Quantificando o microambique do tumor metastático cerebral usando um modelo 3D de chip de órgão, aprendizado de máquina e tomografia confocal

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para preparar e esculpir uma barreira cerebral sanguínea microambienta tumoral metastático e, em seguida, quantificar seu estado usando imagens confocal e inteligência artificial (machine learning).

Resumo

Metástases cerebrais são as lesões de câncer mais letais; 10-30% de todos os cânceres metástases no cérebro, com uma sobrevida mediana de apenas ~5-20 meses, dependendo do tipo de câncer. Para reduzir a carga do tumor metastático cerebral, as lacunas no conhecimento básico e translacional precisam ser abordadas. Os principais desafios incluem a escassez de modelos pré-clínicos reprodutíveis e ferramentas associadas. Modelos tridimensionais de metástase cerebral podem produzir os dados moleculares e fenotípicos relevantes usados para atender a essas necessidades quando combinados com ferramentas de análise dedicadas. Além disso, em comparação com os modelos de murina, modelos de células tumorais de pacientes que atravessam a barreira cerebral do sangue no microambiente cerebral geram resultados rapidamente e são mais interpretáveis com métodos quantitativos, assim, favoráveis a testes de alto rendimento. Aqui descrevemos e demonstramos o uso de uma nova plataforma de nicho cerebral microfluido 3D (μmBBN), onde múltiplos elementos do nicho podem ser cultivados por um longo período (vários dias), fluorescentemente imagens por microscopia confocal, e as imagens reconstruídas usando uma técnica inovadora de tomografia confocal; todos visavam compreender o desenvolvimento da micro metástase e mudanças no microambiente tumoral (TME) de forma repetível e quantitativa. Demonstramos como fabricar, sementes, imagem e analisar as células cancerígenas e componentes celulares e humorais TME, utilizando essa plataforma. Além disso, mostramos como a inteligência artificial (IA) é usada para identificar as diferenças fenotípicas intrínsecas das células cancerosas que são capazes de transitar através de um modelo μmBBN e atribuir-lhes um índice objetivo de potencial metastático cerebral. Os conjuntos de dados gerados por esse método podem ser utilizados para responder a questões básicas e translacionais sobre metástase, a eficácia das estratégias terapêuticas e o papel do TME em ambos.

Introdução

Metástases cerebrais são as lesões de câncer mais letais; 10-30% de todos os cânceres metástases no cérebro, com uma sobrevida mediana de apenas ~5-20 meses, dependendo do câncer tipo^1,2. Uma questão principal que surge ao estudar a metástase do câncer é como sub clones migram do ambiente humorístico da corrente sanguínea para um órgão como o cérebro^3,,4. Esta questão levou a muitas variações de ensaios migratórios, de invasão e extravasação. Todos esses métodos compartilham o passo crítico de contagem ou medição de propriedades de células que se movem de um local para outro em resposta a um estímulo. A maioria dos ensaios migratórios prontamente disponíveis são usados para estudar a migração bidimensional (2D) de células cancerígenas. Estes elucidaram uma riqueza de conhecimento; no entanto, eles não recapitulam a natureza tridimensional do sistema in vivo que outros métodos podem fornecer⁵. Portanto, é necessário estudar o microambiente tumoral (TME) em sistemas tridimensionais (3D), mas as abordagens de análise disponíveis para estruturas 3D são limitadas e muitas vezes inconsistentes.

Uma das ferramentas 3D mais populares é uma câmara de Boyden que consiste em uma membrana suspensa no fundo de um poço, separando duas regiões distintas. Boyden introduziu o ensaio para estudar leucócito chemotaxis⁴. As regiões inferiores podem ser variadas por química ou outras médias^6,7 para induzir células na região superior a migrar para a região inferior. A abordagem mais comum para quantificar o número de células que migraram é liberar as células da parte inferior da membrana usando uma solução tampão, lise-las e, em seguida, contá-las com base na quantidade de conteúdo de DNA na solução⁷. Essa abordagem indireta é propensa a erros do operador devido à variabilidade técnica e o procedimento destrói informações sobre o fenótipo do câncer e o microambiental. As variações do ensaio da câmara de Boyden envolvem a fixação de células migratórias que permanecem na membrana, mas apenas fornece uma contagem de células que não são mais viáveis para o estudo continuado^6,,8,9.

Devido às limitações da câmara de Boyden e ao crescimento das inovações na comunidade microfluidica, foram desenvolvidos chips de ensaio migratório que observam o movimento das células em resposta a um estímulo em uma direção em vez de três^10,,11,12. Esses ensaios migratórios facilitam o controle sobre fatores como fluxo ou separação celular única^13,14 que permitem melhor interpretação dos resultados; no entanto, seu formato 2D inevitavelmente perde algumas informações dinâmicas. Estudos recentes têm focado na extravasão (ou seja, o movimento das células de circulação para um tecido, como a barreira cerebral do sangue) em um ambiente 3D^14,15. A distância de extravasação no tecido e no comportamento de sondagem que ocorre na barreira/membrana celular é mais refinada do que as medidas obtidas usando a câmara de Boyden ou um dispositivo de migração microfluida 2D¹⁶. Assim, dispositivos que permitem imagens adequadas e análise de extravasação 3D são fundamentais para capturar essas medidas sofisticadas, mas faltam na literatura.

