血液由来神経細胞のGMフリー生成

要約

我々は、再プログラム化された末梢血細胞から神経表現型を有する細胞を得るための遺伝子組換え非遺伝子組換え(GMフリー)法を提示する。新規ヒトGPI結合タンパク質にリンクされたシグナル伝達経路の活性化は、ヒト多能性幹細胞を得るための効率的なGMフリーの方法を明らかにする。

要約

多くの人間の神経疾患は、脳内のニューロンおよびグリア細胞の変性によって引き起こされる。薬理学的および他の治療戦略の制限により、現在、負傷または病気の脳に対して利用可能な治療法はありません。細胞置換は、神経変性状態の有望な治療戦略として表示されます。.今日まで、神経幹細胞(NSC)は、胎児組織、ヒト胚細胞(ES)または人工多能性幹細胞(iPSC)から正常に生成されています。脱分化のプロセスは、多能性幹細胞の生成につながる新しいヒトGPI結合糖タンパク質の活性化によって開始された。これらの血液由来多能性幹細胞(BD-PSC)は、明視野および免疫蛍光顕微鏡で示されるように、神経表現型を有する細胞に インビトロで 分化する。電子顕微鏡によるこれらの細胞の超構造解析は、その原始構造、ならびに神経細胞様形態および細胞内特性を確認する。

概要

基礎的および前臨床幹細胞研究法の開発は、神経疾患に対する幹細胞ベースの治療法の臨床応用を促進する。このような潜在的な治療は、機能回復につながるヒト神経細胞の生成方法に大きく依存する^1.

神経幹細胞(NSC)は、成人神経新生と呼ばれるプロセスで、生涯を通じて新しいニューロンに自己更新し、分化します。非常に制限された脳領域だけが、成人期に新生児ニューロンを生成する能力のあるNSCを抱えています。このようなNSCは、学習や記憶に関与する成熟したニューロンを生み出し、失われたニューロンや損傷したニューロンを置き換えることができます。残念ながら、これらのNSCは制限された量で存在し、この限られた神経新生は若年発達中に急速に減少^する2。したがって、神経細胞の他の供給源は、細胞治療の目的で考慮されなければならない。

変性神経疾患は、標準的な薬理学的アプローチを用いて治癒することは困難である。多くの薬用神経疾患を受け入れるための新しい治療戦略は、病気および負傷した組織の細胞置換療法に基づいています。NSC移植は、損傷した細胞を置き換え、有益な効果を提供することができます。神経細胞置換の他の供給源としては、哺乳類胚盤胞³の内細胞塊に由来するヒト胚性幹細胞(ESC)や、ESCのような広範な自己再生能力を有し、様々な細胞系統に分化することができるiPSC4が含まれる。NSCはまた、多能状態⁵を回避するヒト線維芽細胞からの直接再プログラミングによって生成することができる。

細胞補充療法は依然として困難な課題です。ESC、胎児、またはiPSは、多くの不治の神経疾患を治療するための神経細胞の生成源となり得るが、損傷した組織の自己成人SC細胞置換は、免疫学的、倫理的および安全上の懸念を回避するより良い代替手段である。

PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTENのリン酸化による抗体架橋によるヒトGPI結合タンパク質の活性化は、血液前駆細胞の脱分化および血液由来多能性幹細胞(BD-PSC)6の生成を開始する。これらの細胞は、明視野、免疫蛍光、透過型電子顕微鏡(TEM)解析によって確認されたニューロン細胞に対するインビトロで分化します。

本研究では、GMフリーのBD-PSCの生成と、ニューロン表現型を有する細胞への再分化の成功について述べている。

プロトコル

実験を行う際に倫理承認を得た。

1. ヒト末梢血単核細胞(PBMNC)の単離

1. すべてのドナーが、制度ガイドラインに従って血液を撤回する前に、インフォームド・コンセントに署名したことを確認してください。
2. 標準的なプロトコルに従って訓練された医療関係者によって健康なドナーから血液の30 mLを取る。
3. 密度勾配媒体によって PBMNC を分離します。リン酸緩衝塩水(PBS)で希釈した1:1の血液25mLの培地10mL、300xgの遠心分離機を30分間使用してください。
4. プラズマと密度勾配媒体の間の相間層をピペット処理により分離する。5 mLの無菌PBSと遠心分離機で10分間300 x g で単離した細胞を洗浄し、2回繰り返します。
5. カウントチャンバーを使用して標準的な方法で細胞の数を数えます。

