GEN-freie Erzeugung von blutabgeleiteten neuronalen Zellen

Zusammenfassung

Wir stellen eine gentechnisch veränderte (GV-freie) Methode vor, um Zellen mit einem neuronalen Phänotyp aus reprogrammierten peripheren Blutzellen zu gewinnen. Die Aktivierung eines Signalwegs, der mit einem neuartigen menschlichen GPI-verknüpften Protein verbunden ist, zeigt eine effiziente GENV-freie Methode zur Gewinnung menschlicher pluripotenter Stammzellen.

Zusammenfassung

Viele neurologische Erkrankungen des Menschen werden durch die Degeneration von Neuronen und Gliazellen im Gehirn verursacht. Aufgrund von Einschränkungen in pharmakologischen und anderen therapeutischen Strategien gibt es derzeit keine Heilung für das verletzte oder erkrankte Gehirn. Zellersatz erscheint als vielversprechende therapeutische Strategie für neurodegenerative Erkrankungen. Bis heute werden neuronale Stammzellen (NSCs) erfolgreich aus fetalem Gewebe, menschlichen embryonalen Zellen (ES) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) erzeugt. Ein Prozess der Dedifferenzierung wurde durch die Aktivierung des neuartigen menschlichen GPI-verknüpften Glykoproteins eingeleitet, das zur Erzeugung pluripotenter Stammzellen führt. Diese aus dem Blut gewonnenen pluripotenten Stammzellen (BD-PSCs) differenzieren sich in vitro zu Zellen mit einem neuronalen Phänotyp, wie die Hellfeld- und Immunfluoreszenzmikroskopie zeigt. Die ultrastrukturelle Analyse dieser Zellen mittels Elektronenmikroskopie bestätigt ihre primitive Struktur sowie neuronale Morphologie und subzelluläre Eigenschaften.

Einleitung

Die Entwicklung grundlegender und präklinischer Stammzellforschungsmethoden fördert die klinische Anwendung stammzellbasierter Therapien bei neurologischen Erkrankungen. Eine solche mögliche Therapie hängt entscheidend von der Methode zur Erzeugung menschlicher Nervenzellen ab, die zur funktionellen Erholung führen¹.

Neuronale Stammzellen (NSCs) erneuern sich selbst und differenzieren sich im Laufe des Lebens in einem Prozess, der als adulte Neurogenese bezeichnet wird. Nur sehr eingeschränkte Hirnareel beherbergen NSCs, die in der Lage sind, neugeborene Neuronen im Erwachsenenalter zu erzeugen. Solche NSCs können reife Neuronen hervorbringen, die am Lernen und Gedächtnis beteiligt sind und so verlorene oder beschädigte Neuronen ersetzen. Leider sind diese NSCs in begrenzten Mengen vorhanden und diese begrenzte Neurogenese nimmt während der juvenilen Entwicklung schnell ab². Daher müssen andere Quellen von Nervenzellen in einem Zelltherapieziel berücksichtigt werden.

Degenerative neurologische Erkrankungen sind mit pharmakologischen Standardansätzen schwer zu heilen. Neue therapeutische Strategien zur Umarmung vieler nicht medikamentöser neurologischer Erkrankungen basieren auf Zellersatztherapien von erkranktem und verletztem Gewebe. Die NSC-Transplantation könnte beschädigte Zellen ersetzen und positive Wirkungen erzielen. Andere Quellen für den Neuronalen Zellersatz sind humane embryonale Stammzellen (ESC), die aus der inneren Zellmasse der Säugetier-Blastozysten³gewonnen werden, sowie iPSCs^4,die wie ESCs über eine umfangreiche Selbsterneuerungsfähigkeit verfügen und in der Lage sind, sich in verschiedene Zelllinien zu differenzieren. NSCs können auch durch direkte Reprogrammierung von menschlichen Fibroblasten erzeugt werden, wodurch der pluripotente Zustand⁵vermieden wird.

Die Zellersatztherapie ist nach wie vor ein herausforderndes Thema. Obwohl ESC, fetal oder iPS eine Quelle für die Erzeugung neuronaler Zellen zur Behandlung vieler unheilbarer neurologischer Erkrankungen sein können, ist der autologe adulte SCs-Zellersatz von beschädigtem Gewebe eine bessere Alternative, die immunologische, ethische und Sicherheitsbedenken umgeht.

