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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Kultivierung einer Bluthirnschranke metastasierenden Tumor Mikro-Umgebung und dann quantifizieren seinen Zustand mit konfokaler Bildgebung und künstliche Intelligenz (Machine Learning).

Zusammenfassung

Hirnmetastasen sind die tödlichsten Krebsläsionen; 10-30% aller Krebsarten metastasieren auf das Gehirn, mit einem medianen Überleben von nur 5-20 Monaten, abhängig vom Krebstyp. Um die Belastung durch metastasierende Tumore im Gehirn zu verringern, müssen Lücken in grundlegenden und translationalen Kenntnissen behoben werden. Zu den größten Herausforderungen gehören ein Mangel an reproduzierbaren präklinischen Modellen und zugehörigen Werkzeugen. Dreidimensionale Modelle der Hirnmetastasierung können die relevanten molekularen und phänotypischen Daten liefern, die in Kombination mit speziellen Analysetools verwendet werden, um diesen Anforderungen gerecht zu werden. Darüber hinaus erzeugen Organ-on-a-Chip-Modelle von Patiententumorzellen, die die Hirnschranke des Blutes in die Mikroumgebung des Gehirns durchqueren, im Vergleich zu murinen Modellen schnell Ergebnisse und sind mit quantitativen Methoden interpretierbarer und somit für Tests mit hohem Durchsatz geeignet. Hier beschreiben und demonstrieren wir den Einsatz einer neuartigen 3D-Mikrofluidischen Bluthirnnische (mBBN), auf der mehrere Elemente der Nische über einen längeren Zeitraum (mehrere Tage) kultiviert, durch konfokale Mikroskopie fluoreszierend dargestellt und die Bilder mit einer innovativen konfokalen Tomographie-Technik rekonstruiert werden können; alle zielten darauf ab, die Entwicklung von Mikrometastasen und Veränderungen der Tumor-Mikroumgebung (TME) in einer wiederholbaren und quantitativen Weise zu verstehen. Mit dieser Plattform zeigen wir, wie man die Krebszellen und TME-Zell- und Humorkomponenten fabriziert, aussaiert, absaiert und analysiert. Darüber hinaus zeigen wir, wie künstliche Intelligenz (KI) verwendet wird, um die intrinsischen phänotischen Unterschiede von Krebszellen zu identifizieren, die in der Lage sind, durch ein Modell zu übertragen und ihnen einen objektiven Index des metastasierenden Potenzials des Gehirns zuzuweisen. Die mit dieser Methode generierten Datensätze können verwendet werden, um grundlegende und translationale Fragen zur Metastasierung, zur Wirksamkeit therapeutischer Strategien und zur Rolle der TME in beiden zu beantworten.

Einleitung

Hirnmetastasen sind die tödlichsten Krebsläsionen; 10-30% aller Krebsarten metastasieren zum Gehirn, mit einem medianen Überleben von nur 5-20 Monaten, abhängig vom Krebstyp1,2. Eine Hauptfrage, die sich beim Studium der Krebsmetastasierung stellt, ist, wie Subklone aus der humoralen Umgebung des Blutkreislaufs in ein Organ wie das Gehirn3,4wandern. Diese Frage hat zu vielen Variationen von Migration, Invasion und Extravasation Assays geführt. Alle diese Methoden teilen den entscheidenden Schritt des Zählens oder Messens von Eigenschaften von Zellen, die sich als Reaktion auf einen Stimulus von einem Standort zum anderen bewegen. Die meisten migrationsfreundlichen Assays werden verwendet, um die zweidimensionale (2D) Migration von Krebszellen zu untersuchen. Diese haben eine Fülle von Wissen aufgeklärt; Sie rekapitulieren jedoch nicht den dreidimensionalen Charakter des in vivo-Systems, den andere Methoden5liefern können. Daher ist es notwendig, die Tumor-Mikroumgebung (TME) in dreidimensionalen (3D) Systemen zu untersuchen, aber die Analyseansätze für 3D-Strukturen sind begrenzt und oft inkonsistent.

Eines der beliebtesten 3D-Werkzeuge ist eine Boyden-Kammer, die aus einer Membran besteht, die an der Unterseite eines Brunnens aufgehängt ist und zwei verschiedene Bereiche trennt. Boyden führte den Test ein, um Leukozyten-Chemotaxis zu untersuchen4. Die unteren Bereiche können durch Chemie oder andere Mittel6,,7 variiert werden, um Zellen im oberen Bereich dazu zu bringen, in den unteren Bereich zu migrieren. Der häufigste Ansatz zur Quantifizierung der Anzahl der zellen, die migriert wurden, besteht darin, die Zellen von der Unterseite der Membran mithilfe einer Pufferlösung freizusetzen, sie zu lysieren und sie dann basierend auf der Menge des DNA-Gehalts in der Lösung7zu zählen. Dieser indirekte Ansatz ist aufgrund der Technikvariabilität anfällig für Bedienerfehler und das Verfahren zerstört Informationen über den Krebsphänotyp und die Mikroumgebung. Variationen des Boyden-Kammer-Assays beinhalten die Fixierung von Zugzellen, die auf der Membran verbleiben, liefert aber nur eine Anzahl von Zellen, die für die weitere Studie6,8,9nicht mehr lebensfähig sind.

Aufgrund der Einschränkungen der Boydenkammer und des Wachstums von Innovationen in der mikrofluidischen Gemeinschaft wurden Migrations-Assay-Chips entwickelt, die die Bewegung von Zellen als Reaktion auf einen Stimulus in eine Richtung anstatt drei10,11,12beobachten. Diese Migrationstests erleichtern die Kontrolle über Faktoren wie Strömung oder Einzelzelltrennung13,14, die eine bessere Interpretation der Ergebnisse ermöglichen; Ihr 2D-Format verliert jedoch unweigerlich einige dynamische Informationen. Jüngste Studien haben sich auf die Extravasation (d.h. die Bewegung von Zellen aus der Zirkulation in ein Gewebe, wie die Blut-Hirn-Schranke) in einer 3D-Umgebung14,15konzentriert. Der Extravasationsabstand in Gewebe und das Sondierungsverhalten, das an der zellulären Barriere/Membran auftritt, ist raffinierter als Messungen, die entweder mit der Boyden-Kammer oder einem 2D-Mikrofluid-Migrationsgerät16gewonnen wurden. Daher sind Geräte, die eine angemessene Bildgebung und Analyse der 3D-Extravasation ermöglichen, entscheidend, um diese ausgeklügelten Messungen zu erfassen, aber es fehlt in der Literatur.

