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要約

ここでは、血液脳関門転移性腫瘍微小環境を調製し培養し、共焦点イメージングと人工知能(機械学習)を用いてその状態を定量化するためのプロトコルを提示する。

要約

脳転移は最も致死的な癌病変である。すべての癌の10〜30%が脳に転移し、癌の種類に応じて生存期間の中央値は〜5〜20ヶ月である。脳転移性腫瘍の負担を軽減するためには、基礎的および翻訳的な知識のギャップに対処する必要があります。主な課題には、再現可能な前臨床モデルおよび関連ツールの貧弱性が含まれます。脳転移の三次元モデルは、専用の分析ツールと組み合わせると、これらのニーズに対処するために使用される関連する分子および表現型データを生成することができます。さらに、マウスモデルと比較して、血液脳関門を脳微小環境に通過する患者腫瘍細胞の臓器オンチップモデルは、結果を迅速に生成し、定量的方法でより解釈可能であり、したがって、高スループット検査に適しています。ここでは、新しい3Dマイクロ流体血液脳ニッチ(μmBBN)プラットフォームの使用を説明し、ニッチの複数の要素を長期間(数日間)培養し、共焦点顕微鏡で蛍光的に画像化し、革新的な共焦点断層撮影技術を使用して再構築された画像を説明し、実証します。全ては、マイクロ転移の発症と、繰り返し可能かつ定量的な方法での腫瘍微小環境(TME)の変化を理解することを目的としている。このプラットフォームを用いて、がん細胞やTME細胞および体液性成分を作製、種、画像化、分析する方法を実演します。さらに、モデルμmBBNを介して通過できるがん細胞の本質的な異型性差を特定し、脳転移電位の客観的指標を割り当てる、人工知能(AI)がどのように使用されているかを示す。この方法で生成されるデータセットは、転移、治療戦略の有効性、およびTMEの役割に関する基本的な質問と翻訳的な質問に答えるために使用することができます。

概要

脳転移は最も致死的な癌病変である。全ての癌の10~30%が脳に転移し、癌タイプ1、22に応じて、生存期間の中央値は約5~201ヶ月である。癌転移を研究する際に生じる主な問題は、サブクローンが血流の液性環境から脳33、44などの器官に移行する方法である。この質問は、移行、侵略、および外挿アッセイの多くのバリエーションにつながっています。これらの方法はすべて、刺激に応答してある場所から別の場所に移動する細胞の特性をカウントまたは測定する重要なステップを共有します。容易に利用できるほとんどの移動のアッセイは癌細胞の二次元(2D)のマイグレーションを研究するために使用される。これらは豊富な知識を解明しました。しかし、他の方法が5を提供できるin vivoシステムの立体的性質を再現しません。したがって、3次元(3D)系で腫瘍微小環境(TME)を研究する必要がありますが、3D構造に対して利用可能な解析アプローチは限られており、しばしば矛盾しています。

最も人気のある3Dツールの1つは、2つの異なる領域を分離し、井戸の底に吊り下げられた膜で構成されるボイデン室です。ボイデンは白血球の化学軸4を研究するアッセイを導入した。底部領域は、化学または他の手段66、77によって変化させ、上領域の細胞を下領域に移行するように誘導することができる。移行した細胞の数を定量化する最も一般的なアプローチは、バッファー溶液を用いて膜底から細胞を放出し、それらを溶解し、そして溶液7中のDNA含有量の量に基づいてそれらを数える。この間接的なアプローチは、技術の変動のためにオペレータエラーを起こしやすいため、処置は癌表現型および微小環境に関する情報を破壊する。ボイデンチャンバーアッセイのバリエーションは、膜上に残っている回遊細胞の固定を伴うが、継続的な研究66、8、98,9のためにもはや生存できない細胞の数を提供する。

ボイデン室の限界とマイクロ流体コミュニティにおける技術革新の成長により、移行アッセイチップは、3つの10、11、12ではなく一11,12方向の刺激に応答して細胞の動きを観察する開発が行われている。これらの移行アッセイは、結果のより良い解釈を可能にするフローまたは単一細胞分離13、14,14などの要因の制御を容易にする。ただし、2D 形式では動的な情報が失われるのは避けがちです。最近の研究では、3D環境14,15,15における血管外開法(すなわち、血液脳関門などの組織への循環からの細胞の移動)に焦点を当てている。細胞バリア/膜で起こる組織およびプローブ挙動への飛離距離は、ボイデンチャンバーまたは2Dマイクロ流体移動装置16のいずれかを使用して収集された測定値よりも洗練されている。したがって、3D外挿の適切なイメージングと解析を可能にするデバイスは、これらの高度な測定値をキャプチャするために重要ですが、文献には欠けています。

移動アッセイとは無関係に、3D空間17,18,18において組織を同定し、正確に再構成することができる磁気共鳴画像法(MRI)および断層撮影用の堅牢なイメージング技術が開発されている。これらの技術は、組織の特性に基づいて画像のzスタックおよびセグメント部分の画像を取得し、セグメント化された画像を3次元メッシュ19、20、2120,21に変換する。19これにより、医師は、3D個々の臓器、骨、および血管を視覚化して、癌または心臓病22、23,23の診断を外科的計画または援助する。ここでは、これらのアプローチが顕微鏡標本や3D外挿装置での使用に適応できることを示す。