Die Aktivierung des humanen GPI-verknüpften Proteins durch Antikörpervernetzung durch Phosphorylierung von PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN initiiert eine Dedifferenzierung von Blutvorläuferzellen und die Erzeugung von blutabgeleiteten pluripotenten Stammzellen (BD-PSCs)⁶. Diese Zellen differenzieren sich in vitro gegenüber neuronalen Zellen, wie durch Hellfeld-, Immunfluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt.

In dieser Arbeit beschreiben wir die GEN-freie Erzeugung von BD-PSCs und deren erfolgreiche Redifferenzierung in Zellen mit neuronalem Phänotyp.

Protokoll

Bei der Durchführung der Experimente wurden ethische Genehmigungen eingeholt.

1. Isolierung von mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes (PBMNCs)

1. Stellen Sie sicher, dass alle Spender eine Einwilligung nach Aufklärung unterzeichnet haben, bevor sie die Blutentzugskonformität in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchführen.
2. Nehmen Sie 30 ml Blut von gesunden Spendern durch geschultes medizinisches Personal gemäß dem Standardprotokoll.
3. Isolieren Sie PBMNCs durch Dichtegradientenmedien. Verwenden Sie 10 ml Medium mit 25 ml 1:1 Blut, verdünnt mit Phosphatpuffersalzlösung (PBS), und Zentrifuge bei 300 x g für 30 min.
4. Isolieren Sie die Interphasenschicht zwischen dem Plasma und dem Dichtegradientenmedium durch Pipettieren. Waschen Sie die isolierten Zellen mit 5 ml sterilem PBS und Zentrifuge bei 300 x g für 10 min. Wiederholen Sie es zweimal.
5. Zählen Sie die Anzahl der Zellen nach Standardmethoden mit einer Zählkammer.

2. Aktivierung des humanen GPI-verankerten Glykoproteins durch Antikörpervernetzung auf der Oberfläche von PBMNCs

1. Die 6 x 10⁶ mononukleären Zellen (MNCs) werden in 15 ml Röhrchen eingelegt und eine Antikörpervernetzung durchgeführt, indem die Zellen mit humanen GPI-verknüpften Membranprotein-spezifischen Antikörpern (30 μg/ml) für 30 min in PBS mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) bei 37 °C inkubiert werden.
2. Ersetzen Sie das Inkubationsmedium durch das modifizierte Dulbecco-Medium von Iscove, das mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird.
3. Züchten Sie die Zellen in 15 ml Polystyrolröhrchen, legen Sie die Röhrchen für 8-10 Tage in einen Inkubator bei 37 °C und 5% CO₂ (ohne Schütteln). Fügen Sie auf D5 zusätzliche 1-2 ml Iscove-Medium hinzu, ergänzt mit 10% FBS, zu jeder 15-ml-Röhre.

3. Sortierung neu erzeugter dedifferenzierter Zellen

1. Zählen Sie Zellen mit einem automatisierten Zellzähler (18 μL Zellsuspension + 2 μL Fluoreszenzfarbstoff) oder in einer Zählkammer.
2. Zentrifugen kultivierte Zellsuspension (5-7 x^{10 6}) bei 300 x g für 10 min und den resultierenden Überstand mit einer sterilen Pasteur-Pipette absaugen.
3. Suspendieren Sie das Zellpellet in 90 μL vorgekühltem PBS pH 7,2, 0,5% BSA und 2 mM EDTA.
4. CD45-positive magnetische Perlen in Nanogröße (80 μL) in die Zellsuspension geben und 15 Minuten lang auf Eis inkubieren.
5. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 2 ml PBS-Puffer und Zentrifuge bei 300 x g für 10 min hinzufügen.
6. Suspendieren Sie die Zellen in 500 μL PBS-Puffer.
7. Waschen Sie die Säule mit 500 μL vorgekühltem PBS-Puffer und legen Sie sie in das Magnetfeld.
8. Legen Sie die Zellsuspension auf die Säule und waschen Sie sie mit 500 μL PBS-Puffer (zweimal) und dem Zentrifugenstrom mit CD45-negativzellen. Sammeln Sie sie in Iscoves Medium, ergänzt mit 1% BSA.
9. Zählen Sie die Zellen in der Zählkammer.