Unabhängig von Migrationstests wurden robuste bildgebende Verfahren für die Magnetresonanztomographie (MRT) und Tomographie entwickelt, die gewebe im 3D-Raum17,18identifizieren und genau rekonstruieren können. Diese Techniken erfassen Bilder in Z-Stacks und Segmentteilen des Bildes basierend auf den Eigenschaften des Gewebes und konvertieren dann die segmentierten Bilder in dreidimensionale Netze19,20,21. Dies ermöglicht es Ärzten, in 3D einzelne Organe, Knochen und Gefäße zu visualisieren, um bei der chirurgischen Planung oder Hilfe bei der Diagnose von Krebs oder Herzerkrankungen zu helfen22,23. Hier zeigen wir, dass diese Ansätze für den Einsatz an mikroskopischen Proben und 3D-Extravasationsgeräten angepasst werden können.

Zu diesem Zweck haben wir die innovative konfokale Tomographie-Technik entwickelt, die hier vorgestellt wird und die Flexibilität bietet, die Extravasation von Tumorzellen über eine Membran zu untersuchen, indem bestehende Tomographie-Tools angepasst werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der gesamten Bandbreite des Verhaltens von Krebszellen, da sie mit einer zellulären Barriere interagieren, wie z. B. einer endotheliaalen Zellschicht. Krebszellen zeigen Sondierungsverhalten; einige können eindringen, bleiben aber in der Nähe der Membran, während andere die Barriere leicht durchqueren. Diese Technik ist in der Lage, Informationen über den Phänotyp der Zelle in allen Dimensionen24zu liefern. Mit diesem Ansatz zur Untersuchung der TME ist sowohl relativ kostengünstig, leicht zu interpretieren und reproduzierbar, im Vergleich zu komplexeren in vivo murinen Modellen. Die vorgestellte Methodik sollte eine starke Grundlage für die Untersuchung vieler Arten von Tumoren und Mikroumgebungen bieten, indem die Stromregion angepasst wird.

Wir beschreiben und demonstrieren die Verwendung einer 3D-Mikrofluidischen Bluthirnnische(MBBN)Plattform ( Abbildung 1 ), in der kritische Elemente der Barriere und Nische (mikrovaskuläre Endkörperzellen und Astrozyten des Gehirns) über einen längeren Zeitraum (ca. bis zu 9 Tage) kultiviert, durch konfokale Mikroskopie fluoreszierend dargestellt und die mit unserer konfokalen Tomographie rekonstruierten Bilder rekonstruiert werden können ( Abbildung2); alle zielten darauf ab, die Entwicklung von Mikrometastasen und Veränderungen der Tumor-Mikroumgebung in einer wiederholbaren und quantitativen Weise zu verstehen. Die Schnittstelle zur Blut-Hirn-Schranke mit der Gehirnnische besteht aus mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns, die durch Kellermembran, Astrozytenfüße und Pericyten25verstärkt werden. Wir konzentrierten uns selektiv auf die Astrozyten- und Endothelkomponenten, da sie für die Bildung und Regulierung der Blut-Hirn-Schranke wichtig sind. Mit dieser Plattform zeigen wir, wie man die Krebszellen und tumormikro-Umweltzell- und Humorkomponenten fabriziert, aussaiert, absaiert und analysiert. Schließlich zeigen wir, wie maschinelles Lernen genutzt werden kann, um die intrinsischen phänotypischen Unterschiede von Krebszellen zu identifizieren, die in der Lage sind, durch ein Modell zu übertragen und ihnen einen objektiven Index des metastasierenden Potenzials des Gehirns zuzuweisen24. Die mit dieser Methode generierten Datensätze können verwendet werden, um grundlegende und translationale Fragen zu Metastasen, therapeutischen Strategien und der Rolle der TME in beiden zu beantworten.

Protokoll

1. Bereiten Sie die Blut-Hirn-Schranke Nischenform

HINWEIS: Das Kultivierungsgerät, das auf dieser Plattform verwendet wird, ist ein PDMS-basiertes Gerüst, auf dem wir eine zelluläre Blut-Hirn-Barriere-Nische aufbauen. Es besteht aus zwei Teilen, die durch eine poröse Membran getrennt sind. Zur Vorbereitung der Blut-Hirn-Schranke Nische zwei SU-8 Formen mit Photolithographie gemacht sind notwendig26,27. Das Protokoll wird zuerst für die 100 m dicke Form beschrieben und dann werden Hinweise für die 200 m dicke Form gegeben.