Independente dos ensaios migratórios, técnicas robustas de imagem foram desenvolvidas para ressonância magnética (RM) e tomografia que são capazes de identificar e reconstruir com precisão tecido no espaço 3D^17,18. Essas técnicas adquirem imagens em pilhas de z e segmentos da imagem com base nas propriedades do tecido e, em seguida, convertem as imagens segmentadas em malhas tridimensionais^19,,20,,21. Isso permite que os médicos visualizem em órgãos, ossos e vasos individuais em 3D para auxiliar no planejamento cirúrgico ou auxiliar no diagnóstico de câncer ou doença cardíaca^22,23. Aqui, mostraremos que essas abordagens podem ser adaptadas para uso em espécimes microscópicos e dispositivos de extravasação 3D.

Para isso, desenvolvemos a inovadora técnica de tomografia confocal, aqui apresentada, que proporciona flexibilidade para estudar a extravasão das células tumorais através de uma membrana, adaptando ferramentas de tomografia existentes. Essa abordagem permite o estudo de toda a gama de comportamentos de células cancerosas à medida que interagem com uma barreira celular, como uma camada celular endotelial. Células cancerígenas apresentam comportamentos de sondagem; alguns podem invadir, mas permanecem perto da membrana, enquanto outros atravessam a barreira prontamente. Esta técnica é capaz de produzir informações sobre o fenótipo da célula em todas as dimensões²⁴. Usar essa abordagem para estudar o TME é relativamente barato, fácil de interpretar e reprodutível, quando comparado com modelos in vivo murine mais complexos. A metodologia apresentada deve fornecer uma base forte para o estudo de muitos tipos de tumores e microambi ambientes, adaptando a região estromal.

Descrevemos e demonstramos o uso de uma plataforma 3D microfluidicaFigure 1do cérebro do sangue (μmBBN) onde elementos críticos da barreira e do nicho (células endoteliais microvasculares cerebrais e astrócitos) podem ser cultivados por um período prolongado (aproximadamente até 9 dias), fluorescentemente imagens por microscopia confocal, e as imagens reconstruídas usando nossa técnica de tomografia confoccal (Figura 2); todos visavam compreender o desenvolvimento da micro metástase e mudanças no microambiente tumoral de forma repetível e quantitativa. A interface da barreira cerebral sanguínea com o nicho cerebral é composta de células endoteliais microvasculares cerebrais que são reforçadas por membrana do porão, pés de astrócito e pericitos²⁵. Nós nos concentramos seletivamente nos componentes astrócitos e endoteliais dada a sua importância na formação e regulação da barreira cerebral do sangue. Demonstramos como fabricar, sementes, imagem e analisar as células cancerígenas e componentes celulares e humorísticos do tumor, utilizando essa plataforma. Finalmente, mostramos como o aprendizado de máquina pode ser usado para identificar as diferenças fenotípicas intrínsecas das células cancerosas capazes de transitar através de um modelo μmBBN e atribuir-lhes um índice objetivo de potencial metastático cerebral²⁴. Os conjuntos de dados gerados por este método podem ser usados para responder perguntas básicas e translacionais sobre metástase, estratégias terapêuticas e o papel do TME em ambos.

Protocolo

1. Prepare o molde do nicho da barreira cerebral do sangue

NOTA: O dispositivo de cultivo usado nesta plataforma é um andaime baseado em PDMS que construímos um nicho de barreira cerebral de sangue celular. É feito de duas partes separadas por uma membrana porosa. Para preparar o nicho da barreira cerebral sanguínea são necessários dois moldes SU-8 feitos com fotolitografia^26,27. O protocolo será descrito para o molde de 100 μm de espessura primeiro e, em seguida, as notas serão dadas para o molde de 200 μm de espessura.

