Generazione priva di OGM di cellule neuronali derivate dal sangue

Riepilogo

Presentiamo un metodo privo di OGM per ottenere cellule con un fenotipo neuronale da cellule del sangue periferiche riprogrammate. L'attivazione di un percorso di segnalazione collegato a nuove proteine umane legate alla GPI rivela un metodo efficiente privo di OGM per ottenere cellule staminali pluripotenti umane.

Abstract

Molti disturbi neurologici umani sono causati dalla degenerazione di neuroni e cellule gliali nel cervello. A causa delle limitazioni nelle strategie farmacologiche e in altre strategie terapeutiche, attualmente non è disponibile alcuna cura per il cervello ferito o mato. La sostituzione cellulare appare come una promettente strategia terapeutica per le condizioni neurodegenerative. Ad oggi, le cellule staminali neurali (NSC) sono state generate con successo da tessuti fetali, cellule embrionali umane (ES) o cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Un processo di dedifferenziazione è stato avviato dall'attivazione della nuova glicoproteina umana legata alla GPI, che porta alla generazione di cellule staminali pluripotenti. Queste cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue (BD-PSC) si differenziano in vitro in cellule con un fenotipo neurale come dimostrato dalla microscopia a campo luminoso e immunofluorescenza. L'analisi ultrastrutturale di queste cellule mediante microscopia elettronica conferma la loro struttura primitiva, nonché la morfologia neuronale e le caratteristiche subcellulari.

Introduzione

Lo sviluppo di metodi di ricerca sulle cellule staminali di base e preclinali incoraggia l'applicazione clinica di terapie a base di cellule staminali per le malattie neurologiche. Tale potenziale terapia dipende in modo critico dal metodo per la generazione di cellule neurali umane che porta al recupero funzionale¹.

Le cellule staminali neurali (NSC) si rinnovano e si differenziano in nuovi neuroni per tutta la vita in un processo chiamato neurogenesi adulta. Solo aree cerebrali molto ristrette ospitano NSC competenti a generare neuroni appena nati in età adulta. Tali NSC possono dare origine a neuroni maturi, che sono coinvolti nell'apprendimento e nella memoria, sostituendo così i neuroni persi o danneggiati. Sfortunatamente, questi NSC sono presenti in quantità limitate e questa neurogenesi limitata diminuisce rapidamente durante lo sviluppo giovanile². Pertanto, altre fonti di cellule neurali devono essere considerate in un obiettivo di terapia cellulare.

Le malattie neurologiche degenerative sono difficili da curare utilizzando approcci farmacologici standard. Le nuove strategie terapeutiche per abbracciare molti disturbi neurologici imedicabili si basano su terapie di sostituzione cellulare del tessuto danneggiato e ferito. Il trapianto NSC potrebbe sostituire le cellule danneggiate e fornire effetti benefici. Altre fonti per la sostituzione delle cellule neurali includono le cellule staminali embrionali umane (ESC), che derivano dalla massa cellulare interna delle blastocsti dei mammiferi³, così come gli iPSC⁴, che hanno un'ampia capacità di autorinnovizzo come gli ESC e sono in grado di differenziarsi in vari lignaggi cellulari. Gli NSC possono anche essere generati dalla riprogrammazione diretta da fibroblasti umani evitando lo stato pluripotente⁵.

La terapia sostitutiva cellulare è ancora un problema impegnativo. Sebbene ESC, fetale o iPS possano essere una fonte per la generazione di cellule neuronali per il trattamento di molte malattie neurologiche incurabili, la sostituzione automatica delle cellule dei PC adulti adulti dei tessuti danneggiati è un'alternativa migliore che aggira i problemi immunologici, etici e di sicurezza.

L'attivazione di proteine umane legate alla GPI mediante collegamento incrociato anticorpale tramite fosforilazione di PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN avvia una dedifferentiazione delle cellule progenitrici del sangue e la generazione di cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue (BD-PDC)⁶. Queste cellule si differenziano in vitro verso le cellule neuronali come confermato mediante analisi di radiologia, immunofluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione (TEM).

In questo lavoro descriviamo la generazione senza OGM di BD-PSC e la loro riuscita ri-differenziazione in cellule con fenotipo neuronale.

Protocollo

Le approvazioni etico sono state ottenute durante l'esecuzione degli esperimenti.

1. Isolamento delle cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBMNC)

1. Garantire che tutti i donatori hanno firmato il consenso informato prima del ritiro del sangue nel rispetto delle linee guida istituzionali.
2. Prendi 30 mL di sangue da donatori sani da personale medico addestrato secondo il protocollo standard.
3. Isolare i PBMIC in base ai supporti gradienti di densità. Utilizzare 10 mL di mezzi con 25 mL di sangue 1:1 diluito con tampone di fosfato salina (PBS) e centrifuga a 300 x g per 30 min.
4. Isolare lo strato interfase tra il plasma e il mezzo gradiente di densità mediante pipettazione. Lavare le cellule isolate con 5 mL di PBS sterile e centrifuga a 300 x g per 10 min. Ripetere due volte.
5. Contare il numero di celle con metodi standard utilizzando una camera di conteggio.