  1. Um die Form vorzubereiten, reinigen Sie einen 4" Silizium-Wafer mit Aceton mit einer Squeeze-Flasche und trocknen Sie ihn dann mit einer Stickstoffpistole.
    1. Backen Sie den Siliziumwafer auf einer Kochplatte für 10 min bei 200 °C, um alle Restlösungsmittel zu entfernen.
    2. Zentrieren Sie den Siliziumwafer wiederum auf das Futter eines Spincoaters und geben Sie 1 ml SU8-2075 für die obere Form aus. Drehen Sie 5 s bei 500 U/min (Beschleunigung 300 U/min/s), um den Photoresist zu zerstreuen, und dann 30 s bei 2200 U/min (Beschleunigung 300 U/min/s), um eine 100 m dicke SU-8-Beschichtung zu erhalten. Eine Optimierung kann erforderlich sein, um die angegebene Dicke zu erreichen.
  2. Den Wafer bei 65 °C für 2 min weich backen und dann sofort bei 98 °C für 20 min.
  3. Legen Sie den Wafer in eine Photolithographielampe und positionieren Sie die Maske nach Standardverfahren zentriert auf den Wafer. Setzen Sie die SU-8 beschichteten Wafer mit einer Ausstrahlung von 230 mJ/cm2 UVB (360 nm ± 10 nm) aus. Ein Expositionsmatrix-Experiment kann durchgeführt werden, um die optimale Dosierung zu bestimmen. Maskendesigns sind in der Zusatzdatei 1verfügbar.
  4. Führen Sie ein Backen nach der Exposition bei 65 °C für 2 min und dann sofort bei 98 °C für 10 min, um die Haftung zu verbessern. Den Wafer auf 50 °C abkühlen.
  5. Entfernen Sie den nicht belichteten Widerstand mit SU-8 Photo-Developer. Spülen Sie den Wafer im Entwickler für 5 min in einem Bad und dann verwenden Sie eine Sprühflasche mit SU-8 Entwickler in einer chemischen Haube gefüllt, um zu agitieren und zu entfernen verbleibende ungeheilt SU-8. Mit einem 4-fachen Mikroskop kann beobachtet werden, ob alle ungehärteten SU-8 entfernt wurden. Eine weiße Linie an den Rändern der Photoresist-Features zeigt an, dass die SU-8 nicht vollständig entfernt wurde.
  6. Führen Sie ein letztes hartes Backen im Ofen bei 110 °C für 60 min.
  7. Befolgen Sie das gleiche Verfahren für die 200 m dicke Form mit SU-8 2075, passen Sie das Protokoll jedoch wie folgt an:
    1. Spin-Coater-Einstellungen: Drehen Sie für 5 s bei 500 U/min (Beschleunigung 300 U/min/s), um den Photoresist zu zerstreuen, und dann 30 s bei 1300 U/min (Beschleunigung 300 U/min/s), um eine 200 m dicke Beschichtung zu erhalten.
    2. Weich backen bei 65 °C für 2 min dann bei 98 °C für 40 min.
    3. Belichtungszeit von 340 mJ/cm2.
    4. Nach der Belichtung backen: 2 min bei 65 °C und dann 98 °C für 15 min.
  8. Schließlich silanisieren Sie jeden Wafer, indem Sie ihn in eine Vakuumkammer innerhalb einer chemischen Haube mit einem Kunststoffbehälter legen, in dem 3 Tropfen (150 l) Silanisierlösung (Trichloro perfluoroctylsilan) platziert wurden. Ziehen Sie ein Vakuum und lassen Sie über Nacht, damit der Dampf den Wafer zu beschichten. Dieser Schritt reduziert die Haftung zwischen SU-8 und PDMS und erhöht die Lebensdauer der Form.
    VORSICHT: Trichlorperfluoroctylsilan sollte immer in der Dunstabzugshaube behandelt und von Wasserquellen ferngehalten werden.
  9. Legen Sie einzelne Waferformen in 150 mm Petrischalen mit zwei Streifen doppelseitigem Klebeband. Stellen Sie sicher, dass die Wafer flach sind. Eine Alternative ist die Herstellung einer Aluminiumform, in der der Wafer platziert werden kann. Da die Aluminiumform eingeschlossen ist, wird sie Gussteile mit einer gleichmäßigen Dicke produzieren, während die Petrischale-Methode empfindlich auf die Neigung der Oberfläche reagiert. Die verbesserte Ebenheit der PDMS-Gussteile reduziert die nachgeschaltete konfokale Bildgebungszeit.

2. Form und Montage des PDMS Blut-Hirn-Schranke (BBB) Gerät

  1. Mischen Sie 75 g PDMS im Verhältnis 1:10 (Crosslinker:Base) nach Gewicht in einem Kunststoffbecher.
  2. Gießen Sie das PDMS über die Formen (1 mm dick für die 200 m dicke Form und 4 mm für die 100 m dicke Form) und entgasen Sie in einem Vakuum-Austauchgerät für eine Stunde oder bis alle Blasen entfernt sind. Über Nacht in einen 65 °C-Ofen stellen. Die 1 mm Dicke kann auf basis des Arbeitsabstandes des 10-fachen Objektivs im Konfokalmikroskop eingestellt werden.
  3. Nachdem das PDMS ausgehärtet ist, verwenden Sie eine Klinge, um sanft gegen den Wafer durch das PDMS um die Kanten zu schneiden. Schälen Sie das PDMS ab und schneiden Sie mit einer Klinge entlang der rechteckigen Führungen und einem 1,5 mm Biopsiespunsch die Ein- und Auslässe am Gerät. Bedecken Sie die PDMS-Geräteteile mit einem 48 mm breiten Verpackungsband, um sie vor Staub und Schmutz zu schützen.
  4. Als nächstes verwenden Sie Sezierschere, um ein 5 mm x 50 mm Rechteck aus Polycarbonat-Membran mit 5 m Poren zu schneiden und sie in einer Petrischale für den späteren Gebrauch zu speichern.
  5. Sammeln Sie folgendes: 200 l Pipettenspitze, 2 ml 1:10 PDMS gemischt mit Toluin im Verhältnis 2:3 Gewicht in einer Glasdurchstechflasche, eine Pasteur Pipette mit einer Quetschung, die vorbereiteten PDMS Ober- und Unterteile, die Membran, drei 50 mm x 75 mm Glasrutschen und transportieren sie alle zu einem Spincoater. Die folgenden Schritte für die Montage und Zellaussaat des Geräts sind in Abbildung 1dargestellt.
  6. Verwenden Sie die Pasteur-Pipette, um 1 ml PDMS:Toluen-Kleberlösung in einen 50 mm x 75 mm Glasschlitten auf dem Spannfutter des Spincoaters zu übertragen. Drehen Sie für 5 Sekunden bei 100 U/min (Beschleunigung 300 U/min) und 30 Sekunden bei 2000 U/min (Beschleunigung 300 U/min/s).
  7. Legen Sie die Folie auf einen Tisch und bedecken Sie sie mit einer PDMS-Oberkammer und einer unteren Kammer, so dass die PDMS-Flächen mit in sie eingegossenen Features die Folie kontaktieren und der Kleber auf die PDMS-Fläche übertragen wird, wobei der Umfang aller Features umrissen wird.
  8. Drehen Sie die PDMS-Oberkammer auf einen anderen Schlitten mit der Nachoben-Kleberbeschichtung und legen Sie die Membran vorsichtig zwischen den Ein- und Auslässen über das Gerät. Legen Sie die 200-L-Spitze in die PDMS:Tolumol-Kleberlösung, bis sie etwas in die Spitze eingelassen hat. Berühren Sie die Spitze zwischen jedem Ein- und Auslass, um einen kleinen Tropfen in der Nähe des Membranrandes zu platzieren, wo er das PDMS berührt.
  9. Entfernen Sie die andere Hälfte des Geräts und legen Sie es mit der Leimbeschichtung nach unten, während Sie die Ein- und Auslässe auf den beiden Teilen ausrichten.
  10. Legen Sie das montierte Gerät über Nacht bei 37 °C in einen Ofen, um den Kleber auszuhärten. In ein Vakuumglockenglas mit Trockenmittel geben und zwei Tage dehydrieren lassen. Dies ist ein entscheidender Schritt, um das Toluin verdampfen zu lassen und die Konsistenz der Aussaat des Geräts zu verbessern, indem der absorbierte Wasserdampf in der Laborluft reguliert wird.