1. Para preparar o molde, limpe um wafer de silício de 4" usando acetona com uma garrafa de espremer e depois seque-o com uma arma de nitrogênio.
   1. Asse o wafer de silício em uma placa de aquecimento por 10 minutos a 200 °C para remover todo o solvente residual.
   2. Por sua vez, centrale o wafer de silício sobre o mandril de um reveste de giro e dispense 1 mL de SU8-2075 para o molde superior. Gire para 5 s a 500 rpm (aceleração 300 rpm/s) para dispersar o fotoresist e depois 30 s a 2200 rpm (aceleração 300 rpm/s) para obter um revestimento SU-8 de 100 μm de espessura. A otimização pode ser necessária para alcançar a espessura especificada.
2. Leve a assada a bolacha em uma placa quente a 65 °C por 2 min e depois imediatamente a 98 °C por 20 min.
3. Coloque o wafer em uma lâmpada fotolitografia e posicione a máscara centrada no wafer de acordo com os procedimentos padrão. Exponha os wafers revestidos SU-8 com um brilho de 230 mJ/cm² de UVB (360 nm ± 10 nm). Um experimento de matriz de exposição pode ser realizado para determinar a dosagem ideal. Os desenhos da máscara estão disponíveis no Arquivo Suplementar 1.
4. Realize um cozimento pós-exposição a 65 °C por 2 min e, em seguida, imediatamente a 98 °C por 10 min para melhorar a adesão. Esfrie o wafer a 50 °C.
5. Remova a resistência não exposta usando o desenvolvedor de fotos SU-8. Enxágüe o wafer no desenvolvedor por 5 minutos em um banho e, em seguida, use uma garrafa de spray cheia com desenvolvedor SU-8 em um capô químico para agitar e remover SU-8 restante. Um microscópio 4x pode ser usado para observar se todo o SU-8 nãocurado foi removido. Uma linha branca nas bordas das características fotoresististas indica que o SU-8 não foi totalmente removido.
6. Faça um último cozimento duro em um forno a 110 °C por 60 min.
7. Siga o mesmo procedimento para o molde de 200 μm de espessura usando o SU-8 2075, mas ajuste o protocolo para o seguinte:
   1. Ajuste do revestimento girador: Gire por 5 s a 500 rpm (aceleração 300 rpm/s) para dispersar o fotoresist e depois 30 s a 1300 RPM (aceleração 300 rpm/s) para obter um revestimento de 200 μm de espessura.
   2. Leve ao forno a 65 °C por 2 min, depois a 98 °C por 40 min.
   3. Tempo de exposição de 340 mJ/cm².
   4. Pós-exposição ao forno: 2 min a 65 °C e depois 98 °C por 15 min.
8. Finalmente, silanize cada wafer colocando-os em uma câmara de vácuo dentro de um capô químico com um recipiente plástico no qual foram colocadas 3 gotas (~150 μL) de solução de silanização (Silane octill de trichloro perfluoro) foram colocadas. Puxe um vácuo e deixe durante a noite para permitir que o vapor cubra o wafer. Esta etapa reduz a adesão entre o SU-8 e o PDMS, aumentando a vida útil do molde.
   ATENÇÃO: O silano de silano de tricloro perfluoroctyl deve ser sempre manuseado no capô da fumaça e mantido longe das fontes de água.
9. Coloque moldes individuais de wafer em placas de Petri de 150 mm usando duas tiras de fita dupla face. Certifique-se de que os wafers são planos. Uma alternativa é fabricar um molde de alumínio dentro do qual o wafer pode ser colocado. Como o molde de alumínio é fechado, ele produzirá moldes com uma espessura uniforme, enquanto o método da placa de Petri é sensível à inclinação da superfície é colocado. O achatamento melhorado dos moldes PDMS reduz o tempo de imagem confocal a jusante.

2. Forme e monte o dispositivo de barreira cerebral sanguínea PDMS (BBB)

1. Misture 75 g de PDMS a uma proporção de 1:10 (Crosslinker:Base) em peso em um copo de plástico.
2. Despeje o PDMS sobre os moldes (1 mm de espessura para o molde de 200 μm de espessura e 4 mm para o molde de 100 μm de espessura) e degas em um desiccador de vácuo por uma hora ou até que todas as bolhas tenham sido removidas. Coloque em forno de 65 °C durante a noite. A espessura de 1 mm pode ser ajustada com base na distância de trabalho do objetivo de 10x no microscópio confocal.
3. Depois que o PDMS tiver curado use uma lâmina para cortar suavemente contra o wafer através do PDMS ao redor das bordas. Retire o PDMS e use uma lâmina para cortar ao longo das guias retangulares e um soco de biópsia de 1,5 mm para abrir as entradas e tomadas do dispositivo. Cubra as peças do dispositivo PDMS com fita adesiva de 48 mm de largura para mantê-la limpa de poeira e detritos.
4. Em seguida, use uma tesoura de dissecção para cortar um retângulo de 5 mm x 50 mm de membrana de policarbonato com poros de 5 μm e armazená-lo dentro de uma placa de Petri para uso posterior.
5. Junte o seguinte: 200 μL de ponta de pipeta, 2 mL de 1:10 PDMS misturado com tolueno em uma proporção de 2:3 em peso em um frasco de vidro, uma pipeta Pasteur com uma lâmpada de aperto, as partes superiores e inferiores PDMS preparadas, a membrana, três lâminas de vidro de 50 mm x 75 mm e transportar tudo para um revestimento de spiner. As seguintes etapas para montagem e semeadura celular do dispositivo são retratadas na Figura 1.
6. Use a pipeta Pasteur para transferir 1 mL de solução de cola PDMS:toluene em uma lâmina de vidro de 50 mm x 75 mm no mandril do revestimento de giro. Gire por 5 segundos a 100 rpm (aceleração 300 rpm/s) e 30 segundos a 2000 rpm (aceleração de 300 rpm/s).
7. Coloque o slide sobre uma mesa e cubra-o com uma câmara superior PDMS e uma câmara inferior para que o PDMS fique com características moldadas para entrar em contato com o slide e a cola seja transferida para a face PDMS, delineando o perímetro de todas as características.
8. Vire a câmara superior do PDMS para outro slide com o revestimento de cola voltado para cima e coloque cuidadosamente a membrana através do dispositivo entre as entradas e as tomadas. Coloque a ponta de 200 μL na solução de cola PDMS:toluene até que tenha um pouco perverso na ponta. Toque na ponta entre cada entrada e saída para colocar uma pequena gota perto da borda da membrana onde entra em contato com o PDMS.
9. Remova a outra metade do dispositivo e coloque-a com o revestimento da cola para baixo enquanto alinha as entradas e tomadas nas duas partes.
10. Coloque o dispositivo montado em um forno a 37 °C durante a noite para curar a cola. Transfira para um pote de sino de vácuo com dessecante e deixe desidratar por dois dias. Este é um passo crucial para permitir que o Tolueno evapore e melhorar a consistência da semeadura do dispositivo regulando o vapor de água absorvido no ar de laboratório.