この結果、我々は、既存の断層撮影ツールを適応させることによって膜全体の腫瘍細胞の飛散を研究する柔軟性を与える、本明細書で提示される革新的な共焦点断層撮影技術を開発した。このアプローチにより、内皮細胞層などの細胞バリアと相互作用するがん細胞行動の全範囲の研究が可能になります。がん細胞は、プローブ行動を示します;侵入するが膜の近くに残る人もいれば、バリアを容易に横断する人もいる。この技術は、全次元24における細胞の表現型に関する情報を得ることができる。この手法を使用して TME を研究することは、比較的安価で、解釈しやすく、再現性が高く、インビボマウスモデルの複雑性と比較すると、比較的複雑です。提示された方法論は、多くの種類の腫瘍および微小環境の研究のための強力な基礎を提供すべきである。

我々は、バリアおよびニッチ(脳内脳内皮細胞および星状細胞)の重要な要素を長期間培養できる3D微小流体血液脳ニッチ(μmBBN)プラットフォーム(図1)の使用を記述し、実証する。全ては、繰り返し可能かつ定量的な方法で、マイクロ転移の発症と腫瘍微小環境への変化を理解することを目的としている。脳ニッチとの血液脳関門界は、地下膜によって強化された脳内皮細胞、星血球足、および近球25から構成される。血液脳関門の形成と調節においてその重要性を考えると、アストロサイトおよび内皮成分に選択的に焦点を当てた。このプラットフォームを用いて、がん細胞や腫瘍微小環境細胞および体液性成分の製造、種子、画像、分析の方法を実演します。最後に、機械学習を用いて、モデルμmBBNを介して通過できる癌細胞の本質的な形素の違いを特定し、脳転移電位24の客観的指標を割り当てる方法を示す。この方法で生成されたデータセットは、転移、治療戦略、およびTMEの役割に関する基本的および翻訳的な質問に答えるために使用することができます。

プロトコル

1. 血液脳関門ニッチ型を準備する

注:このプラットフォームで使用される培養装置は、我々は上に細胞血液脳関門ニッチを構築するPDMSベースの足場です。それは多孔質膜によって分離される2つの部分から成っている。血液脳関門ニッチを準備するためにフォトリソグラフィを使用して作られた2つのSU-8型が必要である26、27。26,プロトコルは、最初に100 μmの厚い金型について説明し、その後、200 μmの厚い金型に対してノートが与えられます。

  1. 金型を準備するには、スクイーズボトルでアセトンを使用して4インチシリコンウエハーを洗浄し、窒素銃で乾燥させます。
    1. シリコンウェーハをホットプレートで200°Cで10分間焼き、残留溶媒をすべて除去します。
    2. 次に、シリコンウェーハをスピンコーターのチャックの上に中央に配置し、上部モールド用のSU8-2075の1 mLを分配します。500 rpm(加速度300 rpm/s)で5 sスピンしてフォトレジストを分散させ、次いで2200rpmで30秒(加速300 rpm/s)で100μm厚のSU-8コーティングを得る。指定された厚さを達成するために最適化が必要な場合があります。
  2. ホットプレートのウエハーを65°Cで2分間柔らかく焼き、すぐに98°Cで20分間焼きます。
  3. ウエハーをフォトリソグラフィーランプに設置し、標準手順に従って、マスクをウエハの中心に置きます。UVB(360 nm ± 10 nm)の230 mJ/cm2 の輝度とSU-8被覆のウエハースを露出させます。最適な投与量を決定するために、露光マトリックス実験を行うことができる。マスクデザインは 補足ファイル 1 で入手できます。
  4. 65°Cで2分間、98°Cで10分間すぐに露光後焼成を行い、接着性を向上させます。ウエハーを50°Cに冷却します。
  5. SU-8フォト開発者を使用して、露出していないレジストを取り外します。ウエハーを浴室で5分間リンスし、化学フードでSU-8開発者で満たされたスプレーボトルを使用して、残りの未硬化のSU-8を攪拌して取り除きます。4倍顕微鏡を用いれば、未硬化のSU-8が取り除かれたかどうかを観察することができます。フォトレジストのエッジの白い線は SU-8 が完全に除去されないことを示します。
  6. 110°Cのオーブンで60分間、最後のハードベークを行います。
  7. SU-8 2075を使用した200 μmの厚さの金型でも同じ手順に従いますが、プロトコルを次のように調整します。
    1. スピンコーターの設定:500 rpm(加速度300 rpm/s)で5 sスピンしてフォトレジストを分散させ、30秒を1300 RPM(加速度300 rpm/s)で分散させ、200 μmの厚いコーティングを得ます。
    2. 65°Cで2分間柔らかく焼き、98°Cで40分間焼きます。
    3. 340 mJ/cm2の露出時間。
    4. ポスト露光ベーク:65°Cで2分、15分間98°C。
  8. 最後に、シラナイジング溶液(トリクロロパーフルオロオチルシラン)の3滴(約150μL)が入ったプラスチック容器を用いて、化学フードの内部の真空チャンバーに入れることで、各ウエハをシラナイズする。真空を引っ張り、蒸気がウエハーをコーティングできるように一晩放置します。このステップはSU-8とPDMS間の接着を減らし、型の寿命を増加させる。
    注意:トリクロロパーフルオロクチルシランは、常にヒュームフードで処理し、水源から遠ざける必要があります。
  9. 両面テープの2つのストリップを使用して、個々のウエハー金型を150mmのペトリ皿に入れます。ウェハーが平らであることを確認します。別の方法は、ウエハを配置することができるアルミニウムモールドを製造することです。アルミニウムモールドが封じ込められているので均一な厚さの鋳造物を生成し、ペトリ皿法は表面の傾きに敏感であるのに対し、それは上に置かれる。PDMSキャストの平面性の向上により、下流の共焦点イメージング時間が短縮されます。