2. Attivazione della glicoproteina ancorata alla GPI umana mediante reticoli anticorpali sulla superficie dei PBBC

1. Posizionare le 6 x 10^{6 cellule} mononucleari (MBC) in tubi da 15 ml ed eseguire il crosslinking degli anticorpi incubando le cellule con anticorpi specifici delle proteine di membrana legati alla GPI umana (30 μg/ml) per 30 minuti in PBS con albumina sierica bovina all'1% (BSA) a 37 °C.
2. Sostituire il mezzo di incubazione con il mezzo Dulbecco modificato di Iscove integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS).
3. Far crescere le cellule in tubi di polistirolo da 15 ml, mettere i tubi in un incubatore a 37 °C e 5% co₂ per 8-10 giorni (senza tremare). Su D5, aggiungere altri 1-2 ml del mezzo di Iscove integrato con FBS al 10% a ogni tubo da 15 ml.

3. Ordinamento delle celle didifferenziate appena generate

1. Contare le cellule con un contatore di celle automatizzato (sospensione cellulare da 18 μL + 2 μL di colorante a fluorescenza) o in una camera di conteggio.
2. Sospensione cellulare coltivata centrifuga (5-7 x 10⁶) a 300 x g per 10 minuti e aspirare il supernatante risultante con una pipetta Pasteur sterile.
3. Sospendere di nuovo il pellet cellulare in 90 μL di PBS pH 7,2 prerispesto, 0,5% BSA e 2 mM EDTA.
4. Aggiungere perline magnetiche positive di dimensioni nanometriche CD45 (80 μL) alla sospensione cellulare e incubare sul ghiaccio per 15 minuti.
5. Lavare le cellule aggiungendo 2 mL di tampone PBS e centrifuga a 300 x g per 10 min.
6. Sospendere di nuovo le cellule in 500 μL di tampone PBS.
7. Lavare la colonna con 500 μL di tampone PBS pre-raffreddato e posizionarla nel campo magnetico.
8. Posizionare la sospensione cellulare sulla colonna e lavarla con 500 μL di tampone PBS (due volte) e il flusso di centrifuga contenente celle negative CD45. Raccoglili nel mezzo di Iscove integrato con l'1% di BSA.
9. Contare le celle nella camera di conteggio.

4. Preparare piatti di coltura cellulare per la differenziazione neuronale delle cellule staminali appena generate

1. Rivestire i vasi di coltura con poli-L-ornitina e laminina per la crescita delle cellule neuronali.
2. Posizionare le coperture in vetro in piastre a 4 pozzoli e ricoprirla con poli-L-ornitina diluita 1:5 (0,1 mg/mL in ddH₂O) in ddH 2 O._Posizionarei copripacchi in un incubatore a 37 °C per 1 h. Quindi lavare con ddH₂O.
3. Scongelare lentamente la laminina (0,5-2,0 mg/mL) e aggiungere alla parte superiore dei copripasci. Incubarlo a 37 °C per 2 ore.
4. Preparare il mezzo di induzione neurale N2 composto da 49 mL di D-MEM/F12, 500 μL di integratore N2, 400 μL di amminoacidi non essenziali (NEAA), soluzione FGF di base a concentrazione finale di 20 ng/mL (preparata da soluzione stock di 100 μg/mL) ed eparina a concentrazione finale di 2 ng/mL.
5. Rimuovere la laminina in eccesso pipettando e aggiungere il mezzo neuronale N2 ai piatti di coltura.

5. Coltivazione di cellule del sangue disferenziate neuronali

1. Cellule negative CD45 derivate da coltura BD su coverlips in vetro rivestito di laminina/ornitina per 2 giorni in un'incubatrice a 37 °C e 5% di CO₂ nel mezzo N2 per avviare una differenziazione neuronale delle cellule appena generate dalla BD.
2. Cellule di coltura ulteriormente in mezzo di differenziazione neuronale costituito da 48 mL di mezzo neurobasale, 500 μL di L-glutammina, 1 mL di B27 Supplemento, 500 μL di NEAA, 50 μL di fattore neurotrofico ricombinante derivato dal glial umano (GDNF) a 5 μg/250 μL in PBS/0,1% BSA e 50 μL di cervello umano ricombinante fattore neurotrofico derivato (BDNF) a 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA e 50 μL di soluzione di acido ascorbico 2,9 g/50 mL in PBS. Posizionare le piastre in un incubatore a 37 °C e al 5% di CO₂.