3. Semente o microambi ambiente cerebral no dispositivo

1. Cultura celular e reagentes: Antes de iniciar este protocolo, obtenha os seguintes reagentes e células. Cultivar todas as linhas celulares em uma incubadora fixada a 37 °C em 5% de CO₂.
   1. Manter as células de células de câncer de mama triplo-negativos humanos MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) e MDA-MB-231-BR-GFP (obtidas de Patricia Steeg, PhD) em DMEM com 4,5 g/L de glicose, suplementada com 2 mM L-glutamina, 10% FBS e 1x antibiótico-antimycotic. Crie células fluorescentes MDA-MB-231-GFP transduzindo célulaS MDA-MB-231 com lentivírus pLL-EV-GFP vazio. Classifique a população transduzida de GFP⁺ usando a triagem celular ativada por fluorescência (FACS) antes da experimentação.
   2. Manter as células endoteliais microvasculares do cérebro humano hCMEC/D3 em meio EGM-2. Crie células fluorescentes hCMEC/D3-DsRed transduzindo hCMEC/D3 com lentivírus de vetor vazio pLL-3.7-dsRed. Remova todas as células não transduzidas e não fluorescentes da cultura usando FACS antes do uso experimental.
   3. Manter osstrócitos humanos normais (NHA) em DMEM suplementados com 4,5 g/L de glicose, 10% FBS, 2 mM Glutamax, 1 mM piruvato de sódio, 1x suplemento de crescimento N-2 e 1x antibiótico-antimíctico. Imortalize os astrócitos transdundo o vetor lentiviral pLOX-TERT-IResTK (Addgene 12245). Crie o vetor usando psPAX2 plasmídeo plasmídeo plasmídeo pMD2.G (Addgene 12260 e 12259).
2. Remova um dispositivo μmBBN do desiccador de vácuo e coloque em uma superfície de metal ou papel (ou seja, fita) com as entradas viradas para baixo e coloque-o em uma câmara de plasma. Coloque também um deslizamento de vidro de 50 mm x 75 mm na câmara de plasma. Puxe um vácuo e depois trate com plasma a 80 W por 30 s.
3. Remova rapidamente o slide de vidro e o dispositivo da câmara de plasma e coloque o dispositivo com as entradas voltadas para o escorregador de vidro alinhados usando um guia(Arquivo Suplementar 2). Isso criará um vínculo permanente entre o PDMS e o slide de vidro e não pode ser re-posicionado.
4. Em seguida, corte as pontas de 16, 200 pontas de pipeta μL, 2 mm da ponta. Insira as pontas da pipeta em todas as entradas e tomadas. O dispositivo pode ser colocado de volta no desiccador de vácuo neste momento se não estiver pronto para semear as células.
5. Coloque o dispositivo de volta na câmara de plasma e trate com plasma por 8 min a 200 W. Depois que o dispositivo tiver resfriado (5 minutos) do tratamento de plasma colocá-lo dentro de um recipiente secundário estéril, como uma caixa de ponta de pipeta transparente. Realize o próximo passo dentro de ~15 min ou a eficácia do tratamento plasmático pode ser reduzida levando ao entupimento.
6. Vários dias antes da cultura de experimentos, placas de Petri de 1 x 10⁶ células endoteliais (hCMEC/D3-DsRed) e 1 x 10⁶ astrócitos (NHA). Enquanto o dispositivo está passando pelo tratamento de plasma de 8 min, prepare uma solução de colágeno composta por 0,5 mL de 3 mg/mL PureCol tipo I colágeno bovino com 64 μL de 0,8 M NaHCO₃ e 20 μL de 10x de alta glicose (250 mM) MEM. Suspenda 5,0 x 10⁵ células NHA na solução de colágeno. Mantenha a solução no gelo enquanto não estiver em uso.
7. Transfira 120 μL da solução de colágeno/astrócito/microglia para o dispositivo através da ponta da pipeta para a câmara inferior(Figura 1 Setas vermelhas). Deixe a solução atravessar a câmara na ponta oposta da pipeta. Depois de todos os quatro canais do dispositivo terem sido preenchidos coloque o chip na incubadora de CO₂ a 37 °C e 5% de CO₂ por 1h ou até que o colágeno esteja definido.
8. Após os conjuntos de colágeno, encha todas as pontas de pipeta alimentando a câmara inferior com uma mistura de mídia completa. Para chips contendo células endoteliais e astrócitos, é utilizada uma mistura de mídia endotelial:astrócito.
9. Cubra a câmara superior com 2% de fator de crescimento reduzido Matrigel em mídia endotelial completa usando a ponta de pipeta de câmara superior(Figura 1 Setas azuis) e coloque na incubadora por 1 hora.
10. Enxágüe a câmara superior com a mistura de mídia indicada e alternou qual dica é semeada com células endoteliais(Figura 1 Flechas Verdes). Suspenda 1 x 10⁶ células endoteliais em 1 mL de mídia endotelial e sementes 30 μL a cada 15 minutos em pontas alternadas de câmara superior para cobertura uniforme. Células endoteliais de sementes em cada ponta de câmara superior duas vezes, para um total de 4 vezes por câmara.
11. Após a semeadura final das células endoteliais, preencha todas as dicas com a mistura de mídia e coloque o dispositivo na incubadora a 37 °C e 5% de CO_2,trocando de mídia em ambas as câmaras a cada 12 h.