3. Seed das Gehirn Mikro-Umgebung in das Gerät

  1. Zellkultur und Reagenzien: Bevor Sie mit diesem Protokoll beginnen, erhalten Sie die folgenden Reagenzien und Zellen. Kultivieren Sie alle Zelllinien in einem Inkubator, der bei 37 °C in 5%CO2eingestellt ist.
    1. Bewahren Sie menschliche dreifach-negative Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) und MDA-MB-231-BR-GFP-Zellen (erhalten von Patricia Steeg, PhD) in DMEM mit 4,5 g/L Glukose, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 10% FBS und 1x Antimykotik. Erstellen Sie MDA-MB-231-GFP-Leuchtstoffzellen, indem Sie mDA-MB-231-Zellen mit leerem Vektor pLL-EV-GFP lentivirus transduzieren. Sortieren Sie die transduzierte GFP+ Population mit Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) vor dem Experimentieren.
    2. Pflege der mikrovaskulären Endothelzellen des menschlichen Gehirns hCMEC/D3 in EGM-2-Medium. Erstellen Sie hCMEC/D3-DsRed Fluoreszenzzellen, indem Sie hCMEC/D3 mit leerem Vektor pLL-3.7-dsRed lentivirus transduzieren. Entfernen Sie alle nicht transducierten, nicht fluoreszierenden Zellen aus der Kultur mit FACS vor der experimentellen Anwendung.
    3. Pflegen Sie normale menschliche Astrozyten (NHA) in DMEM, ergänzt mit 4,5 g/L Glukose, 10% FBS, 2 mM Glutamax, 1 mM Natriumpyruvat, 1x N-2 Wachstumsergänzung und 1x Antimykotik. Verewigen Sie die Astrozyten, indem Sie den pLOX-TERT-iresTK lentiviralen Vektor transduzieren (Addgene 12245). Erstellen Sie den Vektor mit Plasmid psPAX2 und Hüllkurvenplasmid pMD2.G (Addgene 12260 und 12259).
  2. Entfernen Sie ein Gerät aus dem Vakuum-Desiccator und legen Sie es mit nach unten gerichteten Einlässe auf eine Metall- oder Papieroberfläche (d. h. Klebeband) und legen Sie es in eine Plasmakammer. Legen Sie auch einen 50 mm x 75 mm Glasschlitten in die Plasmakammer. Ziehen Sie ein Vakuum und behandeln Sie dann mit Plasma bei 80 W für 30 s.
  3. Entfernen Sie schnell die Glasrutsche und das Gerät aus der Plasmakammer und legen Sie das Gerät mit den Einlässe nach oben auf den Glasschlitten ausgerichtet mit einer Führung (Ergänzungsdatei 2). Dadurch entsteht eine dauerhafte Verbindung zwischen PDMS und Glasrutsche und kann nicht neu positioniert werden.
  4. Als nächstes schneiden Sie die Spitzen von 16, 200 l Pipettenspitzen, 2 mm von der Spitze. Legen Sie die Pipettenspitzen in alle Ein- und Auslässe ein. Das Gerät kann an dieser Stelle wieder in den Vakuum-Austrocknungsor gelegt werden, wenn es nicht bereit ist, die Zellen auszusäen.
  5. Legen Sie das Gerät wieder in die Plasmakammer und behandeln Sie es mit Plasma für 8 min bei 200 W. Nachdem das Gerät abgekühlt ist (5 min) von der Plasmabehandlung, legen Sie es in einen sterilen Sekundärbehälter, wie eine transparente Pipettenspitzenbox. Führen Sie den nächsten Schritt innerhalb von 15 min oder die Wirksamkeit der Plasmabehandlung kann reduziert werden, was zu Verstopfung.
  6. Einige Tage vor der Experimentierkultur Petrischalen von 1 x 106 Endothelzellen (hCMEC/D3-DsRed) und 1 x 106 Astrozyten (NHA). Während der 8-min-Plasmabehandlung bereitet das Gerät eine Kollagenlösung vor, die aus 0,5 ml 3 mg/ml PureCol Typ I Rinderkollagen mit 64 l mit 0,8 m NaHCO3 und 20 l 10x hochglukosem (250 mM) MEM besteht. 5,0 x 105 NHA-Zellen in der Kollagenlösung suspendieren. Bewahren Sie die Lösung auf Eis auf, während sie nicht verwendet wird.
  7. Übertragen Sie 120 l der Kollagen-/Astrozyten-/Mikroglialösung durch die Pipettenspitze für die untere Kammer in das Gerät(Abbildung 1 Rote Pfeile). Lassen Sie die Lösung über die Kammer in die gegenüberliegende Pipettespitze leiten. Nachdem alle vier Kanäle des Gerätes gefüllt sind, legen Sie den Chip imCO2-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2 für 1 h oder bis das Kollagen gesetzt ist.
  8. Nach den Kollagen-Sets alle Pipettenspitzen füllen, die die Bodenkammer mit einer Mischung aus kompletten Medien füttern. Für Chips, die Endothelzellen und Astrozyten enthalten, wird eine 50:50-Mischung aus endothelialen: Astrozytenmedien verwendet.
  9. Beschichten Sie die obere Kammer mit 2% Wachstumsfaktor reduziert Matrigel in kompletten endothelialen Medien mit der oberen Kammer Pipettenspitze (Abbildung 1 Blaue Pfeile) und legen Sie in den Inkubator für 1 Stunde.
  10. Spülen Sie die obere Kammer mit der angegebenen Medienmischung und alternative, welche Spitze mit Endothelzellen gesät wird (Abbildung 1 Grüne Pfeile). 1 x 106 Endothelzellen in 1 ml Endothelmedien und Samen 30 l alle 15 min in abwechselnde obere Kammerspitzen für eine gleichmäßige Abdeckung aussetzen. Samen-Endothelzellen in jede obere Kammerspitze zweimal, für insgesamt 4 mal pro Kammer.
  11. Nach der endgültigen Aussaat der Endothelzellen alle Spitzen mit der Medienmischung füllen und das Gerät bei 37 °C und 5%CO2im Inkubator platzieren, das alle 12 stunden in beiden Kammern wechselt.