2. PBMNCの表面上の抗体架橋によるヒトGPIアンカー糖タンパク質の活性化

1. 6 x 10^6個 の単核細胞(MNC)を15 mLチューブに入れ、ヒトGPI結合膜タンパク質特異的抗体(30μg/mL)を30分間PBSで30分間、37°Cで1%の牛血清アルブミン(BSA)で培養して抗体架橋を行う。
2. インキュベーション培地を、10%の胎児ウシ血清(FBS)で補ったイコーブの修飾ダルベッコ培地に置き換えます。
3. 細胞を15 mLポリスチレンチューブで成長させ、37°Cでインキュベーターに入れ、8〜10日間(揺れせずに)5%CO2を入れます。D5では、15 mLチューブに10%FBSを加えたアイスコブの培地を1~2mL追加します。

3. 新たに生成された分化細胞のソート

1. 自動細胞カウンター(18 μL細胞懸濁液+ 2 μL蛍光色素)または計数チャンバー内の細胞を数えます。
2. 遠心分離機培養細胞懸濁液(5-7 x 10⁶⁾で300xgで10分間、滅菌パスツールピペットで得られた上清を吸引した。
3. 細胞ペレットを、予冷したPBS pH 7.2、0.5%BSAおよび2 mM EDTAの90 μLで再懸濁します。
4. 細胞懸濁液にCD45正のナノサイズの磁気ビーズ(80 μL)を加え、氷の上で15分間インキュベートします。
5. PBSバッファーと遠心分離機を2 mL 300 x g で10分間加えて細胞を洗浄します。
6. 500 μL の PBS バッファーで細胞を再懸濁します。
7. 500 μL の事前冷却 PBS バッファーでカラムを洗浄し、磁場に入れます。
8. カラムに細胞懸濁液を置き、500μLのPBSバッファー(2回)とCD45陰性細胞を含む遠心分離機流で洗浄します。1%BSAを補充アイスコブの培地でそれらを収集します。
9. 計数チャンバー内のセルをカウントします。

4. 新たに生成した幹細胞の神経分化のための細胞培養皿の準備

1. 培養血管にポリ-L-オルニチンとラミニンを塗布し、神経細胞を増殖させます。
2. ガラスカバーリップを4ウェルプレートに入れ、ddH₂Oで1:5希釈ポリL-オルニチン(0.1mg/mL)を37°Cインキュベーターに1時間置きます。その後、ddH₂Oで洗浄します。
3. ラミニン(0.5-2.0 mg/mL)をゆっくりと解凍し、カバーリップの上部に追加します。37°Cで2時間インキュベートする。
4. D-MEM/F12の49 mL、N2サプリメントの500 μL、400 μLの非必須アミノ酸(NEAA)、20 ng/mL最終濃度(100 μg/mLストック溶液から調製)での基本的なFGF溶液、および2ng/mLの最終濃度でヘパリンからなる神経誘導培地N2を準備する。
5. ピペット処理により余分なラミニンを除去し、培養皿に神経培地N2を加えます。

神経細胞の分化血細胞の培養

1. 培養BD由来CD45は、ラミニン/オルニチンコーティングガラスカバーリップ上で、37°C及び5%CO2のインキュベーターでN2培地で2日間培養し、新たにBD生成細胞の神経細胞分化を開始した。
2. 神経基底培地の48 mLからなる神経分化培地の培養細胞はさらに、L-グルタミンの500 μL、B27サプリメントの1 mL、NEAAの500 μL、 50 μL の組換えヒトグリア由来神経栄養因子 (GDNF) を PBS/0.1% BSA で 5 μg/250 μL、50 μL の組換えヒト脳由来神経栄養因子 (BDNF) を 5 μg/200μL で PBS/0.1% BSA/500 μL で 50 mLプレートを37°C、5%CO2のインキュベーターに入れる。