4. Monitore a progressão da formação da camada endotelial

1. A cobertura completa do canal pela camada endotelial é observada após 3 dias. Use um dos dois métodos para monitorar a cobertura da barreira endotelial: Fluorescência ou TEER. a fluorescência hCMEC/D3-DsRed e de acordo com % de cobertura em toda a área do canal podem ser quantificadas usando ImageJ.
   1. Abra o arquivo TIFF no representante ImageJ da barreira hCMEC/D3-DsRed. No software ImageJ, clique em Arquivo > Abra para selecionar o arquivo.
   2. Mescle todas as camadas Z da imagem usando a intensidade máxima seguindo esses comandos e opções principais: Imagem > Stacks > Z project > Todas as fatias Z, intensidade máxima.
   3. Realize um limiar de cor que seja o mesmo em todos os chips microfluidos avaliados usando este método. Para o estudo apresentado, empregamos um limite de 450. Use o menu limiar no ImageJ em: Imagem > Ajuste > Limiar.
   4. Definir as medições a serem registradas usando os seguintes comandos e opções: Analisar > Definir Medidas > Limite ao limiar, Fração de Área.
   5. Selecione uma região representativa do canal microfluido para medir desenhando uma caixa. A ferramenta caixa está localizada no menu principal do ImageJ. Medir 3 réplicas técnicas posicionadas no início, meio e extremidade de cada canal microfluido usando o mesmo tamanho da caixa.
   6. Analise cada canal e regise a fração da área, representando a % cobertura endotelial. Exporte essas medidas como arquivos de planilha para traçar e visualizar os dados usando os seguintes comandos: Analisar > Medir.
2. Como alternativa, use o TEER baseado em espectroscopia impedance para medir junções apertadas endoteliais por área. A quantificação da barreira endotelial usando TEER é um proxy para a integridade da camada endotelial como uma barreira.
   1. Posicione dois eletrodos na entrada e saída das câmaras superior e inferior.
   2. Quantifique a impedância da monocamada endotelial como uma combinação das resistências, induções e capacitâncias no chip de acordo com um modelo proposto por Srinivasan et al.^28,29.

5. Células cancerígenas de sementes no dispositivo

1. Depois que a camada endotelial amadureceu, células cancerígenas de sementes entram no dispositivo. Prepare uma solução de 1 mL de 1 x 10⁶ células cancerígenas em mídia celular totalmente cancerosa.
2. Troque a mídia no chip para repor nutrientes da cultura celular.
3. Semente cada canal de câmara superior com 30 μL de células cancerosas em suspensão e, em seguida, coloque o dispositivo de volta na incubadora por um 15 min. Sempre semeou as células cancerígenas do mesmo lado de todos os quatro canais de câmara superior dentro de um único dispositivo.
4. Troque o dispositivo com novas mídias e o refil as pontas a cada 12 horas até que o dispositivo seja imageado por comportamento metastático.

6. Imagem do microambi ambiente tumoral por imagem confocal

1. No ponto de tempo experimental desejado (1, 2 ou 9 dias), use imagens confocal para capturar uma imagem 3D do canal. Nós executamos esta etapa em um Nikon A1 usando as configurações descritas aqui. Esta etapa é automatizada, e cada canal requer 20-40 minutos para imagem, dependendo de quantos canais fluorescentes estão incluídos e da profundidade Z necessária para cobrir as posições de todas as células.
2. Ligue o microscópio, abra o software e coloque a tampa da incubadora no microscópio.
3. Coloque o aquecedor do estágio do microscópio em 37 °C e CO_{de 2} a 5% se disponível.
4. Depois que a incubadora do microscópio se estabilizar, coloque o dispositivo no estágio do microscópio usando a montagem de 50 mm x 75 mm.
5. Concentre-se em um lado do dispositivo (à esquerda se for usado com o software de análise fornecido) com um objetivo de 10x e definir a altura Z como zero. Em configurações de pilha z, inclua uma faixa de 100 μm acima e 200 μm abaixo do plano de foco. Em seguida, use a configuração de costura para definir o número de campos X e Y para 1 e 9, respectivamente, com 15% de sobreposição. Coloque o orifício ao mínimo recomendado e a altura da camada z a 9 μm. Ajuste a exposição do campo brilhante para que a membrana porosa seja visível. Ligue os lasers de excitação para os canais dsRed (561 nm) e GFP (488 nm) e ajuste os poderes e cortes do laser fluorescente para que cada canal seja visível sem expor excessivamente os pixels.
6. Verifique se todos os campos estão em foco quando forem ultrapassados. Se assim for, digite um nome de arquivo de saída (001.nd2) para a imagem e inicie o experimento para capturar automaticamente a imagem confocal 3D.