4. Überwachung des Fortschreitens der endotheliaalen Schichtbildung

  1. Die vollständige Abdeckung des Kanals durch die Endothelschicht wird nach 3 Tagen beobachtet. Verwenden Sie eine von zwei Methoden, um die Abdeckung der Endothelbarriere zu überwachen: Fluoreszenz oder TEER. Die hCMEC/D3-DsRed Fluoreszenz und entsprechend % Abdeckung über den Kanalbereich kann mit ImageJ quantifiziert werden.
    1. Öffnen Sie die TIFF-Datei in ImageJ-Vertreter der hCMEC/D3-DsRed-Barriere. Klicken Sie in der ImageJ-Software auf Datei > Öffnen, um die Datei auszuwählen.
    2. Führen Sie alle Z-Ebenen des Bildes mit der maximalen Intensität nach folgenden Tastenbefehlen und Optionen zusammen: Bild > Stapel > Z-Projekt > Alle Z-Slices, Maximale Intensität.
    3. Führen Sie einen Farbschwellenwert aus, der für alle mikrofluidischen Chips gleich ist, die mit dieser Methode bewertet werden. Für die vorgestellte Studie haben wir einen Schwellenwert von 450 verwendet. Verwenden Sie das Schwellenwertmenü in ImageJ unter: Bild > Anpassen > Schwellenwert.
    4. Legen Sie die zu erfassenden Messungen mit den folgenden Befehlen und Optionen fest: Analysieren > Messungen > Grenzwert auf Schwellenwert, Flächenfraktion.
    5. Wählen Sie einen repräsentativen Bereich des mikrofluidischen Kanals aus, der gemessen werden soll, indem Sie ein Feld zeichnen. Das Box-Tool befindet sich im Hauptmenü von ImageJ. Messen Sie 3 technische Replikationen, die am Anfang, in der Mitte und am Ende jedes mikrofluidischen Kanals mit der gleichen Boxgröße positioniert sind.
    6. Analysieren Sie jeden Kanal, und zeichnen Sie den Flächenanteil auf, der die % endotheliale Abdeckung darstellt. Exportieren Sie diese Messungen als Tabellenkalkulationsdateien, um die Daten mit den folgenden Befehlen zu zeichnen und zu visualisieren: Analysieren > Messen.
  2. Alternativ können Sie TEER auf Impedanzspektroskopie-basierter TEER verwenden, um endotheliale enge Knoten pro Fläche zu messen. Die Quantifizierung der Endothelbarriere mit TEER ist ein Proxy für die Integrität der Endothelschicht als Barriere.
    1. Positionieren Sie zwei Elektroden im Ein- und Auslass der oberen und unteren Kammern.
    2. Quantifizieren Sie die Impedanz der endothelialen Monoschicht als Kombination der Widerstände, Induktivitäten und Kapazitäten im Chip nach einem Modell, das von Srinivasan etal. 28,29vorgeschlagen wurde.

5. Samen krebszellen in das Gerät

  1. Nachdem die Endothelschicht gereift ist, samen Krebszellen in das Gerät. Bereiten Sie eine 1 ml Lösung von 1 x 106 Krebszellen in kompletten Krebszellmedien vor.
  2. Tauschen Sie die Medien im Chip aus, um die Zellkulturnährstoffe aufzufüllen.
  3. Säen Sie jeden oberen Kammerkanal mit 30 l Krebszellen in Suspension und legen Sie das Gerät dann für 15 min wieder in den Inkubator. Säen Sie die Krebszellen immer auf der gleichen Seite aller vier oberen Kammerkanäle in einem einzigen Gerät.
  4. Tauschen Sie das Gerät mit neuen Medien aus, und füllen Sie die Tipps alle 12 Stunden auf, bis das Gerät für das metastasierende Verhalten ababgebildet wird.

6. Stellen Sie sich die Tumor-Mikroumgebung durch konfokale Bildgebung vor

  1. Verwenden Sie zum gewünschten experimentellen Zeitpunkt (1, 2 oder 9 Tage) konfokale Bildgebung, um ein 3D-Bild des Kanals zu erfassen. Diesen Schritt führen wir auf einer Nikon A1 mit den hier beschriebenen Einstellungen aus. Dieser Schritt ist automatisiert, und jeder Kanal benötigt 20-40 min, um abzubilden, je nachdem, wie viele fluoreszierende Kanäle enthalten sind und die Z-Tiefe benötigt wird, um die Positionen aller Zellen abzudecken.
  2. Schalten Sie das Mikroskop ein, öffnen Sie die Software und legen Sie die Inkubatorabdeckung auf das Mikroskop.
  3. Stellen Sie die Mikroskop-Stufenheizung auf 37 °C und CO2 bis 5%, falls verfügbar.
  4. Nachdem sich der Mikroskop-Inkubator stabilisiert hat, legen Sie das Gerät mit der 50 mm x 75 mm Halterung in die Mikroskopstufe.
  5. Konzentrieren Sie sich auf eine Seite des Geräts (links, wenn sie mit der mitgelieferten Analysesoftware verwendet werden soll) mit einem 10-fachen Objektiv und legen Sie die Z-Höhe auf Null fest. Unter den Z-Stack-Einstellungen wird ein Bereich von 100 m über und 200 m unterhalb der Fokusebene enthalten. Verwenden Sie dann die Sticheinstellung, um die Anzahl der X- und Y-Felder auf 1 bzw. 9 mit 15 % Überlappung festzulegen. Stellen Sie das Loch auf das empfohlene Minimum und die Z-Schicht-Höhe auf 9 m fest. Passen Sie die Helle Feldbelichtung so an, dass die poröse Membran sichtbar ist. Schalten Sie die Anregungslaser für die Kanäle dsRed (561 nm) und GFP (488 nm) ein und passen Sie die fluoreszierenden Laserleistungen und Cutoffs so an, dass jeder Kanal sichtbar ist, ohne die Pixel zu überblonen.
  6. Überprüfen Sie, ob alle Felder im Fokus stehen, wenn Sie überschritten werden. Wenn dies der Fall ist, geben Sie einen Ausgabedateinamen (001.nd2) für das Bild ein, und starten Sie das Experiment, um das konfokale 3D-Bild automatisch zu erfassen.