2. PDMS血液脳関門(BBB)装置を形成し、組み立てる

  1. プラスチックカップで重量で1:10(架橋器:ベース)の比率でPDMSの75gを混ぜます。
  2. PDMSを金型(厚さ200μmの場合は厚さ1mm、厚さ100μmの金型に4mm)を注ぎ、真空デシケータで1時間またはすべての気泡が取り除かれるまで脱気します。65°Cのオーブンに一晩置きます。1mm厚さは、共焦点顕微鏡における10x目的の作動距離に基づいて調整することができる。
  3. PDMSが硬化した後、刃を使用して、エッジの周りのPDMSを通してウエハに対して穏やかに切断します。PDMSを剥がし、ブレードを使用して長方形のガイドに沿って切断し、1.5 mmのバイオプシーパンチを使用してデバイスの入口とコンセントを開きます。PDMSデバイスの部品を48mm幅のパッキングテープで覆い、ほこりやごみからきれいに保ちます。
  4. 次に、解剖はさみを使用して5μmの孔でポリカーボネート膜の5ミリメートルx 50mmの長方形をカットし、後で使用するためにペトリ皿の中に保管してください。
  5. 200 μL ピペットチップ、2 mL の 1:10 PDMS の 1:10 PDMS をガラスバイアルで重量 2:3 の割合で混合し、パスツールピペットにスクイーズバルブ、準備した PDMS 上部および下部部分、膜、3 つの 50 mm x 75 mm ガラス スライドをスピン コートに転送します。デバイスの組み立ておよびセルシードの次の手順を 図 1に示します。
  6. パスツールピペットを使用して、スピンコート機のチャック上の50 mm x 75 mmガラススライドにPDMS:トルエン接着剤溶液を1 mL転送します。100 rpm(加速300 rpm/s)で5秒間、2000rpmで30秒間(加速300 rpm/s)回転します。
  7. テーブルの上にスライドを置き、1つのPDMS上部チャンバーと1つの下の部屋でそれをカバーし、それに成形された特徴を持つPDMSの顔がスライドに接触し、接着剤がPDMS面に転送され、すべての特徴の周囲を概説します。
  8. PDMS上部チャンバーを接着剤コーティングを上に向けて別のスライドに反転させ、入口と出口の間のデバイス全体に膜を慎重に配置します。200 μL のチップを PDMS:トルエン接着剤溶液に入れ、チップに悪を起たくなるまで置きます。各入口と出口の間の先端をタッチして、PDMSに接触する膜の端の近くに小さな落下を配置します。
  9. デバイスの残りの半分を取り外し、2つの部分の入り口とコンセントを揃えながら、接着剤コーティングを下にして上に置きます。
  10. 組み立てた装置を一晩37°Cのオーブンに入れ、接着剤を硬化させます。乾燥剤で真空ベル瓶に移し、2日間脱水します。これは、トルエンが蒸発し、実験室の空気中の吸収された水蒸気を調節することによって、デバイスを播種する一貫性を向上させるための重要なステップです。

