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要約

この原稿では、高フラックス同位体リアクター(HFIR)CG-1Dビームラインを使用して、ラット大腿骨、マウス肺、および草本植物の根/土壌システムの金属インプラントを測定するための中性子ラジオグラフィーおよび生体サンプルのコンピューター断層撮影のプロトコルについて説明しています。

要約

中性子は歴史的に、小角中性子散乱、中性子スピンエコー、回折、非弾性散乱などの技術を採用した幅広い生物学的用途に使用されてきました。逆数空間で情報を得る中性子散乱技術とは異なり、減衰ベースの中性子イメージングは、数十マイクロメートルオーダーで分解された実空間で信号を測定します。中性子イメージングの原理は、ランベルトベールの法則に従い、サンプルを通るバルク中性子減衰の測定に基づいています。より大きな減衰は、生物学的サンプルの主要な成分であるいくつかの軽元素(特に水素)によって示されます。重水素、ガドリニウム、またはリチウム化合物などの造影剤は、光学画像、磁気共鳴画像法、X線、陽電子放出断層撮影法などの技術を含む医用画像で行われるのと同様の方法でコントラストを高めるために使用できます。生物学的システムでは、地下の植物の根ネットワークの複雑さ、土壌との相互作用、およびその場での水フラックスのダイナミクスを調査するために、中性子ラジオグラフィーとコンピューター断層撮影がますます使用されています。さらに、軟部組織や骨などの動物サンプルのコントラストの詳細を理解するための努力が検討されています。本稿では、試料調製、計測、データ取得戦略、高フラックス同位体炉CG-1D中性子イメージングビームラインを用いたデータ解析など、中性子バイオイメージングの進歩に焦点を当てています。前述の能力は、植物生理学(草本植物/根/土壌系)および生物医学的用途(ラット大腿骨およびマウス肺)における例の選択を使用して説明されます。

概要

中性子ラジオグラフィー(nR)の原理は、中性子が通過する物質を介した中性子の減衰に基づいています。原子の電子雲によって散乱されるX線とは異なり、中性子はその原子核によって吸収または散乱することができます。中性子は水素(H)などの軽元素に敏感であり、その結果、動物1,2,3,4,5,6,7またはヒト組織8,9および地下土壌/根系10,11,12,13,14などの生物学的用途をX線撮影するために使用できます。、15。中性子イメージングは、重元素を検出することができるX線イメージングを補完する技術です16,17,18。減衰ベースのnRは、透過ビームが材料の量と材料を通る経路長に正比例するというベール・ランベルトの法則で説明されているように、サンプル内の材料の線形減衰係数とサンプルの厚さによって支配されます。したがって、透過率Tは次のように計算できます。

figure-introduction-1027(1)

ここで、I 0およびIは、それぞれ、入射ビーム強度および透過ビーム強度である。μとxはそれぞれ線形減衰係数と均質なサンプルの厚さです。減衰係数μ次式で与えられます。

figure-introduction-1274(2)

ここで、σはサンプルの中性子減衰断面積(散乱と吸収の両方)、ρはその密度、NA はアボガドロ数、Mはそのモル質量です。

低エネルギー中性子(すなわち、0.5eV未満のエネルギー)を用いた生物学的試料のX線撮影におけるコントラストは、主にHの密度の変化によるものである(一定の試料厚さの場合)。これは、中性子とH原子核との相互作用の確率が生物学的サンプルに存在する他の原子核よりも大きいこと、およびH原子の密度が生物学的サンプル中に最も豊富な原子であるため最も重要であるという事実によるものです。