7. Messung der Tumormikroumgebung mittels konfokaler Tomographie

  1. Verwenden Sie die konfokale Tomographie, um eine Reihe von Metriken und Messungen zu schätzen, die die einzelnen Zellen und die Tumor-Mikroumgebung innerhalb des Geräts beschreiben. Die konfokale tomographische Analyse (Abbildung 2) wandelt einen konfokalen Z-Stack in eine dreidimensionale Darstellung der Zellen um. Mithilfe eines benutzerdefinierten Python-Skripts in der Jupyter-Notebook-/Laborumgebung wird dann eine Ebene mit der Zellschicht abgeglichen, die die Blut-Hirn-Schranke wie Membran30bilden. Schließlich machen Sie phänotyptische Messungen der Krebszellpopulationen (Tabelle 1).
    1. Führen Sie diese Analyse am Ende eines Experiments oder über einen Zeitverlauf aus. Installieren Sie python und die entsprechenden Bibliotheken gemäß dem referenzierten Softwarehandbuch, und öffnen Sie dann die Software von Windows Command Prompt, indem Sie den Befehl "conda activate" ausführen, gefolgt von "jupyter lab". Die Jupyter-Umgebung wird innerhalb des Standardbrowsers geladen.
    2. Doppelklicken Sie im Jupyter-Datei-Explorer auf das Jupyter-Notizbuch "contom.ipynb", um es zu öffnen. Führen Sie die Zelle unter dem Titel Bibliotheken importieren, benutzerdefinierte Klassen/Funktionen und richten Sie das Notizbuch ein, indem Sie auf die Notizbuchzelle und dann auf die Wiedergabeschaltfläche klicken. Alle folgenden Notizbuchzellen werden nach demselben Ansatz ausgeführt. Beachten Sie, dass sich hier Notizbuch "Zelle" auf einen Block von Python-Code innerhalb des Jupyter-Notebooks bezieht.
  2. Bereiten Sie die Daten vor. Dieser Algorithmus verwendet das Visualisierungs-Toolkit (VTK), um den Z-Stack und dreidimensionale Daten17zu manipulieren und anzuzeigen.
    1. Platzieren Sie die bereitgestellte . XLSX-Datei ("Experiment Tracker.xlsx") im gleichen Windows-Ordner wie das Jupyter-Notebook. Die Datei verfolgt Experimente und Schnittstellen mit dem Jupyter-Notebook. Platzieren Sie die ND2-Datei aus Abschnitt 6 in einem Unterordner mit dem Namen "-Experiment_XXX-Konfokal"" unterhalb des Standorts des Jupyter-Notizbuchs. Zusätzliche Experimentordner können innerhalb hinzugefügt werden, indem Sie die "XXX" an die numerische ID anpassen, die neuen Ordnern zugewiesen ist.
    2. Beschriften Sie den ersten Experimentordner "Experiment_001" und die ND2-Datei "001.nd2". Konvertieren Sie zunächst die ND2-Bildgebungsdatei in eine genähte TIFF-Datei mit mehreren Bildern, die durch den Farbkanal getrennt ist. Führen Sie die Notizbuchzelle unter dem Titel "Lesen Sie den konfokalen z-Stack in den Speicher" mit der Save_tiff_from_ND2 () Funktion unkommentiert30aus. Die ND2-Datei ist ein proprietäres Imaging-Format von Nikon, daher ist es notwendig, es in ein Format zu konvertieren, mit dem Open-Source-Software kompatibel ist.
      HINWEIS: Das TIFF (Tag Image File Format) wird verwendet, weil es allgegenwärtig ist, 16 Bit kompatibel, leicht in VTK importiert werden kann und mehrere Bilder in einer einzigen Datei gespeichert werden können, was für Z-Stack-Images geeignet ist. Durch Ausführen der Notizbuchzelle wird ein Bild aus der ND2-Datei gelesen, Informationen der Farbe extrahiert und XYZ-Positionen speichern Sie dieses Bild dann in einem numpy Array gemäß einer vorgegebenen Struktur. Anschließend wird das Array als TIFF-Datei mit der Python-Bibliothek tifffile gespeichert.
  3. Konvertieren von Bilddaten in 3D-Modell
    1. Importieren Sie die TIFF-Datei mithilfe eines 3D-Renderings in VTK (vtkTIFFReader), um die Zellen zu visualisieren (Abbildung 2). Wählen Sie einen Schwellenwert basierend auf der Farbe der Zellen im Bild aus. Zur Verdeutlichung stellt das VTK-Objekt einen Pixelblock (X, Y, Z) im Raum (Volumen) dar, aber nur bestimmte Pixel (grün oder rot) stellen Zellen dar, der Rest sind Hintergrund oder Rauschen (schwarz).
    2. Legen Sie daher einen Opazitätsfilter auf das Volume fest, der den Hintergrund entfernt, um zu bestätigen, dass nur die Zellen übrig bleiben, was die Fluoreszenz übrig bleibt. Verwenden Sie dazu die Jupyter-Notebookzelle mit dem Titel "Opazitätswerte für jeden Mikroskopkanal ändern", indem Sie die Channel_alpha Wertvariablen (d. h. GFP_alpha) anpassen. Visualisieren Sie den Effekt mithilfe der Notizbuchzelle View a 3D rendering, um zu überprüfen, ob der Schwellenwert korrekt festgelegt ist.
    3. Speichern Sie die Deckkraftwerte in der Kalkulationstabelle, die im nächsten Schritt verwendet werden sollen. Konvertieren Sie die Volumendaten in einzelne 3D-Objekte, die jeweils eine Zelle im Bild darstellen, indem Sie eine Technik namens Marschwürfel31verwenden. Dieser Algorithmus extrahiert ein polygonales Netz einer Isooberfläche aus dreidimensionalen diskreten Skalarfeldern von Voxeln.
    4. Verwenden Sie den Deckkraftwert im Marching Cubes-Algorithmus, um jede Zelle vom Hintergrund zu trennen. Führen Sie diesen Schritt für alle fluoreszierenden Zellen aus, die in jedem Mikroskopkanal identifiziert werden, indem Sie Voxelbild in ein dreieckiges Netz konvertieren und als VTK-Datei im Notizbuch speichern.
  4. Einbau einer Ebene an die Membran
    1. Passen Sie eine Ebene an die Endothelbarriere an, indem Sie zuerst die Zellzentroide lokalisieren (Notebook-Zelle: Analysieren Sie den RFP-Kanal (Endothelbarriere)). Durchlaufen der Listennetze im Volume und Extrahieren der Regionen, die nicht über einen PolyDataConnectivityFilter verbunden sind, aus VTK. Berechnen Sie den Schwerpunkt jedes Netzes, und fügen Sie die Messung einer Liste von Zentroiden hinzu, die nach Netzen filtern, die zu groß oder zu klein sind (<50, >1000000 Voxel).
    2. Passen Sie eine Ebene an die Liste der Zentroide für die Endothelzellen mit einer Minimierung der Fehlermethode an (Notebook-Zelle: Anpassen einer Ebene an die RFP-Zentroide (Endothelbarriere)) ( Abbildung2, Abbildung 3)32. Überprüfen Sie die Passung der Ebene, indem Sie die Ebene und die Zentroide zeichnen, und passen Sie sie bei Bedarf manuell an (mit Theta, Beta und z), indem Sie die Notizbuchzelle mit dem Titel Visualize RFP-Zentroide und Ebenenanpassungausführen.
    3. Nachdem das Flugzeug ordnungsgemäß montiert wurde, speichern Sie die Normale des Flugzeugs in der Experiment Tracker-Datei . XLSX-Datei für die zukünftige Verwendung.
  5. Analysieren Sie die beschreibenden Merkmale einzelner Krebszellen für die folgenden Deskriptoren (Tabelle 1).
    HINWEIS: Wenn der Computer, der die Analyse durchführt, verzögert, ist eine Analyse mit hohem Durchsatz über Hochleistungsrechnen eine Option. Dieser Algorithmus ist auf Standard-Laptops für die Analyse einer kleinen Anzahl von Zellen nützlich, vtK ist jedoch nicht gut für eine große Anzahl von einzelkundigen Objekten geeignet (>1000). Daher ist es optional, den angepassten Algorithmus zu verwenden, um auf einem Hochleistungs-Computing-Cluster zu funktionieren. Dies ermöglicht eine schnelle Analyse von Experimenten mit vielen Zellen (Abbildung 2). Alle 7.5 wird durch Ausführen der Notebook-Zellen mit dem Titel Analysieren Sie die verbleibenden Mikroskopkanäle für phänotypische Deskriptoren und Lesen Sie in der Experiment_tracker Informationen und analysieren Sie die Kanäle, die vorhanden sind.
    1. Messen Sie die Extravasation der Krebszellen: Messen Sie nach der Charakterisierung der Endothelschicht mit einer Ebene das Volumen jeder Krebszelle, die durch die Membran gewandert ist. Schneiden Sie jede Zelle (boolesch), so dass das Netz unter der Membran gehalten wird und der Teil über der Membran entfernt wird33. Schließen Sie dann das offene Netz (vtkFillHoles).
      1. Berechnen Sie den normalen und den neuen Schwerpunkt des abgeschnittenen Netzes neu. Messen Sie das Volumen und die Position jeder abgeschnittenen Krebszelle für die Analyse. Das Volumen entspricht der Anzahl der Voxel, die die Netzfüllungen jeder einzelnen Zelle ausfüllen. Berechnen Sie den Abstand zwischen der Endothelebene und der Position jeder Krebszelle.
    2. Messen Sie den zellulären Phänotyp: Berechnen Sie die Morphologie jeder Krebszelle, indem Sie ihre Form, ihr Volumen und ihre Position berücksichtigen.
  6. Überprüfen Sie die Messungen und speichern Sie sie in einer Kalkulationstabelle oder einem Diagramm. Führen Sie die Notizbuchzelle mit dem Titel Überprüfen, ob Zentroide genau gemessen wurden, und es erscheint ein Rendern, das die zentroiden zeigt, die oben auf dem abgebildeten Volumen nach Zelltyp identifiziert wurden. Nachdem alle Experimente durchgeführt werden, exportieren Sie den vollständigen Datensatz als einzelne Tabellenkalkulationsdatei, indem Sie die Experimente eingeben, die durch ID in die Notizbuchzelle mit dem Titel Exportieren der Daten als einzelne Data.XLSX-Datei für die Variablenexperimente, die die angegebenen Experimentiads ersetzen, eingeschlossen werden sollen. Wenn Sie den abgeschlossenen Datensatz überprüfen, zeichnen Sie ihn mit der Notizbuchzelle "Entfernung extravasated strip plot. Das Diagramm wird in der Notizbuchumgebung angezeigt und in der Datei gespeichert.

