Бронхоальвеолярный лаваж и инъекции олеиновой кислоты у свиней в качестве модели двойного удара при остром респираторном дистресс-синдроме (ОРДС)

Резюме

Существуют различные, сложные животные модели для изучения патофизиологии острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). Бронхоальвеолярный лаваж и повреждение легких, вызванное инъекцией олеиновой кислоты, подходит в качестве новой животной модели двойного удара для изучения острого респираторного дистресс-синдрома.

Аннотация

Лечение ОРДС продолжает представлять собой серьезную проблему для врачей интенсивной терапии в 21 веке, при этом уровень смертности в тяжелых случаях по-прежнему достигает 50%. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы лучше понять сложную патофизиологию этого заболевания. Существуют различные хорошо зарекомендовавшие себя животные модели для индуцирования острого повреждения легких, но ни одна из них не смогла адекватно имитировать сложные патомеханизмы ОРДС. Наиболее решающим фактором для развития этого состояния является повреждение альвеолярного капиллярного блока. Комбинация двух хорошо зарекомендовавших себя моделей повреждения легких позволяет нам более подробно имитировать лежащий в основе патомеханизм. Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) приводит к истощению поверхностно-активного вещества, а также к альвеолярному коллапсу. Повторное закапывание объемов жидкости вызывает последующую гипоксемию. Истощение поверхностно-активных веществ является ключевым фактором ОРДС у человека. БАЛ часто комбинируют с другими подходами к повреждению легких, но пока не со вторым ударом с последующей инъекцией олеиновой кислоты (ОАП). Введение олеиновой кислоты приводит к значительному нарушению газообмена, ухудшению механики легких и нарушению альвеоло-капиллярного барьера. OAI имитирует большинство ожидаемых эффектов ОРДС, заключающихся в расширенном воспалении легочной ткани с увеличением альвеолярной утечки и нарушением газообмена. Недостатком комбинации различных моделей является сложность определения влияния на повреждение легких, вызванного только БАЛ, только ОАП или и тем, и другим вместе. Модель, представленная в этом отчете, представляет собой комбинацию BAL и OAI в качестве новой модели двойного повреждения легких. Эта новая модель проста в реализации и является альтернативой для изучения различных терапевтических подходов при ОРДС в будущем.

Введение

Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) – это заболевание, заключающееся в нарушении газообмена и инфильтрации легких, которое часто требует интенсивной терапии. Смертность от тяжелого течения ОРДС остается высокой (до 50%) во всем мире, несмотря на почти 50 лет обширных исследований¹. ОРДС определяется Берлинским определением, включая такие диагностические критерии, как время, визуализация грудной клетки, происхождение отека и гипоксемия². Чтобы лучше классифицировать пациентов с различными уровнями тяжести ОРДС, выделяют три различные степени гипоксемии: легкую (200 мм рт. ст. < PaO₂/FIO₂ ≤ 300 мм рт. ст.), умеренную (100 мм рт. ст. < PaO₂ / FIO₂ ≤ 200 мм рт. ст.) и тяжелую (PaO₂ / FIO₂ ≤ 100 мм ^{рт. ст}.) Различные животные модели с акцентом на повреждение легких широко используются и принимаются для изучения патофизиологических изменений и различных терапевтических подходов при ОРДС³.