初期の段階から、nRおよび中性子コンピュータ断層撮影(nCT)は、材料および工学用途に広く使用されてきました19,20,21,22,23。生物学的サンプル中のHに対する中性子感受性の最初の実証実験は、1950年代半ばに始まりました24植物標本の測定から。この研究は、例えば、酸化ガドリニウム(Gd2O3)などの造影剤の使用が探求されたヒト胸部25またはラット26のX線撮影で1960年代まで続いた。さらに、ヒト腫瘍組織と正常組織のコントラストは、H含有量の局所的な増加によるものであるという仮説が立てられました。これらの最初の試験では、中性子束と空間分解能の増加によりnRの品質が向上し、産業または生物医学的用途の補完的な技術としての人気が高まる可能性が高いと結論付けられました。最新の研究は、生物医学的および法医学的用途のために、癌組織標本1および動物臓器の切片2、3、27に対して実施されたnRおよびnCT測定で構成されています。

テネシー州オークリッジのオークリッジ国立研究所にある高フラックス同位体原子炉(HFIR)は、核分裂反応によって中性子を生成する強力な中性子源です。これらの中性子は2MeV程度のエネルギーを持ち、重水との運動反応によって原子炉プール内で「冷却」され、100〜300eVのオーダーのエネルギーに達します。散乱であれイメージングであれ、中性子実験の最適化は、中性子源とそのビーム強度、エネルギー分布、バックグラウンド(高速中性子、遅延中性子、ガンマ線)の影響などのビームラインの特性を理解することから始まります。イメージングビームラインが配置されているHFIRコールドガイドホールでは、液体H減速材との運動学的相互作用によって中性子がさらに「冷却」されます。その後、それらは線源の視線から離れた湾曲したガイドシステムで輸送され、高速中性子とガンマ汚染を排除します。図1に示すように、CG-1D中性子イメージングビームライン28,29はコールドガイド上に置かれており、中性子エネルギー範囲は数meVから数十eV(この場合、対応する使用可能な中性子波長は0.8〜10Åの範囲)の範囲で変化し、磁束は107 n /(cm2∙s)をサンプル位置に置く。電動アパーチャ/ディフューザーシステムは、イメージング機器のピンホール形状を定義します。中性子は、両端にアルミニウム(Al)窓を備えたヘリウム(He)で満たされた飛行管内で6.59mの距離を移動します。フライトチューブは、ビーム強度の損失が最小限になるように空気散乱を制限しながら中性子を輸送するために使用されます。この原稿に記載されている測定のために、ディフューザーは、Al容器に包まれた厚さ1mmの50nmの酸化アルミニウム(Al2O3)ナノ粉末でできている。ディフューザーは、中性子ガイド(イメージングビームラインのピンホール形状によって拡大される)から来るビームアーチファクトを低減し、そうでなければ、X線写真に鋭い水平および垂直強度の変動が見られ、データの正規化が困難になります。  ここに示す実験では、厚さ25μmのフッ化リチウム6リチウム/硫化亜鉛蛍光体(6LiF/ZnS:Ag)を使用して中性子を光に変換します。