4. Vorbereitung von Zellkulturschalen zur neuronalen Differenzierung neu erzeugter Stammzellen

1. Beschichten Sie die Kulturgefäße mit Poly-L-Ornithin und Laminin, um neuronale Zellen zu züchten.
2. Legen Sie die Glasdeckschichten in 4-Well-Platten und beschichten Sie sie mit 1:5 verdünntem Poly-L-Ornithin (0,1 mg/ml in ddH₂O) in ddH₂O. Legen Sie die Deckrutsche für 1 h in einen 37 °C-Inkubator. Anschließend mit ddH₂O waschen.
3. Laminin langsam auftauen (0,5-2,0 mg / ml) und oben auf den Abdeckeln hinzufügen. Inkubieren Sie es bei 37 °C für 2 h.
4. Vorbereiten des neuronalen Induktionsmediums N2, bestehend aus 49 ml D-MEM/F12, 500 μL N2-Ergänzung, 400 μL nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), basische FGF-Lösung bei 20 ng/ml Endkonzentration (hergestellt aus 100 μg/ml Stammlösung) und Heparin bei 2 ng/ml Endkonzentration.
5. Entfernen Sie überschüssiges Laminin durch Pipettieren und fügen Sie dem Kulturschalen neuronales Medium N2 hinzu.

5. Kultivierung neuronaler dedifferenzierter Blutzellen

1. Kultur BD-abgeleitete CD45-negative Zellen auf Laminin/Ornithin-beschichteten Glasabdeckungen für 2 Tage in einem Inkubator bei 37 °C und 5% CO₂ in N2-Medium, um eine neuronale Differenzierung von neu BD-erzeugten Zellen einzuleiten.
2. Kulturzellen weiter in neuronalem Differenzierungsmedium bestehend aus 48 ml neurobasalem Medium, 500 μL L-Glutamin, 1 ml B27-Ergänzung, 500 μL NEAA, 50 μL rekombinantem humanem Glia-abgeleitetem neurotrophen Faktor (GDNF) bei 5 μg/250 μL in PBS/0,1% BSA und 50 μL rekombinantem neurotrophen Faktor (BDNF) des menschlichen Gehirns bei 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA und 50 μL Ascorbinsäurelösung 2,9 g/50 ml in PBS. Legen Sie die Platten in einen Inkubator bei 37 °C und 5% CO₂.

6. Immunfluoreszenzmikroskopische Analyse von blutabgeleiteten Nervenzellen

1. Kulturieren Sie die Zellen wie oben beschrieben für 16 Tage und entfernen Sie die Medien.
   1. Inkubieren Sie mit vorgewärmten Fixiermitteln, bestehend aus 75 ml sterilem Wasser, 4 g Paraformaldehyd. Fügen Sie nach Bedarf 10 N NaOH hinzu und rühren Sie um, bis die Lösung klar ist. Dann fügen Sie 10 mL 10x PBS, 0,5 ml_MgCl2, 2 mL 0,5 M EGTA und 4 g Saccharose hinzu. Titrieren Sie auf pH 7,4 mit 6 N HCl und bringen Sie auf 100 ml steriles Wasser für 15 minuten, nach Marchenko et al.⁷.
   2. Entsorgen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen 3 Mal für jeweils 5 min. Sofort eine frisch hergestellte 0,3% Triton X-Lösung hinzufügen und die Zellen für 5 min permeabilisieren. 3 Mal mit PBS waschen und eine Blockierungslösung von PBS und 5% BSA hinzufügen.
   3. Blockieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur auf einer Wippplatte für 1 Stunde.
   4. Bereiten Sie eine geeignete Verdünnung von Antikörpern in 1% BSA / PBS vor und inkubieren Sie die Zellen mit Antikörperverdünnungen auf der Rockerplatte für 1,5 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen 3 mal mit PBS für jeweils 5 min, inkubieren Sie die Zellen mit DAPI und montieren Sie die Abdecklappen mit Montagemedien zur Visualisierung auf einem Mikroskop.
      HINWEIS: Direkt markierte Antikörper, die in diesem Experiment verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