3. 脳マイクロ環境をデバイスにシードする

  1. 細胞培養および試薬:このプロトコルを開始する前に、以下の試薬および細胞を入手する。5%CO2で37°Cに設定されたインキュベーターですべての細胞株を2培養する。
    1. ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞株MDA-MB-231(ATCC HTB-26)およびMDA-MB-231-BR-GFP細胞(パトリシア・スティーグ、PhDから得た)を4.5g/LグルコースでDMEMに維持し、2mM Lグルタミン、10%FBSおよび1x抗生物質抗ミキサキを補充する。MDA-MB-231-GFP蛍光細胞を空のベクターpLL-EV-GFPレンチウイルスでトランスデューシングして、MDA-MB-231-GFP蛍光細胞を作成します。実験前に蛍光活性化細胞分類(FACS)を使用して、トランスデューシングされたGFP+ 集団を並べ替えます。
    2. EGM-2培地でヒト脳内皮細胞hCMEC/D3を維持する。空のベクターpLL-3.7-dsRedレンチウイルスでhCMEC/D3をトランスデューシングすることにより、hCMEC/D3-DsRed蛍光細胞を作成します。実験使用前にFACSを用いて、非蛍光細胞を培養から全て除去する。
    3. 4.5 g/Lグルコース、10%FBS、2 mMグルタマックス、1 mMピルビン酸ナトリウム、1x N-2成長サプリメント、および1x抗生物質抗抗抗抗抗抗抗抗抗薬を補ったDMEMで正常なヒトアストロサイト(NHA)を維持します。pLOX-TERT-iresTKレンチウイルスベクター(Addgene 12245)をトランスデューシングすることにより、アストロサイトを不死化させる。プラスミドpsPAX2およびエンベローププラスミドpMD2.G(Addgene 12260および12259)を使用してベクターを作成します。
  2. 真空デシケータからμmBBNデバイスを取り出し、入口を下に向けて金属または紙(テープ)表面に置き、プラズマチャンバーに入れます。また、プラズマチャンバーに50 mm x 75 mmのガラススライドを設置します。真空を引き出し、80 Wのプラズマで30sの処理を行います。
  3. プラズマチャンバから素早くガラススライドと装置を取り外し、ガイド(補足ファイル2)を使用して、入口を上向きにしてガラススライドに配置します。これにより、PDMS とガラス スライドの間に永続的な結合が作成され、再配置できません。
  4. 次に、チップを16、200 μLピペットチップ、先端から2mm切り落とします。すべての入口と出口にピペットの先端を挿入します。このデバイスは、細胞を播種する準備ができていない場合は、この時点で真空デシケーターに戻すことができます。
  5. デバイスをプラズマチャンバーに戻し、200 Wで8分間プラズマで処理します。デバイスがプラズマ処理から冷却された後(5分)、透明なピペットチップボックスのように、滅菌二次容器の中に置きます。次のステップを〜15分以内に行うか、または血漿処理の有効性が低下し、詰まりにつながる可能性がある。
  6. 実験培養の数日前にペトリ皿 1 x 106 内皮細胞 (hCMEC/D3-DsRed) と 1 x 106 アストロサイト (NHA).装置が8分の血漿処理を受けている間に、0.8 M NaHCO3 の64 μLおよび10x高グルコース(250 mM)MEMの20 μLの3 mg/mLピュアコルI型ウシのコラーゲンの0.5 mLからなるコラーゲン溶液を準備する。コラーゲン溶液中の5.0 x 105個 のNHA細胞を懸濁します。使用していない間氷の上にソリューションを維持します。
  7. コラーゲン/アストロサイト/ミクログリア溶液の120 μLを底チャンバのピペットチップを通してデバイスに移します(図1赤い矢印)。ソリューションが反対側のピペットチップにチャンバーを横切ってウィックするようにします。装置の4つのチャネルがすべて満たされた後、チップをCO2インキュベーターに37°Cで、5%CO2で21時間かコラーゲンがセットされるまで置く。
  8. コラーゲンがセットされた後、完全な培地の混合物で底のチャンバーを供給するすべてのピペットの先端を充填します。内皮細胞とアストロサイトを含むチップの場合、内皮:アストロサイト培地の50:50ミックスが使用されます。
  9. 上部のピペットチップ(図1ブルー矢印)を使用して完全な内皮培地で2%成長因子減少したマトリゲルを上のチャンバーにコーティングし、インキュベーターに1時間置きます。
  10. 示された媒体混合物で上のチャンバーをリンスし、代わりの先端が内皮細胞で播種される(図1緑の矢印)。1 m 10 6 の内皮培地で 1 x 106 個の内皮細胞をサスペンドし、15 分ごとに 30 μL をシードして、均等なカバレッジのための上部チャンバーチップを交互に使用します。内皮細胞を各上部チャンバー先端に2回、チャンバーあたり合計4回ずつシードします。
  11. 内皮細胞の最終播種後、すべての先端を培地混合物で満たし、37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに装置を入れ、122時間ごとに両方のチャンバーで培地を交換する。

4. 内皮層形成の進行を監視する

  1. 内皮層によるチャネルの完全なカバレッジは3日後に観察される。内皮バリアの被覆範囲を監視するには、蛍光またはTEERの2つの方法のいずれかを使用します。hCMEC/D3-DsRed蛍光とチャンネルエリア全体のパーセントカバレッジは、ImageJを使用して定量化することができます。
    1. hCMEC/D3-DsRed バリアを表すイメージ J で TIFF ファイルを開きます。ImageJ ソフトウェアで、[ファイル] > [開く ] をクリックしてファイルを選択します。
    2. 次のキー コマンドとオプションに従って最大強度を使用して、イメージのすべての Z レイヤーをマージします。
    3. この方法で評価されるすべてのマイクロ流体チップで同じ色のしきい値を実行します。提示された研究のために、我々は450のしきい値を採用しました。ImageJ のしきい値メニューを使用します: イメージ> 調整/しきい値。
    4. 次のコマンドとオプションを使用して記録する測定値を設定します: 分析> [測定値を設定]> [しきい値に制限] , 面積分数.
    5. ボックスを描画して測定するマイクロ流体チャネルの代表領域を選択します。ボックスツールはImageJのメインメニューにあります。同じボックスサイズを使用して、各マイクロ流体チャネルの始まり、中間、および終点に位置する3つの技術的な反復を測定します。
    6. 各チャネルを分析し、領域の割合を記録して、内皮カバレッジの割合を表します。これらの測定値をスプレッドシート ファイルとしてエクスポートし、次のコマンドを使用してデータをプロットおよび視覚化します。
  2. 代替として、インピーダンス分光法ベースのTEERを使用して、領域あたりの内皮タイトジャンクションを測定します。TEERを用いた内皮バリアの定量化は、内皮層をバリアとして完全性の代理としている。
    1. 上下のチャンバの入口と出口に2つの電極を配置します。
    2. Srinivasanらの提案したモデルに従って、チップ内の抵抗、インダクタンス、および容量の組み合わせとして内皮単層のインピーダンスを定量化する28,。