コリメーションの最適化は、サンプルから検出器までの位置、必要な空間分解能、および取得時間によって異なります。サンプルがシンチレータから数cm離れた場所にある場合、高いコリメーション(L / Dが800を超える場合、Lは直径Dのピンホール開口部と検出器からの距離)により、中性子束を犠牲にして空間分解能が向上します。低いコリメーション(L/D 800未満)は、時間分解能が空間分解能よりも優先される場合のin situダイナミックスタディに適しています。本稿で紹介した測定では、L/Dと空間分解能はそれぞれ約355μmと75μmでした。時間分解能は、信号対雑音比(SNR)に基づいて変化しました。サンプルは、ぼやけなどの幾何学的歪みを低減するために、シンチレータにできるだけ近づけて配置しました。平行移動ステージと回転ステージを使用して、サンプルを検出器の近くにセットし、コンピューター断層撮影(CT)を実行できます。CG-1Dは、画素ピッチ13.5μmの2048画素×2048画素の電荷結合素子(CCD)、画素ピッチ6.5μmの2560画素×2160画素の科学用相補型金属酸化膜半導体(sCMOS)検出器、画素サイズ55μmの512画素×512画素のマイクロチャンネルプレート(MCP)検出器30,31の3種類の検出器を提供しています。散乱した中性子は~5mm厚のホウ素ゴムで吸収され、検出器チップが中性子を見るのを防ぎます。この吸収は、ホウ素ゴムと検出器の間に配置された鉛(Pb)によって止めることができるガンマ線を生成します。各検出器は、異なる視野(FOV)と空間分解能、時間分解能に最適化されています。ラット大腿骨とマウス肺の測定には、CCD検出器がその大きなFOV能力(~7 cm x 7 cm)と約75μmの合理的な空間分解能のために利用されました。植物の根/土壌システムのnCTは、FOV(~5 cm x 4.2 cmに制限)を犠牲にしてできるだけ早くnCTを取得することが目標であったため、sCMOSで実行されました。したがって、空間分解能は明らかに損なわれました。これらの検出器では、中性子は検出目的で光またはアルファ粒子に変換されます。サンプルを垂直軸を中心に回転させ、連続した回転角度でX線写真を取得することで、nCTを取得できます。調査中のサンプルの3次元体積レンダリングモデルは、社内のiMARS3D PythonベースのJupyterフィルターバックプロジェクション(FBP)ノートブック、pyMBIR、または商用ソフトウェアを利用して取得されます。

最後に、試料や検出器と相互作用していない中性子は、バックグラウンドノイズを最小限に抑えるために、検出器システムから約1m下流のビーム停止位置に収集されます。CG-1Dビームストップは、幅0.75m、高さ0.5m、厚さ35mmで、エポキシのB4Cで作られています。ビームストップは、中性子ビームが当たる耐火エポキシの10mmの95%濃縮炭酸リチウム(6 Li2CO3)で補強され、6Li、鉛(Pb)、および鋼で裏打ちされた空洞は、高率の二次ガンマ線を含むように設計されています。ビームストップは、ビームラインの鋼製シールド壁に直接取り付けられています。CG-1Dビームラインの写真を図2に示します。

3つの再構成ソフトウェアを使用して、3つの実験データをそれぞれ3Dで再構築しました。マウス肺サンプル再構成は、FBPを利用する市販の再建ソフトウェアであるOctopus32を用いて行った。OctopusソフトウェアはサーバーPC上に設置され、ビームラインで収集されたデータを再構築するために使用できます。iMARS3Dという名前の再構成ソフトウェアは、CG-1Dで入手できます。これは、オープンソースコードTomoPY33に基づいており、自動傾斜補正、後処理フィルタなどの機能が追加されています。iMARS3Dには、データの前処理(バックグラウンドとノイズの減算)、トリミング、メディアンフィルタリング(ガンマストライクとドット抜けの補正)、自動ビーム強度変動補正、サンプルチルト補正が含まれます。シノグラムが作成されたら、リングアーチファクトの除去や平滑化などのさらなるデータ処理がオプションです。再構築のさまざまなステップは解析サーバーに保存され(後で提案の共有フォルダーに移動されます)、最終的な2Dスライスはすぐに提案の共有フォルダーに保存されます。ラット大腿骨はiMARS3Dを用いて再建した。植物の根/土壌サンプルは、TomoPYを使用してデータを中央値フィルタリングし、その後PythonのSciPyライブラリを使用して傾斜軸補正することによって前処理されました。 再構成は、ベースラインFBPから高度なモデルベースの反復再構成技術35までの一連の断層撮影アルゴリズムを実装する、社内で開発されたPythonパッケージを使用して実行されました-pyMBIR(ASTRAツールボックス34のカーネルを使用して構築)非常にまばらでノイズの多い中性子データセットから高品質の再構成を取得できます。前述の再構築ツールに基づいてレンダリングされたすべてのボリュームは、減衰コントラストで表されます。すべての視覚化は、市販の視覚化、セグメンテーション、およびデータ分析ソフトウェアパッケージAMIRA36を使用して実行されました。