Известны модели на животных с использованием эндотоксинов (например, внутривенная инфузия бактерий, лигирование слепой кишки и пункция для имитации повреждения легких, вызванного сепсисом), модели ишемии/реперфузии, модели ОРДС с дымом/ожогом, инфузия олеиновой кислоты и модели бронхоальвеолярного лаважа³. Каждая модель представляет лишь несколько патофизиологических изменений с преимуществами и недостатками для результатов исследования³. Это не отражает сложности заболевания ОРДС. Комбинация двух проверенных моделей позволяет сделать более точные выводы о патофизиологии ОРДС. В представленной модели мы объединили бронхоальвеолярный лаваж и инфузию олеиновой кислоты для имитации сложности ОРДС человека. Олеиновая кислота является ненасыщенной жирной кислотой и действует непосредственно на альвеоло-капиллярную единицу легких, вызывая активацию рецепторов врожденного иммунитета, что впоследствии приводит к накоплению нейтрофилов, продукции провоспалительных цитокинов и гибели клеток ^4,5. Инфузия олеиновой кислоты вызывает выраженную гипоксемию, повышение легочного артериального давления и накопление внесосудистой воды в легких. Часто возникают гипотензия и угнетение миокарда из-за правожелудочковой недостаточности. Индукция повреждения легких путем повторного бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) со сбалансированным раствором электролита снижает концентрацию липидов альвеолярного сурфактанта³. Поверхностно-активные вещества снижают поверхностное натяжение альвеол и предотвращают альвеолярный коллапс. БАЛ вызывает немедленную гипоксемию и увеличение альвеолярно-артериальной разницы кислорода³. ОРДС человека также связан с истощением поверхностно-активного вещества³. Недостатками данной комбинированной модели являются необходимость проведения центрального венозного доступа, интубации и общей анестезии. Кроме того, остается неясной сомнительная механистическая релевантность (например, инфузии олеиновой кислоты) для трансляционных аспектов. По крайней мере, трудно определить, какая часть повреждения легких (BAL против OAI, или оба вместе) способствует повреждению легких. Преимуществами данной модели являются ее применимость на крупных животных с привычным мониторингом и инструментами, аналогичными человеческим пациентам (не требуется специальное оборудование), хорошее воспроизведение основных аспектов ОРДС и возможность изучения изолированных ОРДС без системного воспаления (например, модели эндотоксинов). В следующей статье мы дадим подробное описание повреждения легких у свиней при двойном ударе (BAL и OAI) и предоставим репрезентативные данные для характеристики стабильности нарушений функции легких.

протокол

Все описанные здесь эксперименты на животных были одобрены институциональным и государственным комитетом по уходу за животными (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Кобленц, Германия; номер одобрения G18-1-044) и проводились в соответствии с рекомендациями Европейского и Немецкого общества наук о лабораторных животных.

1. Анестезия, интубация и искусственная вентиляция легких

1. Воздержитесь от приема пищи за 6 часов до анестезии, чтобы снизить риск аспирации, но обеспечьте свободный доступ к воде для снижения стресса.
2. Введите комбинацию кетамина (4 ^мг-кг-1) и азаперона (8 мг-кг-1) внутримышечно для введения седативного эффекта, пока животное находится в боксе для животных.
3. Установите венозный катетер с помощью общего периферического венозного катетера (20 G) в ушную вену после местной дезинфекции спиртом.
4. Начните мониторинг периферического насыщения кислородом (SpO₂), закрепив датчик на одном из ушей или хвосте животного.
5. Введите фентанил (4 ^мкг-1), пропофол (3 ^мг-кг-1) и атракурий (0,5 мг-кг-1) для индукции анестезии.
6. Положите свинью в лежачем положении на носилки.
7. Проветривать свинью с помощью маски, подходящей для животных с пиковым давлением на вдохе ниже 20_смН2О, ПЭЭП 5_смН2О, частотой 14-16 /мин и FiO₂ 1,0.
8. Для поддержания анестезии начинают непрерывную инфузию сбалансированным раствором электролита (5 мл∙^кг-1∙^ч-1), пропофолом (8-12 мг∙^кг-1∙^ч-1) и фентанилом (0,1-0,2 мг∙^кг-1∙^ч-1).
9. Для интубации используйте общую эндотрахеальную трубку, подходящую для животного (например, вес 25-30 кг, внутренний диаметр эндотрахеальной трубки 6-7), вооруженную интродьюсером эндотрахеальной трубки, и общий ларингоскоп с лезвием Macintosh Blade 4. Необходимо два человека.
   1. Человек 1: Одной рукой вытяните язык, а другой надавите на рыло.
   2. Человек 2: Вставьте ларингоскоп и продвигайте его, как обычно, до тех пор, пока надгортанник не будет визуализирован.
10. Потяните ларингоскоп вверх, чтобы визуализировать голосовые связки. Иногда надгортанник «прилипает» к мягкому нёбу. Если это так, мобилизуйте его кончиком трубки.
11. Вставьте трубку через голосовые связки и вытащите проводник.
12. Заблокируйте баллон трубки.
13. Подключите трубку к аппарату искусственной вентиляции легких и проверьте правильность позиционирования с помощью капнографии и аускультации.
14. Запустите искусственную вентиляцию легких (дыхательный объем 6-8 мл/кг, PEEP 5 смH₂O, FiO₂ 0,4, частота поддержания etCO₂ в пределах 35 – 45 мм рт.ст.).