8. Analysieren Sie die zugehörigen Eigenschaften mit Künstlicher Intelligenz

HINWEIS: Identifizieren Sie metastasierende phänotypische Funktionen mithilfe von Algorithmen für künstliche Intelligenz.

  1. Führen Sie die binäre Klassifizierung mit Orange gemäß dem schema in Abbildung 5 und Der ergänzenden Datei 3aus. Starten Sie Orange von einer zweiten Windows-Eingabeaufforderung aus, indem Sie "conda activate" gefolgt von "python -m Orange.canvas" eingeben und in der Eingabeaufforderung auf Neu klicken. Orange ist eine Drag-and-Drop-basierte Software, also ordnen Sie die Funktionen an, indem Sie jedes Element aus dem linken Menü auf die Leinwand ziehen, um der Zusatzdatei 3zu entsprechen. Nachdem dies abgeschlossen ist, doppelklicken Sie auf das Dateisymbol und wählen Sie die Datei Data.XLSX.
  2. Filtern Sie die Daten, um fehlerhafte Messungen zu entfernen, die als solche definiert sind, bei denen ein boolescher Vorgang fehlgeschlagen ist, oder um parametrische Variablenwerte außerhalb bekannter Grenzen mithilfe des Symbols "Zeilen auswählen" zu zuweisen. Doppelklicken Sie auf das Symbol, und legen Sie Bedingungen fest, die dem Filter entsprechen, z. B. "Sphericity liegt zwischen 0 und 1". Bedingungen für 8.2.1, 8.2.2 und 8.2.3.
    1. Filterabstand extravasierte Messungen im Bereich von -100-200 m.
    2. Filtern Sie Sphäritätsmessungen der Zellform bis zu 0-1.
    3. Filtern Sie Krebszellvolumenmessungen bis zu 0-2000 Voxeln.
    4. Verwenden Sie alle parametrischen Variablen (Tabelle 1), um das Hirnmetastasierende MDA-MB-231-BR-GFP und das nicht-hirnmetastasierende MDA-MB-231-GFP zu klassifizieren. Doppelklicken Sie auf das Symbol Spalten aus dem Canvas auswählen. Verwenden der Schaltfläche > zum Verschieben verfügbarer Variablen in Features, Zielvariablenoder Metaattribute. Die einzige Variable, die eine Zielvariable sein sollte, ist eine metastasierende Bezeichnung, die definiert, ob Zellen im Datensatz als metastasiert (1) oder nicht (0) betrachtet werden. Experimentvariablen können im Abschnitt Metaattribute platziert werden.
  3. Beispiel für eine Schulung (80%) und Testsatz (20%). Doppelklicken Sie auf das Daten-Sampler-Symbol, und aktivieren Sie einen Sampling-Typ des festen Datenanteils: Stellen Sie auf 80 % fest, und aktivieren Sie die Kontrollkästchen reproduzierbar und stifizieren. Stratify und Cross-Validieren des Trainingssatzes mit 10 Falten gegen jedes Modell/Klassifier. Doppelklicken Sie auf Test & Score und wählen Sie Kreuzvalidierung mit Anzahl der Falten: auf 10 und Stratified aktiviert. Legen Sie die Zielklasse auf 1fest.
  4. Verwenden Sie bei dieser Methode neuronale Netzwerke und Lernalgorithmen für random Forest, da sie für die Daten robust sind. Wählen Sie im Symbol "Zufallswald" die Anzahl der Bäume aus, die 50 sein sollen, und wählen Sie keine anderen Optionen aus. Wählen Sie innerhalb des Neuronen-Symbols Neuronen pro verstecktem Layer: 100, Aktivierung: ReLu, Solver: Adam, Alpha: 0.0001und Max Iterationen: 200. Diese Einstellungen variieren jedoch erheblich je nach Studie und sollten vor der Anwendung gut verstanden werden.
  5. Nachdem Sie den Canvas-Bereich eingerichtet haben, doppelklicken Sie auf jedes Symbol aus Datei auf Beispieldaten, und klicken Sie entweder auf Anwenden oder Senden von Daten. Doppelklicken Sie auf Test & Score und die Trainingsdaten beginnen, ein Modell mit den Algorithmen zu entwickeln. Nach dem Training des Machine Learning-Modells öffnen Sie Test & Score erneut und wählen Sie Test on Test Data aus, und schließen Sie das Popupfenster, um die Leistung des Modells zu bewerten, indem Sie die Zellen im Chip entsprechend der Wahrscheinlichkeit klassifizieren, dass sie gehirnmetastasiert von 0 bis 1 sind.
  6. Speichern sie die Leistung des Machine Learning-Modells in einer Datei (Tabelle 2). Schließen Sie den Bereich unter der Kurve (AUC) des ROC, die Genauigkeit und den F1-Score ein. Speichern Sie eine zweite Datei, die die einzelnen metastasierenden Indizes und Klassifizierungswahrscheinlichkeiten enthält. Doppelklicken Sie auf das Symbol Speichern und klicken Sie auf Speichern unter, um die Klassifizierungswahrscheinlichkeiten zu speichern. Ebenso kann die ROC-Kurve durch Doppelklicken auf das SYMBOL ROC-Analyse angezeigt werden und die Modellleistung kann durch Doppelklicken auf das Symbol Confusion Matrix berechnet werden.