7. Meça o microambi ambiente tumoral através da tomografia confocal

1. Use a tomografia confocal uma abordagem para estimar um conjunto de métricas e medidas que descrevem as células individuais e o microambiental tumoral dentro do dispositivo. A análise tomográfica confocal (Figura 2) converte uma pilha z confocal em uma representação tridimensional das células. Usando um script python personalizado dentro do ambiente de laboratório/caderno Jupyter, um plano é então compatível com a camada de células que formam a barreira cerebral sanguínea como a membrana³⁰. Por fim, faça medições fenotípicas das populações de células cancerosas(Tabela 1).
   1. Realize esta análise no final de um experimento ou ao longo de um curso de tempo. Instale python e as bibliotecas apropriadas de acordo com o guia de software referenciado e abra o software do Windows Command Prompt executando o comando "conda activate", seguido de "jupyter lab". O ambiente Jupyter será carregado dentro do navegador padrão.
   2. Do explorador de arquivos Jupyter clique duas vezes no notebook Jupyter "contom.ipynb" para abri-lo. Execute o celular abaixo do título Importe bibliotecas, classes/funções personalizadas e configure o notebook clicando no celular do notebook e, em seguida, clicando no botão de reprodução. Todas as células do notebook abaixo são executadas usando a mesma abordagem. Note que aqui o notebook "cell" refere-se a um bloco de código python dentro do notebook Jupyter.
2. Prepare os dados. Este algoritmo usa o kit de ferramentas de visualização (VTK) para manipular e exibir a pilha z e dados tridimensionais¹⁷.
   1. Coloque o fornecido. Arquivo XLSX ("Experiment Tracker.xlsx") na mesma pasta do windows do notebook Jupyter. O arquivo rastreia experimentos e interfaces com o notebook Jupyter. Coloque o arquivo ND2 da seção 6 em uma subpasta chamada "\Experiment_XXX\Confocal\" abaixo do local do notebook Jupyter. Pastas de experimento adicionais podem ser adicionadas dentro ajustando o "XXX" ao ID numérico atribuído a novas pastas.
   2. Rotule a primeira pasta de experimento "Experiment_001" e o arquivo ND2 "001.nd2". Primeiro, converta o arquivo de imagem ND2 em um arquivo TIFF de várias imagens costurado separado por canal de cores. Faça isso executando a célula do caderno abaixo do título "Leia a pilha z confocal na memória" com a função Save_tiff_from_ND2 () sem^{comentários 30}. O arquivo ND2 é um formato de imagem proprietário da Nikon, portanto é necessário convertê-lo para um formato com o que o software de código aberto é compatível.
      NOTA: O TIFF (Tag Image File Format) é usado porque é onipresente, compatível com 16 bits, facilmente importado em VTK, e várias imagens podem ser armazenadas em um único arquivo, o que é apropriado para imagens de pilha de z. A execução da célula do notebook lerá em uma imagem do arquivo ND2, extrairá informações da cor e das posições XYZ e armazenará essa imagem em uma matriz numpy de acordo com uma estrutura pré-determinada. Em seguida, salvará a matriz como um arquivo TIFF usando o arquivo da biblioteca python.
3. Converter dados de imagem em modelo 3D
   1. Importe o arquivo TIFF em VTK (vtkTIFFReader) usando uma renderização 3D para visualizar as células(Figura 2). Selecione um limiar com base na cor das células na imagem. Para esclarecer, o objeto VTK representa um bloco de pixels (X, Y, Z) no espaço (volume), mas apenas certos pixels (verde ou vermelho) representam células, o resto são de fundo ou ruído (preto).
   2. Portanto, defina um filtro de opacidade no volume que remove o fundo confirmar que o que permanece fluorescência são apenas as células. Faça isso usando a célula do notebook Jupyter intitulada, Altere os valores de opacidade para cada canal de microscópio ajustando as variáveis de valor Channel_alpha (ou seja, GFP_alpha). Visualize o efeito usando a célula do notebook intitulada Exibir uma renderização 3D para verificar se o limiar está definido corretamente.
   3. Salve os valores de opacidade na planilha para usar na próxima etapa. Converta os dados de volume em objetos 3D individuais, cada um representando uma célula na imagem usando uma técnica chamada cubos de marcha³¹. Este algoritmo extrai uma malha poligonal de uma isosuperfície de campos escalares tridimensionais discretos de voxels.
   4. Use o valor da opacidade no algoritmo de cubos marchando para separar cada célula do fundo. Complete esta etapa para todas as células fluorescentes identificadas em cada canal de microscópio executando Converter imagem voxel em uma malha triangular e salvar como um arquivo VTK no notebook.
4. Encaixar um plano na membrana
   1. Encaixe um plano na barreira endotelial localizando primeiro os centroides celulares (célula de caderno: Analise o canal RFP (barreira endotelial).). Iterar através da lista de malhas no volume e extrair as regiões que não estão conectadas usando um PolyDataConnectivityFilter de VTK. Calcule o centroid de cada malha e adicione a medição a uma lista de centrosids filtrando para malhas muito grandes ou muito pequenas (<50, >1000000 voxels).
   2. Coloque um plano na lista de centroides para as células endoteliais usando um método de minimização de erro (célula de caderno: Coloque um plano nos centrosids RFP (barreira endotelial)( Figura2, Figura 3)³². Inspecione o ajuste do avião plotando o plano e os centrosids e ajuste manualmente se necessário (usando, beta e z) executando a célula do notebook intitulada Visualize RFP centroids e plane fit.
   3. Depois que o avião estiver devidamente instalado, salve o normal do avião para o Arquivo rastreador de experimentos . Arquivo XLSX para uso futuro.
5. Analisar as características descritivas das células cancerígenas individuais para os seguintes descritores(Tabela 1).
   NOTA: Se o computador que realiza a análise estiver atrasado, a análise de alto rendimento através da computação de alto desempenho é uma opção. Este algoritmo é útil em laptops padrão para a análise de um pequeno número de células, no entanto, o VTK não é adequado para um grande número de objetos individuais (>1000). Portanto, é opcional usar o algoritmo adaptado para funcionar em um cluster de computação de alto desempenho. Isso permite a análise rápida de experimentos com muitas células(Figura 2). Todos os 7.5 são realizados executando as células do notebook intituladas Analisar os canais de microscópio restantes para descritores fenotípicos e Ler no Experiment_tracker informações e analisar os canais existentes.
   1. Medir a extravasão das células cancerosas: Depois de caracterizar a camada endotelial com um plano, meça o volume de cada célula cancerígena que migrou através da membrana. Corte cada célula (Boolean) para que a malha abaixo da membrana seja mantida e a porção acima da membrana seja removida³³. Em seguida, feche a malha aberta (vtkFillHoles).
      1. Recalcular o normal e o novo centroid da malha cortada. Meça o volume e a posição de cada célula cancerígena cortada para análise. O volume equivale ao número de voxels que a malha preenche de cada célula. Calcule a distância entre o plano endotelial e a posição de cada célula cancerosa.
   2. Meça o fenótipo celular: Calcule a morfologia de cada célula cancerosa fatorando sua forma, volume e posição.
6. Valide as medidas e economize em uma planilha ou parcela. Execute a célula do notebook intitulada Verificar se os centroides foram medidos com precisão e uma renderização aparecerá mostrando os centroides identificados em cima do volume de imagem por tipo de célula. Depois de todos os experimentos serem feitos exportar o conjunto completo de dados como um único arquivo de planilha digitando os experimentos a serem incluídos pelo ID na célula de notebook intitulada Export the data como um único Data.XLSX arquivo para os experimentos variáveis substituindo os IDs de experimentos determinados. Se verificar o conjunto de dados concluído, plote-o usando o celular de notebook intitulado Distância extravasada plot de tira. O enredo aparecerá no ambiente do notebook e salvará para arquivar.