2. Контрольно-измерительные приборы

1. Втяните задние лапы с помощью бинтов для катетеризации необходимых сосудов. Для установки катетера в легочной артерии необходимы артериальная линия, артериальный интродьюсер, центральный венозный катетер и венозный интродьюсер.
2. Щедро продезинфицируйте бедренную область спиртовой дезинфекцией. В зависимости от планируемых обследований используется более или менее асептический подход.
3. Подготовьте катетеры, промыв их физиологическим раствором.
4. Поместите ультразвуковой датчик на паховую связку и просканируйте бедренные сосуды.
5. Поверните зонд на 90°, чтобы полностью визуализировать бедренную артерию по длинной оси. При необходимости в различных обстоятельствах также можно использовать вид с короткой осью для полной визуализации бедренной артерии.
6. Канюляция бедренной артерии под поточной ультразвуковой визуализацией с помощью иглы интродьюсера, установленного по методике Сельдингера. Когда пульсирует яркая кровь, введите проводник и втяните иглу.
7. Визуализируйте бедренную вену и канюлируйте вену с помощью ультразвуковой визуализации в линии и непрерывной аспирации с помощью иглы из набора интродьюсера. Когда венозная кровь станет аспирируемой, отсоедините шприц и вставьте проводник. Втяните иглу.
8. Проверьте положение проводов с помощью ультразвука.
9. Вставьте артериальный и венозный катетер поверх установленных проводников.
10. Повторите артериальную и венозную пунктуацию с другой стороны и вставьте интродьюсерные тубусы по методике Сельдингера, как описано выше.
11. Подключите артериальную и венозную линии к датчику.
12. Расположите оба датчика на уровне сердца и переключите трехходовые запорные краны обоих датчиков, открытые для атмосферы, чтобы откалибровать систему до нуля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо избегать попадания пузырьков воздуха и пятен крови в систему для получения правдоподобных значений.
13. Переключите инфузию пропофола и фентанила в один из портов центрального венозного катетера.
14. Откалибруйте зонд для сверхбыстрых измерений_pO2 и вставьте его через оболочку артериального интродьюсера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение pO₂ с помощью зонда для сверхбыстрого измерения pO₂ не является обязательным, но помогает визуализировать изменения pO₂ в режиме реального времени.

3. Установка катетера легочной артерии

1. Проверьте баллон катетера легочной артерии (PAC) на наличие повреждений.
2. Подключите к датчику и откалибруйте его.
3. Вставьте PAC через оболочку интродьюсера (баллон спущен).
4. Когда ПАК пройдет через интродьюсерную оболочку (15-20 см), надуйте баллон.
5. Усовершенствуйте PAC и контролируйте типичные формы волн (венозные сосуды, правое предсердие, правый желудочек, легочная артерия, давление в легочном капиллярном клине). Сдуйте баллон и проверьте, можно ли отсасывать кровь через все порты PAC.