6. Analisi della microscopia a immunofluorescenza delle cellule neurali derivate dal sangue

1. Coltura delle celle come descritto sopra per 16 giorni e rimuovere il supporto.
   1. Incubare con fissante prerifavorato composto da 75 mL di acqua sterile, 4 g di paraformaldeide. Aggiungere 10 N NaOH in base alle esigenze e mescolare fino a quando la soluzione non si sgombre. Aggiungere quindi 10 mL di 10x PBS, 0,5 mL di MgCl_2, 2 mL di 0,5 M EGTA e 4 g di saccarosio. Titolare a pH 7.4 con 6 N HCl, e portare a 100 mL di acqua sterile per 15 min, secondo Marchenko et^al.
   2. Scartare il fissatore e lavare le cellule 3 volte per 5 minuti ogni volta. Aggiungere immediatamente una soluzione Triton X allo 0,3% appena fatta e permeabilizzare le cellule per 5 minuti. Lavare 3 volte con PBS e aggiungere una soluzione di blocco realizzata da PBS e 5% BSA.
   3. Bloccare le celle a temperatura ambiente su una piastra rocker per 1 ora.
   4. Preparare un'adeguata diluizione degli anticorpi nell'1% di BSA/PBS e incubare le cellule con diluizioni anticorpali su piastra rocker per 1,5 ore a temperatura ambiente. Lavare le celle 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuna, incubare le cellule con DAPI e montare i copripavimenti con supporti di montaggio per la visualizzazione al microscopio.
      NOTA: Gli anticorpi etichettati direttamente utilizzati in questo esperimento sono elencati in Table of Materials.

7. Analisi della microscopia elettronica a trasmissione di cellule appena generate

1. Seminare le cellule per TEM in vetrini da camera a 8 pozzi.
2. Fissare le cellule in glutaraldeide al 3,5% per 1 h a 37 °C, post-fissare in 2% OsO_{4 per} un'ora aggiuntiva a temperatura ambiente e macchiare nel 2% acetato di uranil al buio a 4 °C per 2 h 30 min.
3. Infine, sciacquare le cellule in acqua distillata, disidratarle in etanolo e incorporarle nella resina epossidica durante la notte. Il giorno seguente trasferire i campioni in un forno a 70 °C per 72 ore per l'indurimento della resina.
4. Staccare le colture cellulari incorporate dallo scivolo della camera e incollare ai blocchi di araldite.
5. Tagliare sezioni semisottili seriali (1,5 μm) con una macchina, montare su vetri-scivoli e macchiare leggermente con l'1% di blu toluidina.
6. Incollare sezioni semisottili selezionate ai blocchi di araldite e staccarle dal vetrino mediante congelamento ripetuto (in azoto liquido) e scongelamento.
7. Preparare sezioni ultrathin (0,06-0,08 μm) con una macchina e contrasto ulteriore con il citrato di piombo.
8. Ottenere micrografie utilizzando il microscopio a scansione elettronica con fotocamera digitale.

Risultati

I risultati forniscono la prova che questo nuovo metodo privo di OGM è in grado di ripristinare le cellule progenitrici del sangue al loro stato più primitivo senza agire direttamente sul genoma umano.

Abbiamo precedentemente dimostrato che il crosslinking di anticorpi specifici della proteina legata alla GPI inizia tramite PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulation di geni altamente conservati rilevanti per lo sviluppo come WNT, NOTCH e C-Kit, avviando così un processo di dedifferentia...

Discussione

Il metodo non GM di riprogrammazione delle cellule umane descritto in questo lavoro si basa sull'attivazione da membrana a nucleo di macchinari di segnalazione dietro la glicoproteina a membrana umana legata alla GPI che avvia il processo di dedifferentiazione che porta alla generazione ex vivo e all'espansione di PSC autorenonti ottenuti da sangue periferico umano non manipolato. Queste cellule, se coltivate in mezzi appropriati, sono in grado di ri-differenziarsi in cellule appartenenti a diversi strati

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V	Roth	T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate	Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
AO/PI Cell Viability kit	Biozym	872045	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes	Sigma Aldrich	A8960-5G
B27 Serum free 50x	Fisher Scientific (Gibco)	11530536
Basic FGF solution	Fisher Scientific (Gibco)	10647225
Biocoll	Merck Millipore	L6115-BC	density gradient media
BSA Frac V 7.5%	Gibco	15260037
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna	Biozym	872010	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek	Fisher Scientific	10234121
D-MEM/F12	Merck Millipore	FG4815-BC
Durcupan	Sigma Aldrich	44610	epoxy resin
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human	Fisher Scientific (Gibco)	10679963
GlutaMax 100x	Gibco	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde grade	Sigma-Aldrich	G5882-50ML
Heparin sodium cell	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Human BDNF	Fisher Scientific (Gibco)	11588836
Iscove (IMDM)	Biochrom	FG0465
Laminin mouse	Fisher Scientific (Gibco)	10267092
Lead citrate	Sigma-Aldrich	15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter	Biozym	872040	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MEM NEAA 100x	Gibco	11140035
MiniMACS Trennsäulen	Miltenyi	130-042-201
Morada digital camera	Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells	Fisher Scientific	10507591
N2 Supplement 100x	Fisher Scientific (Gibco)	11520536
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS sterile	Roth	9143.2
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite	Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit	FEI Europe
Ultracut UC-6	Leica
Uranyl acetate C	EMS	22400