8. Analisar as características relacionadas utilizando Inteligência Artificial

NOTA: Identifique recursos fenotípicos metastáticos usando algoritmos de inteligência artificial.

1. Realize a classificação binária usando laranja de acordo com o esquema mostrado na Figura 5 e Arquivo Suplementar 3. Inicie o Orange a partir de um segundo Prompt de comando do Windows digitando "conda activate" seguido de "python -m Orange.canvas" e clique em Novo a partir do prompt. Orange é um software baseado em arrastar e soltar, então organize as funções arrastando cada item do menu esquerdo para a tela para combinar arquivo suplementar 3. Depois disso, clique duas vezes no ícone Arquivo e selecione o arquivo Data.XLSX.
2. Filtre os dados para remover medições ruins, definidas como aquelas que falharam em uma operação booleana ou dando valores variáveis paramétricas fora dos limites conhecidos usando o ícone "Selecionar linhas". Clique duas vezes no ícone e defina condições que correspondem ao filtro, como "A esferofilidade está entre 0 e 1". Crie condições para 8.2.1, 8.2.2 e 8.2.3.
   1. As medidas extravasadas de distância do filtro variam de -100-200 μm.
   2. Filtrar as medidas de esférico da forma celular para variar de 0-1.
   3. Filtrar as medidas de volume de células cancerígenas para variar de 0-2000 voxels.
   4. Use todas as variáveis paramétricas (Tabela 1) para classificar o cérebro-metastático MDA-MB-231-BR-GFP e mda-mb-mb-231-GFP não-cerebral. Clique duas vezes em Selecionar colunas da tela. Usando o botão > para mover variáveis disponíveis em recursos, variáveis de destinoou atributos meta. A única variável que deve ser uma Variável Alvo é um rótulo metastático que define se as células do conjunto de dados são consideradas metastáticas (1) ou não (0). As variáveis de experimento podem ser colocadas na seção Meta Atributos.
3. Prove os dados em um treinamento (80%) e conjunto de testes (20%). Clique duas vezes no ícone data sampler e selecione um tipo de amostragem de proporção fixa de dados: defina para 80% e selecione caixas de seleção replicáveis e estratificam. Estratifique e valide o conjunto de treinamento usando 10 dobras contra cada modelo/classificador. Clique duas vezes em Teste e Pontuação e selecione Validação cruzada com número de dobras: definido para 10 e Estratificado verificado. Definir a classe alvo para 1.
4. Neste método, use redes neurais e algoritmos de aprendizagem da Floresta Aleatória, pois eles são robustos aos dados. Dentro do ícone Floresta Aleatória, escolha o número de árvores para ter 50 anos e não selecione outras opções. Dentro do ícone da Rede Neural escolha Neurônios por leito ocultor: 100, Ativação: ReLu, Solver: Adam, Alfa: 0,0001e Iterações Máximas: 200. No entanto, essas configurações variam significativamente de acordo com o estudo e devem ser bem compreendidas antes da aplicação.
5. Depois de configurar a tela, clique duas vezes em cada ícone de Arquivo para Dados de Amostra e clique em Aplicar ou Enviar Dados. Clique duas vezes em Teste e Pontuação e os dados de treinamento começarão a ser usados para desenvolver um modelo usando os algoritmos. Depois de treinar o modelo de aprendizado de máquina, reassine teste e pontuação e selecione Teste em Dados de Teste e feche a janela pop-up para marcar o desempenho do modelo classificando as células no chip de acordo com a probabilidade de serem metastáticas cerebrais de 0 a 1.
6. Salve o desempenho do modelo de aprendizado de máquina em um arquivo(Tabela 2). Inclua a área sob a curva (AUC) do ROC, a precisão e a pontuação da F1. Salve um segundo arquivo que contenha os índices metastáticos individuais e as probabilidades de classificação. Clique duas vezes no ícone Salvar e clique em Salvar Como escrever para registrar as probabilidades de classificação. Da mesma forma, a curva ROC pode ser visualizada clicando duas vezes no ícone ROC Analysis e o desempenho do modelo pode ser calculado clicando duas vezes no ícone Confusion Matrix.