7. Transmissionselektronenmikroskopische Analyse neu erzeugter Zellen

1. Säen Sie die Zellen für TEM in 8-Well-Kammerobjektträgern.
2. Fixieren Sie die Zellen in 3,5% Glutaraldehyd für 1 h bei 37 °C, postfixieren Sie in 2% OsO₄ für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur und färben Sie sie in 2% Uranylacetat im Dunkeln bei 4 °C für 2 h 30 min.
3. Zum Schluss die Zellen in destilliertem Wasser abspülen, in Ethanol dehydrieren und über Nacht in Epoxidharz einbetten. Am nächsten Tag werden die Proben für 72 h zur Harzhärtung in einen 70 °C-Ofen überführen.
4. Lösen Sie die eingebetteten Zellkulturen vom Kammerschieber und kleben Sie sie auf Aralditblöcke.
5. Schneiden Sie serielle halbdünne Abschnitte (1,5 μm) mit einer Maschine, montieren Sie sie auf Glasobjektträger und färben Sie sie leicht mit 1% Toluidinblau.
6. Ausgewählte halbdünne Abschnitte auf Aralditblöcke kleben und durch wiederholtes Einfrieren (in flüssigem Stickstoff) und Auftauen vom Glasobjektträger lösen.
7. Bereiten Sie ultradünne Abschnitte (0,06-0,08 μm) mit einer Maschine vor und kontrastieren Sie sie mit Bleicitrat.
8. Erhalten Sie Mikroaufnahmen mit dem Elektronenrinnenmikroskop mit Digitalkamera.

Ergebnisse

Die Ergebnisse liefern Hinweise darauf, dass diese neuartige gentechnikfreie Methode in der Lage ist, Blutvorläuferzellen in ihren primitivsten Zustand zurückzusetzen, ohne direkt auf das menschliche Genom einzuwirken.

Wir haben bereits gezeigt, dass die GPI-verknüpfte proteinspezifische Antikörpervernetzung über PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN eine Hochregulierung hochkonservierender entwicklungsrelevanter Gene wie WNT, NOTCH und C-Kit initiiert und damit einen Prozess der Dedifferenzi...

Diskussion

Die in dieser Arbeit beschriebene Nicht-GM-Methode zur Reprogrammierung menschlicher Zellen basiert auf der Membran-zu-Kern-Aktivierung der Signalmaschinerie hinter dem GPI-verknüpften menschlichen Membranglykoprotein, das den Prozess der Dedifferenzierung einleitet, der zur Ex-vivo-Erzeugung und -Expansion von sich selbst erneuernden PSCs führt, die aus nicht manipuliertem menschlichem peripherem Blut gewonnen werden. Diese Zellen sind, wenn sie in geeigneten Medien kultiviert werden, in Zellen umzudifferenzi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V	Roth	T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate	Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
AO/PI Cell Viability kit	Biozym	872045	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes	Sigma Aldrich	A8960-5G
B27 Serum free 50x	Fisher Scientific (Gibco)	11530536
Basic FGF solution	Fisher Scientific (Gibco)	10647225
Biocoll	Merck Millipore	L6115-BC	density gradient media
BSA Frac V 7.5%	Gibco	15260037
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna	Biozym	872010	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek	Fisher Scientific	10234121
D-MEM/F12	Merck Millipore	FG4815-BC
Durcupan	Sigma Aldrich	44610	epoxy resin
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human	Fisher Scientific (Gibco)	10679963
GlutaMax 100x	Gibco	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde grade	Sigma-Aldrich	G5882-50ML
Heparin sodium cell	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Human BDNF	Fisher Scientific (Gibco)	11588836
Iscove (IMDM)	Biochrom	FG0465
Laminin mouse	Fisher Scientific (Gibco)	10267092
Lead citrate	Sigma-Aldrich	15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter	Biozym	872040	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MEM NEAA 100x	Gibco	11140035
MiniMACS Trennsäulen	Miltenyi	130-042-201
Morada digital camera	Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells	Fisher Scientific	10507591
N2 Supplement 100x	Fisher Scientific (Gibco)	11520536
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS sterile	Roth	9143.2
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite	Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit	FEI Europe
Ultracut UC-6	Leica
Uranyl acetate C	EMS	22400