本稿は、HFIR CG-1Dビームラインにおける中性子イメージング(nRおよびnCT)の利用手順を実証することを目的としています。この研究はまた、生物学的サンプル、特にマウスの肺、ラットの骨、および植物の根/土壌システムに対する現在の最先端のnRおよびnCT機能を示しています。マウスの肺は、肺組織を測定するための中性子の相補性を説明するために選択されましたが、X線は主に骨に敏感です。ラット大腿骨である骨サンプルにはチタン(Ti)インプラントがあり、骨と金属のコントラストと、骨と金属の界面を見る機会がありました(金属はそれらを強く減衰させるため、X線で測定することは困難です4)。最後に、植物の根水システムは、その場で根/土壌システムを測定するためのnCTの3次元(3D)機能を示しています。さらに、生物学的サンプルにnRを使用することの利点/欠点を示します。明らかに、この方法は、植物の根系における水動態を測定するために安全に使用できるが、放射線被曝に関連するリスクのために生きた動物またはヒトの画像技術と見なすことができず、したがって、研究を(死んだ)マウスまたは病理学のような測定のいずれかに限定し、例えば、組織サンプルを患者(動物またはヒト)から切除し、中性子ビームで測定する前に固定することによって調製する。

プロトコル

1.機器のセットアップ(図3のセクション 3を参照)

  1. ビームラインコンピュータでターミナルウィンドウを開き、 cssと入力し、 Enter キーを押してユーザインタフェースを起動します。
  2. デフォルトで開いていない場合は、[メニュー]タブの[ユーザーホーム]オプションを選択して、実験物理学および産業用制御システム(EPICS)イメージングインターフェイスを開きます。
  3. インターフェースの最初のタブ(提案/カメラ/SEデバイス)から、カメラ/検出器の横にある光学系ボタン、つまりスリットボタンをクリックしてピンホール開口サイズとスリットシステムの開口部をクリックしてビームライン光学系を選択します。
  4. サンプルを配置するXYステージに回転ステージをボルトで固定し、検出器(sCMOSまたはCCD)を配置します。
    1. CCDまたはsCMOS検出器は、装置チームと相談して、希望の空間分解能と焦点距離を提供する倍率のレンズを選択してください。最初に光を使用して、検出器をミラーに近づけたり遠ざけたり、検出器の固定位置でレンズを手動で調整したりして、カメラの焦点を合わせます。中性子シンチレータの位置で画像の焦点を合わせます。
    2. CCDまたはsCMOS検出器の場合、検出器シンチレータに対して配置された中性子吸収分解能マスク37を用いて、中性子でレンズ焦点を微調整する。異なる設定(つまり、EPICで検出器モーターを動かすことによって自動化されたミラーからの異なる 検出器 位置)を使用して連続したX線写真を収集します。
    3. ImageJ/Fiji39または同様の画像ソフトウェアツールでラインペアを評価して、X線写真を比較します。
  5. 必要に応じて、サンプルを適切な容器(Al容器および/またはAlヘビーデューティーフォイル)に固定し、検出器のできるだけ近い回転ステージにサンプルを置きます。中性子(ホウ素ゴム)とガンマ(Pbレンガ)シールドを使用して検出器と機器をシールドします。
  6. サンプルと検出器の距離を測定し、サンプルを除去します。これを解像度マスクに置き換えて、このビームライン構成のサンプル位置のピクセルサイズを評価します。既知の特徴寸法を使用して、特徴全体のピクセル数を評価し、ピクセルサイズを決定します。
  7. 回転ステージ上にサンプルを再配置します。
  8. EPICインターフェースと サンプルの整列 タブを使用して、サンプルが検出器の全景になるまで移動している間に連続して高速(ミリ秒から1秒)のX線写真を撮影することにより、サンプルを中性子ビームに合わせます。サンプル アライメント ファイルを .csv ファイルとして保存し、CT スキャンを開始する前に再利用します。
  9. CTスキャンを開始する前に、自動CTアライメントチェックオプション(アライメントタブ)を使用して、ビームを使用して異なるサンプル向きで生成されたX線写真を評価することにより、サンプルがさまざまな角度で視野にとどまっていることを確認します。