Resultados

Utilizando essa técnica, analisamos tipos de células rotuladas com diferentes proteínas fluorescentes ou corantes. Demonstramos o uso desta abordagem com um chip μmBBN formulado com astrócitos hCMEC/D3-DsRed e não fluorescentes. As células endoteliais microvasculares cerebrais foram semeadas em uma membrana porosa (poros gravados por 5 μm de pista) e colocadas em uma incubadora³⁴ a 37 °C sob 5% de CO₂. Após três dias, a confluência da camada endotelial foi confirmada via mic...

Discussão

Desenvolvemos e apresentamos um novo método que adapta ferramentas frequentemente utilizadas em análises de imagem clínica para medição de extravasação e migração de células cancerígenas através de uma barreira endotelial no tecido cerebral. Nós colocamos essa abordagem pode ser útil tanto para medições in vivo quanto in vitro; demonstramos seu uso em um sistema microfluido 3D recapitulando vasculatura cerebral. As medidas de células cancerígenas, incluindo distância extravasada, percentual extravasado...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA with phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
1.5 mm biopsy punch with plunger	Integra LifeSciences Corporation	33-31A-P/25
10x MEM	Thermo Fisher Scientific	11430030
150 mm petri dishes	Fisher Scientific	FB0875714
1x DPBS, without Ca and Mg	Thermo Fisher Scientific	14190144
200uL pipette tip	Fisher Scientific	02-707-411
4 inch silicon wafer	University Wafer	452
48 mm wide packing tape	Fisher Scientific	19-072-097
50 x 75 mm glass slide	Fisher Scientific	12-550C
A1 confocal microscope	Nikon
acetone	Fisher Scientific	A9-20
antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin)	Gibco	15240062
box cutter blade	Fisher Scientific	NC1721575
dissection scissors	Fisher Scientific	08-951-5
DMEM with 4.5 g/L glucose	Thermo Fisher Scientific	11960-044
double sided tape	Fisher Scientific	NC0879005
EGM-2	Lonza	CC-3162
Fetal Bovine Serum, Heat inactivated	Corning	MT35011CV
Fiji software	ImageJ
glass vial	Fisher Scientific	03-341-25D
glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061
hCMEC/D3	EMD Millipore	SCC066
Jupyter notebook	Anaconda
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081
Matrigel - growth factor reduced with phenol red	Corning	CB-40230A
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
MDA-MB-231-BR-GFP	Dr. Patricia Steeg, NIH
N-2 growth supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
normal human astrocytes (NHA)	Lonza	CC-2565
Orange software	University of Ljubljana
Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-711-9AM
Photolithography masks	Photosciences Incorporated
pLL3.7-dsRed	University of Michigan Vector Core
pLL-EV-GFP	University of Michigan Vector Core
pLOX-TERT-iresTK	Addgene	12245
pMD2.G	Addgene	12259
polycarbonate membrane, 5um pore size	Millipore	TMTP04700
psPAX2	Addgene	12260
PureCol, 3 mg/mL	Advanced Biomatrix	5005	Type I bovine collagen
sodium bicarbonate	Thermo Fisher Scientific	25080094
sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360070
Solo cup	Fisher Scientific	NC1416545
SU-8 2075	MicroChem Corporation	Y111074 0500L1GL
SU8 developer	MicroChem Corporation	Y020100 4000L1PE
Sylgard 184	Ellsworth Adhesive Company	NC0162601
Toluene	Sigma-Aldrich	179965-1L
Tricholoro perfluoro octyl silane	Sigma-Aldrich	448931-10G