4. Индукция повреждения легких: при первом поражении бронхоальвеолярным лаважем

1. Приготовьте стерильный сбалансированный раствор электролита (например, стерофундина), подогретый до 40 °С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильный сбалансированный раствор электролитов используется для предотвращения загрязнения легких.
2. Изменяйте FiO₂ с 0,4 до 1,0 в течение 10 минут перед проведением бронхоальвеолярного лаважа.
3. Запустите сверхбыстрое измерение pO₂.
4. Приготовьте норадреналин для непрерывной инфузии и для болюсного введения (если среднее артериальное давление < 60 мм рт.ст.). Подсоедините норадреналиновый шприцевой насос к одному из портов центрального венозного катетера, не запуская его.
5. Залейте 30 мл∙^кг-1 из подогретого стерильного сбалансированного раствора электролита в воронку. Убедитесь, что воронка может быть подключена к эндотрахеальной трубке.
6. Отсоедините трубку без потери PEEP при вдохе от аппарата ИВЛ.
7. Подсоедините воронку к эндотрахеальной трубке.
8. Поднимите воронку на 1 м над животным вручную.
9. Откройте колпачок и закапывайте все количество нагретого сбалансированного раствора электролита из воронки в эндотрахеальную трубку в течение 30 с с помощью гидростатического давления.
10. Через 30 с удалите настоянный раствор, опустив воронку на 1 метр ниже животного и пассивно слейте жидкость для промывания. Снова подключите животное к аппарату искусственной вентиляции легких для насыщения кислородом.
11. Соберите удаленную жидкость для промывания и запишите количество. Он нужен для расчета клиренса альвеолярной жидкости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте повторно сбалансированный раствор электролита после промывания для максимального вымывания поверхностно-активного вещества.
12. Отсасывайте остатки раствора в трубке с помощью отсасывающих катетеров.
13. Внимательно следите за гемодинамикой после бронхоальвеолярного лаважа и держите норадреналин под рукой. При необходимости дайте норадреналин в виде болюсной или непрерывной инфузии для стабилизации артериального давления (сравните с шагом 4.4).
14. Повторите инфузию 30 мл-кг-1 сбалансированного раствора электролита, как описано в шагах 4,5-4,13, до тех пор, пока отношение PaO₂/FiO₂ не станет ниже 250 мм рт. Может потребоваться от четырех до пяти повторений бронхоальвеолярного лаважа.
15. Если отношение PaO₂/FiO₂ ниже 250 мм рт.ст., начните с индукции повреждения легких путем инъекции олеиновой кислоты. Не изменяйте настройки аппарата ИВЛ во время этой процедуры.

5. Индукция повреждения легких: второй удар инъекцией олеиновой кислоты

1. Приготовьте раствор олеиновой кислоты: 0,1 ^мл-кг-1 олеиновой кислоты в шприц объемом 20 мл и подсоедините его к 3-ходовому запорному крану. Возьмите 2 мл крови в другой шприц объемом 20 мл. Добавьте физиологический раствор в общем объеме 20 мл в оба шприца и подключите второй шприц также к 3-ходовому запорному крану.
   ВНИМАНИЕ: Используйте перчатки и средства защиты глаз при работе с олеиновой кислотой.
2. Приготовьте норадреналин для непрерывной инфузии и для болюсного введения (если среднее артериальное давление < 60 мм рт.ст.). Подсоедините норадреналиновый шприцевой насос к одному из портов центрального венозного катетера, не запуская его.
3. Продолжайте следить за сверхбыстрым измерением pO₂, которое все еще измеряется. FiO₂ по-прежнему 1.0.
4. Подключите 3-контактный запорный кран к проксимальному порту PAC.
5. Тщательно перемешайте олеиновую кислоту и смесь крови и физиологического раствора, многократно перекладывая раствор из одного шприца в другой шприц и наоборот с помощью трехстороннего запорного крана, и продолжайте перемешивать все время. Когда эмульсия станет однородной, введите 2 мл эмульсии и продолжайте перемешивание.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если смешивание прекращается, эмульсия может разделиться на липофильную и гидрофильную часть.
6. Внимательно следите за гемодинамикой после введения олеиновой кислоты и держите под рукой норадреналин. При необходимости давайте норадреналин в виде болюсной или непрерывной инфузии для стабилизации артериального давления (сравните с шагом 5.2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте бдительны; Животные могут погибнуть во время этой процедуры.
7. Повторяйте впрыскивание 2 мл раствора каждые 3 минуты до тех пор, пока отношение PaO₂/FiO₂ не опустится ниже 150 мм рт.ст.
8. Если шприц пуст до того, как соотношение PaO₂/FiO₂ составит от 100 до 200 мм рт. ст., подготовьте еще 2 шприца, как описано в шаге 5.1. Повторяйте шаги 5,5-5,8 до тех пор, пока отношение PaO₂/FiO₂ не упадет в пределах от 100 до 200 мм рт.ст.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно требуется от половины до полного шприца олеиновой кислоты и смеси крови и физиологического раствора.
9. Если отношение PaO₂/FiO₂ находится в диапазоне от 100 до 200 мм рт.ст., подождите 30 минут и проверьте еще раз. Если она постоянно ниже 200 мм рт.ст., начните эксперимент/лечение; В противном случае подготовьте еще 2 шприца, как описано в шаге 5.1 и повторите шаги 5.5-5.9.
   Примечание: После индукции повреждения легких, как описано, нарушение функции легких может оставаться стабильным или ухудшаться или даже улучшаться в определенных пределах.