5. がん細胞をデバイスにシードする

  1. 内皮層が成熟した後、癌細胞をデバイスに播種する。完全な癌細胞媒体の1 x106 癌細胞の1 mLの解決を準備する。
  2. チップ内の培地を交換して細胞培養栄養分を補充する。
  3. 各上部チャンバーチャネルに30μLのがん細胞を懸濁させ、15分間インキュベーターに戻します。常に単一のデバイス内のすべての4つのトップチャンバーチャネルの同じ側に癌細胞を播種します。
  4. デバイスを新しいメディアと交換し、デバイスがメタスタティック動作のためにイメージされるまで 12 時間ごとにヒントを補充します。

6. 共焦点イメージングによる腫瘍微小環境の画像化

  1. 目的の実験時間(1、2、または9日間)で、共焦点イメージングを使用してチャネルの3D画像をキャプチャします。ここで説明する設定を使用して、ニコン A1 でこの手順を実行します。このステップは自動化されており、各チャンネルは、含まれている蛍光チャネルの数とすべての細胞の位置をカバーするために必要なZ深さに応じて、画像に20〜40分を必要とします。
  2. 顕微鏡をオンにし、ソフトウェアを開き、インキュベーターカバーを顕微鏡に置きます。
  3. 顕微鏡ステージヒーターを37°C、CO22を5%に設定します。
  4. 顕微鏡インキュベーターが安定した後、50 mm x 75 mm マウントを使用してデバイスを顕微鏡ステージに設置します。
  5. 10xの目的でデバイスの片側(提供された解析ソフトウェアで使用する場合は左)に焦点を合わせ、Z高さをゼロに設定します。Zスタック設定では、フォーカス平面の下に100 μm以上、200 μmの範囲を含めます。次に、ステッチ設定を使用して、X フィールドと Y フィールドの数を 1 と 9 にそれぞれ 15% の重なり合いを設定します。ピンホールを推奨最小値に、Zレイヤーの高さを 9 μm に設定します。多孔膜が見えるように明視野露光を調整します。dsRed(561 nm)およびGFP(488 nm)チャンネルの励起レーザーをオンにし、各チャンネルがピクセルを露出し過ぎることなく見えるように蛍光レーザーのパワーとカットオフを調整します。
  6. ステップオーバー時にすべてのフィールドがフォーカスされていることを確認します。その場合は、イメージの出力ファイル名(001.nd2)を入力し、実験を開始して3D共焦点イメージを自動的にキャプチャします。