血液由来神経細胞の免疫蛍光顕微鏡分析

1. 上記のように細胞を16日間培養し、培地を取り出す。
   1. 75 mLの無菌水、4gのパラホルムアルデヒドからなる、あらかじめ温め込まれた固定液をインキュベートする。必要に応じて10 N NaOHを加え、溶液がクリアになるまでかき混ぜます。その後、10x PBSの10mL、MgCl2の0.5mL、0.5 M EGTAの2 mL、および4gのスクロースを加えます。 6 N HClでpH 7.4に触れ、15分間100mLの無菌水を持ち^込む、とMarchenkoら7.
   2. 固定剤を捨て、毎回5分間、細胞を3回洗浄します。すぐに作りたての0.3%トリトンX溶液を加え、5分間細胞を透過させます。PBSで3回洗浄し、PBSと5%BSAで作られたブロッキング溶液を追加します。
   3. ロッカープレートの室温で細胞を1時間ブロックします。
   4. 1%BSA/PBSで適切な抗体希釈を調製し、ロッカープレート上の抗体希釈液を室温で1.5時間インキュベートします。細胞をPBSで3回洗浄し、それぞれ5分間、DAPIで細胞をインキュベートし、顕微鏡上で視覚化するために取り付け培地でカバーリップを取り付けます。
      注: この実験で使用した直接標識抗体は、一覧の 一覧は、材料表に記載されています。

7. 新たに発生した細胞の透過型電子顕微鏡解析

1. 8ウェルチャンバースライドでTEM用セルをシードします。
2. 37°Cで1時間、2%OsO4で2%OsO4で後固定し、暗闇の中で2%ウラニル酢酸を2時間30分間暗に汚します。
3. 最後に、蒸留水で細胞をすすい、エタノールで脱水し、エポキシ樹脂に一晩埋め込みます。翌日、樹脂硬化のため70°Cのオーブンに72時間移します。
4. 埋め込まれた細胞培養物をチャンバースライドから取り外し、接着してアルルディートブロックにします。
5. シリアル半薄切片(1.5 μm)を機械で切り、ガラススライドに取り付け、1%トルイジンブルーで軽く汚します。
6. 選択した半薄いセクションをaralditeブロックに接着し、凍結(液体窒素中)と解凍を繰り返してガラススライドから取り外します。
7. 超薄いセクション(0.06-0.08 μm)を機械で準備し、さらにクエン酸鉛と対照的に。
8. 電子顕微鏡をデジタルカメラで撮影。

結果

この新しいGMフリー法は、ヒトゲノムに直接作用することなく、血液前駆細胞を最も原始的な状態に戻すことができるという証拠を提供する。

我々は以前、GPI結合タンパク質特異的抗体架橋が、WNT、NOTCH、C-Kitなどの高度に保存された発達関連遺伝子のPLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTENアップレギュレーションを介して開始することを示し、HSCの生成への第一歩とBD-PS-PSの第2段階?...

ディスカッション

本研究で説明されたヒト細胞をリプログラミングする非GM法は、非操作ヒト末梢血から得られた自己再生PSCの 元生体 生成および拡張につながる脱分化のプロセスを開始するGPI結合ヒト膜糖タンパク質の背後にあるシグナル伝達の核活性化に膜に基づいている。これらの細胞は、適切な培地で培養した場合には、異なる生殖層⁶に属する細胞への再分化が可能である。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V	Roth	T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate	Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
AO/PI Cell Viability kit	Biozym	872045	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes	Sigma Aldrich	A8960-5G
B27 Serum free 50x	Fisher Scientific (Gibco)	11530536
Basic FGF solution	Fisher Scientific (Gibco)	10647225
Biocoll	Merck Millipore	L6115-BC	density gradient media
BSA Frac V 7.5%	Gibco	15260037
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna	Biozym	872010	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek	Fisher Scientific	10234121
D-MEM/F12	Merck Millipore	FG4815-BC
Durcupan	Sigma Aldrich	44610	epoxy resin
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human	Fisher Scientific (Gibco)	10679963
GlutaMax 100x	Gibco	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde grade	Sigma-Aldrich	G5882-50ML
Heparin sodium cell	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Human BDNF	Fisher Scientific (Gibco)	11588836
Iscove (IMDM)	Biochrom	FG0465
Laminin mouse	Fisher Scientific (Gibco)	10267092
Lead citrate	Sigma-Aldrich	15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter	Biozym	872040	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MEM NEAA 100x	Gibco	11140035
MiniMACS Trennsäulen	Miltenyi	130-042-201
Morada digital camera	Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells	Fisher Scientific	10507591
N2 Supplement 100x	Fisher Scientific (Gibco)	11520536
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS sterile	Roth	9143.2
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite	Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit	FEI Europe
Ultracut UC-6	Leica
Uranyl acetate C	EMS	22400