Ergebnisse

Mit dieser Technik analysierten wir Zelltypen, die mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen oder Farbstoffen gekennzeichnet sind. Wir demonstrieren die Verwendung dieses Ansatzes mit einem mit hCMEC/D3-DsRed und nicht fluoreszierenden Astrozyten formulierten SmBBN-Chip. Die mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns wurden auf eine poröse Membran (5 m Track geätzte Poren) gesät und in einem Inkubator34 bei 37 °C unter 5%CO2platziert. Nach drei Tagen wurde die Konfluenz der Endo...

Diskussion

Wir haben eine neue Methode entwickelt und vorgestellt, die Werkzeuge anpasst, die häufig in klinischen bildgebenden Analysen zur Messung der Extravasation und Migration von Krebszellen durch eine Endothelbarriere in das Hirngewebe verwendet werden. Wir stellen dar, dass dieser Ansatz sowohl für In-vivo- als auch für In-vitro-Messungen nützlich sein kann; wir haben seine Verwendung auf einem 3D-Mikrofluidsystem demonstriert, das die Gehirnvaskulatur rekapituliert. Krebszellmessungen, einschließlich extravasierter En...

Offenlegungen

Es gibt keine Angaben zu erklären.

Danksagungen

Wir danken dem Steeg Lab am National Cancer Institute für die großzügige Spende von MDA-MB-231-BR-GFP Zellen. Die konfokale Mikroskopie wurde am University of Michigan Biointerfaces Institute (BI) durchgeführt. Die Durchflusszytometrie wurde an der University of Michigan Flow Cytometry Core durchgeführt. Virale Vektoren wurden von der University of Michigan Vector Core erstellt. Wir danken auch Kelley Kidwell für die Anleitung bei der statistischen Analyse dieser Daten.

Finanzierung:

C.R.O. wurde teilweise von einem NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) und 1R21CA245597-01 unterstützt. T.M.W. wurde teilweise von 1R21CA245597-01 und dem National Center for Advancing Translational Sciences der National Institutes of Health unter der Award-Nummer UL1TR002240 unterstützt. Die Finanzierung von Materialien und Charakterisierung wurde von National Cancer Institute of the National Institutes of Health unter der Auszeichnung Nr. 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation und der Breast Cancer Research Foundation bereitgestellt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht notwendigerweise die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTA with phenol redThermo Fisher Scientific25200056
1.5 mm biopsy punch with plungerIntegra LifeSciences Corporation33-31A-P/25
10x MEMThermo Fisher Scientific11430030
150 mm petri dishesFisher ScientificFB0875714
1x DPBS, without Ca and MgThermo Fisher Scientific14190144
200uL pipette tipFisher Scientific02-707-411
4 inch silicon waferUniversity Wafer452
48 mm wide packing tapeFisher Scientific19-072-097
50 x 75 mm glass slideFisher Scientific12-550C
A1 confocal microscopeNikon
acetoneFisher ScientificA9-20
antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin)Gibco15240062
box cutter bladeFisher ScientificNC1721575
dissection scissorsFisher Scientific08-951-5
DMEM with 4.5 g/L glucoseThermo Fisher Scientific11960-044
double sided tapeFisher ScientificNC0879005
EGM-2LonzaCC-3162
Fetal Bovine Serum, Heat inactivatedCorningMT35011CV
Fiji softwareImageJ
glass vialFisher Scientific03-341-25D
glutamaxThermo Fisher Scientific35050061
hCMEC/D3EMD MilliporeSCC066
Jupyter notebookAnaconda
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030081
Matrigel - growth factor reduced with phenol redCorningCB-40230A
MDA-MB-231ATCCHTB-26
MDA-MB-231-BR-GFPDr. Patricia Steeg, NIH
N-2 growth supplementThermo Fisher Scientific17502048
normal human astrocytes (NHA)LonzaCC-2565
Orange softwareUniversity of Ljubljana
Pasteur pipetteFisher Scientific13-711-9AM
Photolithography masksPhotosciences Incorporated
pLL3.7-dsRedUniversity of Michigan Vector Core
pLL-EV-GFPUniversity of Michigan Vector Core
pLOX-TERT-iresTKAddgene12245
pMD2.GAddgene12259
polycarbonate membrane, 5um pore sizeMilliporeTMTP04700
psPAX2Addgene12260
PureCol, 3 mg/mLAdvanced Biomatrix5005Type I bovine collagen
sodium bicarbonateThermo Fisher Scientific25080094
sodium pyruvateThermo Fisher Scientific11360070
Solo cupFisher ScientificNC1416545
SU-8 2075MicroChem CorporationY111074 0500L1GL
SU8 developerMicroChem CorporationY020100 4000L1PE
Sylgard 184Ellsworth Adhesive CompanyNC0162601
TolueneSigma-Aldrich179965-1L
Tricholoro perfluoro octyl silaneSigma-Aldrich448931-10G

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