7. 共焦点断層撮影による腫瘍微小環境の測定

  1. 共焦点断層撮影法を使用して、デバイス内の個々の細胞と腫瘍の微小環境を記述する一連のメトリックと測定値を推定します。共焦点断層分析(図2)は、共焦点zスタックを細胞の3次元表現に変換する。Jupyter ノートブック/ラボ環境内でカスタムの Python スクリプトを使用して、平面は、膜30のような血液脳関門を形成する細胞の層に一致します。最後に、がん細胞集団の表向き測定を行う(表1)。
    1. この解析は、実験の最後または時間経過に合うように実行します。参照されているソフトウェアガイドに従ってPythonと適切なライブラリをインストールし、コマンド「conda activate」を実行し、続いて「jupyterラボ」を実行して、Windowsコマンドプロンプトからソフトウェアを開きます。Jupyter 環境は、既定のブラウザー内に読み込まれます。
    2. Jupyter ファイル エクスプローラで、ジュピター ノートブック "contom.ipynb" をダブルクリックして開きます。タイトルの下のセルを実行 する インポート ライブラリ、カスタム クラス/関数、 ノートブックのセルをクリックし、再生ボタンをクリックしてノートブックを設定します。以下のすべてのノートブックセルは、同じアプローチを使用して実行されます。ここでノートブック"cell"は、Jupyter ノートブック内の Python コードのブロックを指します。
  2. データを準備します。このアルゴリズムは、視覚化ツールキット (VTK) を使用して、z スタックおよび 3 次元データ17を操作および表示します。
    1. 提供されたを置く.ジュピター ノートブックと同じウィンドウ フォルダー内の XLSX ファイル (「実験トラッカー.xlsx」)このファイルは、実験を追跡し、Jupyter ノートブックとのインターフェイスを使用します。セクション 6 の ND2 ファイルを、Jupyter ノートブックの場所の下にある"\\Experiment_XXX\Confocal\"というサブフォルダに配置します。新しいフォルダに割り当てられた数値IDに「XXX」を調整することで、実験フォルダを追加できます。
    2. 最初の実験フォルダに「Experiment_001」とND2ファイル「001.nd2」というラベルを付けます。まず、ND2イメージングファイルを、カラーチャンネルで区切られたステッチマルチイメージTIFFファイルに変換します。これは、Save_tiff_from_ND2() 関数がコメントなし30で、「コンフォーカル z スタックをメモリに読み込む」というタイトルの下にあるノートブックセルを実行して行います。ND2ファイルは、ニコンからの独自のイメージング形式であるため、オープンソースソフトウェアと互換性のある形式に変換する必要があります。
      メモ:TIFF(タグイメージファイル形式)は、ユビキタスで、16ビット互換で、VTKに簡単にインポートでき、複数の画像をZスタックイメージに適した単一のファイルに保存できるため使用されます。ノートセルを実行すると、ND2ファイルから画像を読み込み、色とXYZ位置の情報を抽出し、事前に決定された構造に従って、その画像をnumpy配列に格納します。次に、Python ライブラリの tiff ファイルを使用して、配列を TIFF ファイルとして保存します。
  3. イメージングデータを3Dモデルに変換
    1. 3D レンダリングを使用して TIFF ファイルを VTK (vtkTIFFReader) にインポートしてセルを視覚化します (図 2)。画像内のセルの色に基づいてしきい値を選択します。明確にするために、VTK オブジェクトは空間 (ボリューム) のピクセル (X、Y、Z) のブロックを表しますが、特定のピクセル (緑または赤) だけがセルを表し、残りは背景またはノイズ (黒) です。
    2. したがって、バックグラウンドを除去するボリュームに不透明度フィルタを設定し、蛍光が残っているものは細胞だけであることを確認する。これは、jupyter ノートブックセルを使用して行います, Channel_alpha値変数を調整することによって、 各顕微鏡チャンネルの不透明度 値を変更します (すなわち、GFP_alpha)。「3D レンダリングを表示」というタイトルのノートブックセルを使用して効果 を視覚化し、しきい値が正しく設定されていることを確認します。
    3. 次の手順で使用するスプレッドシートに不透明度の値を保存します。ボリューム データを個々の 3D オブジェクトに変換し、それぞれマーチング キューブ31と呼ばれる手法を使用して、イメージ内のセルを表します。このアルゴリズムは、ボクセルの3次元の離散スカラーフィールドから等値面のポリゴンメッシュを抽出します。
    4. マーチング キューブ アルゴリズムで不透明度の値を使用して、各セルを背景から分離します。ボ クセル画像を三角形メッシュに変換し、ノート型に VTK ファイルとして保存 して、各顕微鏡チャネルで識別されるすべての蛍光セルに対してこの手順を完了します。
  4. 平面を膜に取り付ける
    1. 最初に細胞の重心を見つけることによって、内皮障壁に平面を適合させます (ノートブックセル: RFP チャネルを解析 します (内皮バリア)。ボリューム内のリスト メッシュを反復処理し、VTK から PolyDataConnectivityFilter を使用して接続されていない領域を抽出します。各メッシュの重心を計算し、大きすぎるメッシュまたは小さすぎるメッシュの重心フィルタリングのリストに測定を追加します(<50,>100000ボクセル)。
    2. 誤差の最小化法を用いて内皮細胞の重心リストに平面を適合させる(ノートセル:RFP重心(内皮バリア)に平面を合わせる)(図2、図3)32。32平面と中心心をプロットして平面の適合を検査し、必要に応じて手動で調整します(シータ、ベータ、zを使用して)、RFPの中心と平面フィットを視覚化というタイトルのノートブックセルを実行します。
    3. 平面が正しく取り付けられた後、平面の法線を実験トラッカー ファイル に保存します。XLSX ファイルは、将来の使用のために使用します。
  5. 次の記述子について、個々の癌細胞の記述的特徴を分析する (表 1)。
    注: 解析を実行するコンピュータが遅れている場合は、高パフォーマンス コンピューティングによる高スループット分析がオプションです。このアルゴリズムは、少数のセルを分析する標準のラップトップでは有用ですが、VTKは多数の個別オブジェクト(>1000)に適していません。したがって、高性能コンピューティングクラスター上で機能するために適合アルゴリズムを使用することは任意です。これにより、多くの細胞を用いた実験の迅速な分析が可能になります(図2)。7.5のすべては、 触視記述子のための残りの顕微鏡チャンネルを分析 し 、Experiment_tracker情報を読み取り、存在するチャネルを分析するというタイトルのノートブックセルを実行することによって達成されます。
    1. がん細胞の外挿を測定する:内皮層を平面で特徴付けた後、膜を通過した各癌細胞の体積を測定する。各セル(Boolean)をクリップして、膜の下のメッシュが保持され、膜の上の部分が除去されるようにします33.次に、開いたメッシュを閉じます (vtkFillHoles)。
      1. クリップされたメッシュの法線と新しい中心を再計算します。分析のために、クリップされた各癌細胞の体積と位置を測定します。ボリュームは、各セルのメッシュフィルのボクセル数と同じです。内皮面と各癌細胞の位置との間の距離を計算する。
    2. 細胞表現型を測定する:その形状、体積および位置を因数化することによって、各癌細胞の形態を計算する。
  6. 測定値を検証し、スプレッドシートまたはプロットに保存します。「図心が正確に測定されたことを確認する」というタイトルのノートブックセルを実行すると、セルタイプ別に画像ボリュームの上に識別された図心が表示されます。すべての実験が完了した後、指定された実験 ID を置き換える変数の変数のファイルの単一の Data.XLSX ファイルをエクスポートするというタイトルのノートブックセルに ID に含まれる実験を入力して、完全なデータセットを単一のスプレッドシートファイルとしてエクスポートします。完成したデータセットを確認する場合は、「距離の除行ストリッププロット」というタイトルのノートブックセルを使用してプロットします。プロットはノートブック環境に表示され、ファイルに保存されます。