2. 試料作製とデータ取得戦略

注:動物サンプルプロトコルは、テネシー大学の施設動物管理および使用委員会によってマウス肺について承認され、ラッシュ大学医療センター施設動物管理および使用委員会によってラット大腿骨について承認されました。

  1. ラット大腿骨
    1. Ti6Al4Vロッド(直径1.5 mm、長さ15 mm)を雄のSprague-Dawleyラットの大腿骨に移植し、遠位大腿骨顆を介して髄内腔内に配置します。
    2. 12週間後にラットを犠牲にし、大腿骨を収穫します。すべての軟組織(中性子減衰に寄与する)を取り除き、生理食塩水に浸したガーゼにインプラントを入れて大腿骨を凍結します。2インチ四方のガーゼスポンジをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に完全に沈め、各サンプルをこれらの浸漬スポンジで完全に包みます(材料の表を参照)。
    3. X線ベースのマイクロCTスキャン38のために大腿骨を室温まで解凍してから、凍結状態でHFIRに輸送する。
      1. nCTの前に、サンプルを再解凍し、CG-1D中性子イメージングビームラインの近くにあるHFIRバイオハザード安全レベル2(BSL2)ラボで室温にします。室温になったら、サンプルを頑丈なAlホイルで包み、Alシリンダーに入れます。
      2. ビームラインの回転ステージ上に円筒を垂直に配置し、ビームラインの大腿骨を0〜360°の室温でステップ角0.25°でスキャンします。各X線写真を50秒間取得します。
        注:回転ステージの移動とCCDからデータ収集コンピューターへの各X線写真の転送のデッドタイムを考慮すると、スキャンの合計時間は約24時間でした。
    4. nCTが完了し、サンプルをビームラインから取り出すことが承認されたら、サンプルをBSL2ラボに持ち帰り、格納容器を取り外し、サンプルを再凍結して、さらなる実験測定のために保存します。
  2. マウスの肺
    1. この研究とは関係のない実験に使用された死んだマウスからの肺組織を切除します。中性子実験の前に、サンプルを70%エタノールの溶液に固定します。
    2. 組織を頑丈なAlホイルで包み、BSL2ラボからCG-1Dビームラインに直接輸送します。サンプルをAlシリンダーに挿入して二重封じ込めを行い、nCTスキャン中にビーム内のサンプル位置を維持します。
    3. サンプルをCCDの近くに置き、室温で一晩スキャンを実行します。
      注:各X線写真は150秒で、回転ステッピング角度は0.5°、0〜182°でした。スキャンの合計時間は約16時間でした。
  3. 草本植物の根/土壌系
    注:他の生物学的サンプルと同様に、植物-土壌システムは、水素、特に土壌または植物の根の水分の強い減衰のためにサイズが制限されます。種子またはラメットを容器(Alまたは石英-どちらも中性子減衰断面積が低い)に植えるか、またはより成熟した植物を容器に移植することができる。
    1. 敷地内で栽培されている地元のハーブを注意深く発掘して移植します(ここでは、桑の雑草(Fatoua villosa (Thunb。中井)を断面2.38cm×2.58cm、高さ6.3cm、肉厚0.055cmのAl容器に入れ、純砂(SiO2)を入れた。
    2. 植物の根を脱イオン水ですすぎ、湿った砂のスラリーを容器に入れながら、Al容器内に慎重に陳列します。
      注:容器に土を充填する場合、乾燥した土は粒子サイズによって分離し、容器にテクスチャーアーティファクトを作成するため、湿った土を使用することが重要です12,13。
    3. 植え付け後、植物システムの飽和重量を測定し、毎日植物システムの重量を測定して水の使用率を評価します。チューブまたはシリンジを使用して、土壌の上面に、または容器の底にあるポートまたは穴から水を適用します。
      注:ここでは、プラントシステムをはかりに配置し、重量に基づいて毎日の水使用量を置き換えるために、毎日上部に水を適用しました。イメージングの前に水を差し控えて、土壌水分量を減らし、根のコントラストを高めることができます。
    4. 温度と光が制御されたオンサイト成長チャンバーで植物システムを伝播します12。イメージングの前に1週間植物システムを維持し、Alコンテナへの植物の根の順応を可能にします。
      注意: イメージングが開始されたら、植物に水をかけないでください。
    5. nCTスキャンをそれぞれ~1.75時間で実行し、2.5日間にわたって継続的にスキャンして、土壌と植物の水分含有量の動的な3D変化をマッピングします。これらの測定では、空間分解能を数百μmに下げて、時間分解能を優先します(つまり、各投影の取得時間を短縮します)。
      注:各CTスキャンは、0.93°の回転角度と投影あたり10秒の取得時間で実行されました。この原稿の目的上、最初のCTスキャンのみが提示されます。