6. Окончание эксперимента и эвтаназия

1. Введите 0,5 мг фентанила дополнительно к непрерывной анестезии и подождите 5 минут. Введите 200 мг пропофола и 40 ммоль хлорида калия, чтобы убить животное под глубокой анестезией.

Результаты

Соотношение PaO₂/FiO₂ уменьшается после бронхоальвеолярного лаважа и фракционированного применения олеиновой кислоты (рис. 1). Поскольку неясно предсказать влияние бронхоальвеолярного лаважа (например, влияние фракционированной дозы олеино?...

Обсуждение

Описанный метод двойного попадания для вызова тяжелого повреждения легких у свиней подходит для изучения различных вариантов лечения при ОРДС. Модель двойного удара имитирует два центральных элемента патомеханизма ОРДС: потерю альвеолярно-капиллярного звена и нар?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Kaliumchlorid-Lösung 7.46% 20 mL	Fresenius, Kabi Deutschland GmbH	potassium chloride
Absaugkatheter Ideal CH14, 52 cm, gerade	B. Braun Melsungen AG, Germany	suction catheter
Arterenol 1 mg/mL, 25 mL	Sanofi- Aventis, Seutschland GmbH	norepinephrine
Atracurium Hikma, 50 mg/5 mL	Hikma Pharma GmbH , Martinsried	atracurium
BD Discardit II Spritze 2, 5, 10, 20 mL	Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, Spain	syringe
BD Luer Connecta	Becton Dickinson Infusion Therapy AB Helsingborg, Schweden	3-way-stopcock
BD Microlance 3 20 G	Becton Dickinson S.A. Carretera Mequinenza Fraga, Spain	canula
Datex Ohmeda S5	GE Healthcare Finland Oy, Helsinki, Finland	hemodynamic monitor
Engström Carestation	GE Heathcare, Madison USA	ventilator
Fentanyl-Janssen 0.05 mg/mL	Janssen-Cilag GmbH, Neuss	fentanyl
Führungsstab, Durchmesser 4.3	Rüsch	endotracheal tube introducer
Incetomat-line 150 cm	Fresenius, Kabi Deutschland GmbH	perfusorline
Ketamin-Hameln 50 mg/mL	Hameln Pharmaceuticals GmbH	ketamine
laryngoscope	Rüsch	laryngoscope
logicath 7 Fr 3-lumen 30 cm lang	Smith- Medical Deutschland GmbH	central venous catheter
Masimo Radical 7	Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA	periphereal oxygen saturation
Neofox Oxygen sensor 300 micron fiber	Ocean optics Largo, FL USA	ultrafast pO2-measurements
Ölsäure reinst Ph. Eur NF C18H34O2 M0282.47g/mol, Dichte 0.9	Applichem GmbH Darmstadt, Deutschland	oleic acid
Original Perfusor syringe 50 mL Luer Lock	B.Braun Melsungen AG, Germany	perfusorsyringe
PA-Katheter Swan Ganz 7.5 Fr, 110 cm	Edwards Lifesciences LLC, Irvine CA, USA	PAC
PE-Trichter, 60 mm	Aquintos-Wasseraufbereitung GmbH, Germany	funnel
Percutaneous sheath introducer set 8.5 und 9 Fr, 10 cm with integral haemostasis valve/sideport	Arrow international inc. Reading, PA, USA	introducer sheath
Perfusor FM Braun	B.Braun Melsungen AG, Germany	syringe pump
Propofol 2% 20 mg/mL (50 mL Flaschen)	Fresenius, Kabi Deutschland GmbH	propofol
Radifocus Introducer II, Größe 5-8 Fr	Terumo Corporation Tokio, Japan	introducer sheath
Rüschelit Super Safety Clear 6.5 /7.0	Teleflex Medical Sdn. Bhd, Malaysia	endotracheal tube
Seldinger Nadel mit Fixierflügel	Smith- Medical Deutschland GmbH	seldinger canula
Sonosite Micromaxx Ultrasoundsystem	Sonosite Bothell, WA, USA	ultrasound
Stainless Macintosh Größe 4	Welsch Allyn69604	blade for laryngoscope
Sterofundin Infusion	B. Braun Melsungen AG, Germany	bronchoalveolar lavage
Stresnil 40 mg/mL	Lilly Deutschland GmbH, Abteilung Elanco Animal Health	azaperon
Vasofix Safety 22 G	B.Braun Melsungen AG, Germany	venous catheter