オレイン酸注射による2回目の打撃

1. オレイン酸溶液を調製する:0.1mLのオレイン酸を20mLの注射器に1mL・^kg-1 を入れ、3方向活栓に接続します。別の20mLシリンジに2mLの血液を飲みます。.両方のシリンジで生理食塩水を合計20mLまで加え、2番目のシリンジも3方向ストップコックに接続します。
   注意: オレイン酸を扱うときは、手袋と目の保護具を使用してください。
2. 持続注入およびボーラス注射用のノルエピネフリンを準備します(平均動脈圧が60mmHgの場合<)。ノルエピネフリンシリンジポンプを始動せずに中心静脈カテーテルのポートの1つに接続します。
3. まだ測定中の超高速pO₂測定を監視し続けます。FiO₂ はまだ 1.0 です。
4. 3ウェイストップコックをPACの近位ポートに接続します。
5. オレイン酸と血液/生理食塩水の混合物を、一方の注射器からもう一方の注射器へ、またはその逆に三方活栓を介して繰り返し移動することにより、完全に混合し、常に混合し続けます。均質なエマルジョンの場合は、エマルジョンを2mL注入し、混合を続けます。
   注:混合が停止すると、エマルジョンは親油性部分と親水性部分に分離する可能性があります。
6. オレイン酸注射後の血行動態を注意深く監視し、ノルエピネフリンを手元に置いておきます。.必要に応じて、ノルエピネフリンをボーラスまたは持続注入として投与して血圧を安定させます(手順5.2と比較してください)。
   注:警戒してください。この処置中に動物が死ぬ可能性があります。
7. PaO₂/FiO₂-比が150 mmHg未満になるまで、3分ごとに2 mLの溶液を繰り返し注入します。
8. PaO₂/FiO₂比が100〜200 mmHgになる前にシリンジが空の場合は、ステップ5.1で説明したように、さらに2つのシリンジを準備します。PaO_5.5 / FiO₂比が100〜200 mmHgになるまで、手順5.5〜5.8を繰り返します。
   注:通常、オレイン酸と血液/生理食塩水の混合物の半分から完全な注射器が必要です。
9. PaO₂/FiO₂比が100〜200 mmHgの場合は、30分待ってから再度確認してください。常に200 mmHg未満の場合は、実験/治療を開始します。それ以外の場合は、ステップ5.1で説明されているようにさらに2本のシリンジを準備し、ステップ5.5〜5.9を繰り返します。
   注:説明したように肺損傷を誘発した後、肺機能の障害は安定しているか、または悪化するか、または特定の範囲内で改善する可能性があります。.

6. 実験終了と安楽死

1. 持続麻酔に加えて0.5mgのフェンタニルを注射し、5分間待ちます。200 mgのプロポフォールと40 mmolの塩化カリウムを注射して、深い麻酔で動物を殺します。

結果

PaO₂/FiO₂比は、気管支肺胞洗浄およびオレイン酸の分画適用後に減少します(図1)。気管支肺胞洗浄の影響を予測することは不明であるため(例:.、分画されたオレイン酸用量の影響) PaO₂/FiO_2-比に対するため、肺の損傷を誘発しながらPaO₂/FiO_2-比を監視することをお勧めします。.超高速pO₂測定?...

ディスカッション

ブタに重度の肺損傷を引き起こすために記載されたダブルヒット法は、ARDSのさまざまな治療オプションを研究するのに適しています。ダブルヒットモデルは、ARDS の病態メカニズムの 2 つの中心的な要素、すなわち肺胞毛細血管ユニットの喪失と内皮バリアの破壊を模倣しています⁷。2つのヒットがあるため、事前定義された目標値(PaO₂/FiO

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Kaliumchlorid-Lösung 7.46% 20 mL	Fresenius, Kabi Deutschland GmbH	potassium chloride
Absaugkatheter Ideal CH14, 52 cm, gerade	B. Braun Melsungen AG, Germany	suction catheter
Arterenol 1 mg/mL, 25 mL	Sanofi- Aventis, Seutschland GmbH	norepinephrine
Atracurium Hikma, 50 mg/5 mL	Hikma Pharma GmbH , Martinsried	atracurium
BD Discardit II Spritze 2, 5, 10, 20 mL	Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, Spain	syringe
BD Luer Connecta	Becton Dickinson Infusion Therapy AB Helsingborg, Schweden	3-way-stopcock
BD Microlance 3 20 G	Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, Spain	canula
Datex Ohmeda S5	GE Healthcare Finland Oy, Helsinki, Finland	hemodynamic monitor
Engström Carestation	GE Heathcare, Madison USA	ventilator
Fentanyl-Janssen 0.05 mg/mL	Janssen-Cilag GmbH, Neuss	fentanyl
Führungsstab, Durchmesser 4.3	Rüsch	endotracheal tube introducer
Incetomat-line 150 cm	Fresenius, Kabi Deutschland GmbH	perfusorline
Ketamin-Hameln 50 mg/mL	Hameln Pharmaceuticals GmbH	ketamine
laryngoscope	Rüsch	laryngoscope
logicath 7 Fr 3-lumen 30 cm lang	Smith- Medical Deutschland GmbH	central venous catheter
Masimo Radical 7	Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA	periphereal oxygen saturation
Neofox Oxygen sensor 300 micron fiber	Ocean optics Largo, FL USA	ultrafast pO2-measurements
Ölsäure reinst Ph. Eur NF C18H34O2 M0282.47g/mol, Dichte 0.9	Applichem GmbH Darmstadt, Deutschland	oleic acid
Original Perfusor syringe 50 mL Luer Lock	B.Braun Melsungen AG, Germany	perfusorsyringe
PA-Katheter Swan Ganz 7.5 Fr, 110 cm	Edwards Lifesciences LLC, Irvine CA, USA	PAC
PE-Trichter, 60 mm	Aquintos-Wasseraufbereitung GmbH, Germany	funnel
Percutaneous sheath introducer set 8.5 und 9 Fr, 10 cm with integral haemostasis valve/sideport	Arrow international inc. Reading, PA, USA	introducer sheath
Perfusor FM Braun	B.Braun Melsungen AG, Germany	syringe pump
Propofol 2% 20 mg/mL (50 mL Flaschen)	Fresenius, Kabi Deutschland GmbH	propofol
Radifocus Introducer II, Größe 5-8 Fr	Terumo Corporation Tokio, Japan	introducer sheath
Rüschelit Super Safety Clear 6.5 /7.0	Teleflex Medical Sdn. Bhd, Malaysia	endotracheal tube
Seldinger Nadel mit Fixierflügel	Smith- Medical Deutschland GmbH	seldinger canula
Sonosite Micromaxx Ultrasoundsystem	Sonosite Bothell, WA, USA	ultrasound
Stainless Macintosh Größe 4	Welsch Allyn69604	blade for laryngoscope
Sterofundin Infusion	B. Braun Melsungen AG, Germany	bronchoalveolar lavage
Stresnil 40 mg/mL	Lilly Deutschland GmbH, Abteilung Elanco Animal Health	azaperon
Vasofix Safety 22 G	B.Braun Melsungen AG, Germany	venous catheter