3. データ取得

注:CG-1Dのデータ収集システムは、EPICソフトウェア40を利用しています。EPICは、実験プロトコルをガイドし、人為的ミスを最小限に抑えるために開発されました。このインターフェースは、 図3に示すように、サンプルを測定する前に必要なさまざまなステップを論理的にステップスルーします。 EPICデータ集録プロトコルは以下の通りです(図3)。左側のセクションには、進行中の実験のステータスと、運動位置と実験の詳細(サンプル情報、提案番号、チームメンバー)が表示されます。各実験は、提案番号と 1 つまたは複数のサンプルに関連付けられています。チームメンバーや選択したサンプル名などの提案情報も右側に表示されます(「提案/カメラ/サンプル環境デバイス」という名前の最初のタブ)。中央のセクションは、側面にダイナミックレンジスケールバーが付いた現在のX線写真と、画像の下のステータスとログ情報で構成されていました。

  1. [プロポーザル/カメラ/SE デバイス] というタイトルの最初の [エピック] タブを選択します。[提案の切り替え] または [サンプル] ボタンをクリックします。前のタブを置き換えた提案リスト(左)とサンプル(右)で測定するプロジェクト番号とサンプルID#を選択します。
  2. 戻る矢印を使用して、メインの EPICS インターフェイスに戻ります。カメラ/検出器オプションリストで使用可能な4つの検出器(Andor CCD、Andor sCMOS、SBIG CCD、またはMCP)のいずれかを選択して、使用する検出器(sCMOSまたはCCD)を選択します。
    注:SBIG CCDは装置によるテストに使用され、現在の原稿では無視できます。
  3. [ サンプル環境デバイス ] セクションで使用する回転ステージを選択します。
    1. まず、サンプル環境デバイスリストの回転ステージ(CTスキャン)をクリックします。次に、回転ステージの1つ(スキャンするサンプルに対応)を選択します。
  4. 最後に、タブの下部で、 データ収集モードを選択します。この場合、最初のオプションである ホワイトビームを選択します。
    注:取得モードは、中性子波長の全範囲を取る白色ビームまたはCG-1Dビームラインでの単色のいずれかです。
  5. [サンプルの配置] というタイトルの 2 番目の [エピック] タブを選択します。サンプル ファイル名を入力し、Enter キーを押します。サブフォルダ名に対してこのプロセスを繰り返します。
    注:EPICインターフェースは、社内の再構成ソフトウェアが調査中の3Dオブジェクトの2次元(2D)スライスを生成するために使用する適切な実験ディレクトリにデータを自動的に保存するようにプログラムされています。2番目のタブである Align Sampleでは、X線写真は後でデータ処理や分析に使用されないため、数秒でサンプルをアライメントできます。すべてのモーターが適切に配置されると、それらの位置を.csvファイル形式で保存できます。したがって、各サンプルアライメントには対応する.csvファイルがあり、後でCTスキャンのためにサンプルを配置するためにコールバックできます。
  6. 3つのモーターの位置合わせをスキップします。つまり、サンプルが整列してCTの準備ができていると仮定します。 目的の取得時間を選択し、[ クイック画像の撮影 ]ボタンをクリックします。取得時間の異なる一連のX線写真を収集して、SNRを評価します。