8. 人工知能を用いて関連する特性を分析する

注: 人工知能アルゴリズムを使用して、転移性の表皮特性を特定します。

  1. 図 5と補足ファイル 3に示すスキームに従って、オレンジを使用して二項分類を実行します。「conda activate」と入力し、「python -m Orange.canvas」と入力して、2番目のWindowsコマンドプロンプトからオレンジを起動し、プロンプトから「新規」をクリックします。オレンジはドラッグアンドドロップベースのソフトウェアなので、左のメニューからキャンバスに各項目をドラッグして、補足ファイル3に一致するように機能を配置します。その後、ファイルアイコンをダブルクリックし、データ.XLSXファイルを選択します。
  2. 「行の選択」アイコンを使用して、データをフィルタリングして、ブール演算に失敗したものとして定義された、または既知の境界の外にパラメトリック変数値を与えたものとして定義された、不適切な測定値を削除します。アイコンをダブルクリックし、"球面の範囲は 0 ~ 1" などのフィルタに対応する条件を設定します。8.2.1、8.2.2、8.2.3 の条件を作成します。
    1. フィルター距離は-100から200 μmの範囲に射出された測定を余分にする。
    2. セル形状の球形の測定を 0 ~ 1 の範囲にフィルターします。
    3. がん細胞の体積測定を0~2000ボクセルに絞り込みます。
    4. すべてのパラメータ変数を使用して(表1)脳転移性MDA-MB-231-BR-GFPと非脳転移性MDA-MB-231-GFPを分類します。キャンバスから [列の選択 ]アイコンをダブルクリックします。 [>] ボタンを使用して 、使用可能な変数 を [フィーチャ]、[ ターゲット変数]、または [メタ属性]に移動します。 ターゲット変数 である必要がある唯一の変数は、データ・セット内のセルが、転移 (1) と見なされる (0) かどうかを定義する「転移型ラベル」です。実験変数はメタ 属性 セクションに配置できます。
  3. データをトレーニングにサンプリングする (80%)とテストセット(20%)。[データ サンプラー ] アイコンをダブルクリックし、[データの固定比率]の [サンプリングの種類] を選択します。各モデル/分類器に対して 10 の折り目を使用してトレーニング セットを階層化し、クロス検証します。[テストとスコア] をダブルクリックし、[折り目数: 10 に設定し、階層化] をオンにして交差検証を選択します。ターゲットクラスを1に設定します。
  4. この方法では、データに対して堅牢なニューラル ネットワークとランダム フォレスト学習アルゴリズムを使用します。[ランダム フォレスト] アイコンで、[樹木数] を 50 に選択し、他のオプションは選択しません。ニューラルネットワークアイコン内で、隠しレイr:100、活性化:ReLu、ソルバー:アダム、アルファ:0.0001、および最大反復:200を選択します。 100ただし、これらの設定は、研究によって大きく異なり、アプリケーションの前によく理解する必要があります。
  5. キャンバスを設定した後、 ファイル から サンプルデータ まで各アイコンをダブルクリックし、 適用 または データの送信を押します。 [テストとスコア ] をダブルクリックすると、アルゴリズムを使用したモデルの開発にトレーニング データが使用されます。機械学習モデルをトレーニングした後、 テストとスコアを 再度開き、[ テストデータでテスト ]を選択し、ポップアップウィンドウを閉じて、0から1までの脳転移の確率に従ってチップ内の細胞を分類してモデルのパフォーマンスをスコアリングします。
  6. 機械学習モデルのパフォーマンスをファイルに保存します (表 2)。ROCのカーブ(AUC)の下の領域、精度、およびF1スコアを含めます。個別の転移インデックスと分類確率を含む 2 番目のファイルを保存します。 [保存 ] アイコンをダブルクリックし、[ 名前を付けて保存 ] をクリックして、分類の確率をファイルに書き込みます。同様に、ROC 曲線は ROC 解析 アイコンをダブルクリックして表示でき、モデルのパフォーマンスは 「混乱行列 」アイコンをダブルクリックして計算できます。

結果

この手法を用いて、異なる蛍光タンパク質または色素で標識された細胞タイプを分析しました。hCMEC/D3-DsRedおよび非蛍光アストロサイトを配合したμmBBNチップを用いて、このアプローチの使用を実証します。脳内血管内皮細胞を多孔膜(5μmトラックエッチング細孔)に播種し、5%CO2下で37°Cでインキュベーター34に入れた。23日後に、内視鏡検査を介して内皮層の合流性?...

ディスカッション

内皮バリアを介して脳組織へのがん細胞の外挿や移動を測定するために、臨床画像解析に頻繁に利用されるツールを適応させる新しい方法を開発し、発表しました。このアプローチは、生体内測定とインビトロ測定の両方に役立ちます。脳血管系を再現する3Dマイクロ流体システムでの使用を実証しました。がん細胞の測定は、この技術を使用して、外挿距離、体積、球面性、体積による外?...

開示事項

申告する開示はありません。

謝辞

国立がん研究所のSteeg Labに対し、MDA-MB-231-BR-GFP細胞の寛大な寄付に感謝します。共焦点顕微鏡は、ミシガン大学バイオインターフェース研究所(BI)で行われました。フローサイトメトリーは、ミシガン大学フローサイトメトリーコアで行われました。ウイルスベクターは、ミシガン大学ベクターコアによって作成されました.また、これらのデータの統計分析におけるガイダンスに対するケリー・キッドウェルに感謝します。

資金：

C.R.O.は、NIH T-32トレーニングフェローシップ(T32CA009676)と1R21CA245597-01によって部分的にサポートされました。T.M.W.は、1R21CA245597-01と国立衛生研究所の国立トランスレーショナルサイエンス推進センターによって部分的にサポートされました。材料と特性評価のための資金は、賞番号1R21CA245597-01、P30CA046592、5T32CA009676-23、CA196018、AI116482、METAvivor財団、乳癌研究財団の下で国立衛生研究所によって提供されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTA with phenol redThermo Fisher Scientific25200056
1.5 mm biopsy punch with plungerIntegra LifeSciences Corporation33-31A-P/25
10x MEMThermo Fisher Scientific11430030
150 mm petri dishesFisher ScientificFB0875714
1x DPBS, without Ca and MgThermo Fisher Scientific14190144
200uL pipette tipFisher Scientific02-707-411
4 inch silicon waferUniversity Wafer452
48 mm wide packing tapeFisher Scientific19-072-097
50 x 75 mm glass slideFisher Scientific12-550C
A1 confocal microscopeNikon
acetoneFisher ScientificA9-20
antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin)Gibco15240062
box cutter bladeFisher ScientificNC1721575
dissection scissorsFisher Scientific08-951-5
DMEM with 4.5 g/L glucoseThermo Fisher Scientific11960-044
double sided tapeFisher ScientificNC0879005
EGM-2LonzaCC-3162
Fetal Bovine Serum, Heat inactivatedCorningMT35011CV
Fiji softwareImageJ
glass vialFisher Scientific03-341-25D
glutamaxThermo Fisher Scientific35050061
hCMEC/D3EMD MilliporeSCC066
Jupyter notebookAnaconda
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030081
Matrigel - growth factor reduced with phenol redCorningCB-40230A
MDA-MB-231ATCCHTB-26
MDA-MB-231-BR-GFPDr. Patricia Steeg, NIH
N-2 growth supplementThermo Fisher Scientific17502048
normal human astrocytes (NHA)LonzaCC-2565
Orange softwareUniversity of Ljubljana
Pasteur pipetteFisher Scientific13-711-9AM
Photolithography masksPhotosciences Incorporated
pLL3.7-dsRedUniversity of Michigan Vector Core
pLL-EV-GFPUniversity of Michigan Vector Core
pLOX-TERT-iresTKAddgene12245
pMD2.GAddgene12259
polycarbonate membrane, 5um pore sizeMilliporeTMTP04700
psPAX2Addgene12260
PureCol, 3 mg/mLAdvanced Biomatrix5005Type I bovine collagen
sodium bicarbonateThermo Fisher Scientific25080094
sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360070
Solo cupFisher ScientificNC1416545
SU-8 2075MicroChem CorporationY111074 0500L1GL
SU8 developerMicroChem CorporationY020100 4000L1PE
Sylgard 184Ellsworth Adhesive CompanyNC0162601
TolueneSigma-Aldrich179965-1L
Tricholoro perfluoro octyl silaneSigma-Aldrich448931-10G

参考文献

  1. Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
  2. Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
  3. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
  4. Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
  5. Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
  6. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
  7. Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
  8. Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564 (2014).
  9. Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456 (2019).
  10. Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190 (2016).
  11. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  12. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  13. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
  14. Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
  15. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
  17. Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. . The Visualization Toolkit. 4th edn. , (2006).
  18. Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
  19. Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759 (2014).
  20. Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
  21. Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
  22. Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23 (2019).
  23. Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
  24. Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
  25. Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705 (2018).
  26. Badilescu, S., Packirisamy, M. . BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , (2011).
  27. Liu, C. . Foundations of MEMS. 2nd edn. , (2012).
  28. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  29. Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
  30. Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , (2020).
  31. Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
  32. Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. . Applied regression analysis and other multivariable methods. , (1978).
  33. Berg, M. d. . Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , (2000).
  34. Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
  35. Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. Cancer Research. 40 (9), 3118-3129 (1980).
  36. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33 (2013).
  37. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  38. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16 (2013).
  39. Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259 (2018).
  40. Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
  41. Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
  42. Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).

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