  7. 画像を開くJ/フィジー;さまざまなX線写真をドラッグアンドドロップします。サンプルからオープンエリアへのプロファイルをプロットします。SNR を評価します。
  8. XYステージに複数のサンプルを設定している場合(1サンプルに対して複数の回転ステージ)、アライメント後の各サンプル位置を記録し、ファイルに保存ボタンをクリックしてデータを.cvsファイルとして 保存 します。
  9. [データの収集] というタイトルの 3 番目の [エピック] タブを選択して、CT スキャン パラメーターを設定します。書き込み可能な最初の行にファイル名を入力し、Enter キーを押します。サブフォルダ名についても繰り返します。
    注: [データの収集] タブのレイアウトは、最初のタブで一連の経過時間経過X線写真 (SE なし) または CT スキャン (回転ステージの選択) の選択によって異なります。
  10. [保存されたファイルを使用してサンプルを位置合わせ]セクションで、以前にサンプルモーターの位置を記録したファイルを選択します(手順1.8)。[最近保存したファイル]を使用して、最近保存したサンプル アライメント ファイルを参照します。[ファイルを使用して整列]をクリックして、サンプルを中性子ビームの元の位置に戻します。
  11. ナイキストのサンプリング定理に基づいてCTに必要な投影の数を計算します。サンプルの水平方向の寸法全体のピクセル数を計算し、1.5を掛けて、ナイキストのサンプリングを満たすために必要な投影の数を取得します。
  12. 各画像の回転開始角度(通常は0°)、回転終了角度(通常は180°)、回転ステップサイズ、ステップあたりの画像数(通常は1に設定)、および各画像の露出時間を入力します。[データの収集]ボタンをクリックしてCTスキャンを開始します。

4. ボリュームの再構築とデータ処理/分析

注:データの正規化、再構築、および分析のためのすべてのCG-1Dソフトウェアツールは、ORNLファシリティのPythonリポジトリおよびファシリティの分析サーバーで利用できます。2D測定の場合、Jupyter Pythonノートブック41を使用して前処理を行うことができます。ノートブックの図を 図 4 に示します。ビーム変動を1(または100%)透過に正規化するために使用されるサンプルの外側の関心領域を選択する前に、データをロードしてプレビューできます。これらのノートブックは各測定に適合させることができるため、前処理が簡単になります。さらに、サンプル内の速度論的変化(すなわち、サンプル中の水分吸収)を経時的に追跡するなど、同じノートブックで2D分析を実行できます。

  1. ユーザー名とパスワードを使用して Linux 分析サーバーにログオンします。Web ブラウザーを開き、「 jupyter.sns.gov」と入力します。
  2. iMARS3D という名前の python Jupyter ノートブックを開きます。コードの最初の数行を実行します(iMARS3Dの実行に必要なツールをロードします)。データ、フラット、ダークフィールドをロードします。3 つのデータ・セットがすべて正しくロードされていることを確認します。
  3. データのトリミング、フィルタリング(必要に応じて)、正規化(自動サンプル傾き補正を使用)、および体積再構成(長いプロセス)を続行します。 Sharedという名前のプロジェクト番号フォルダにデータを保存します。施設解析サーバでも利用可能なAMIRA36をオンにした後、再構築したスライスをソフトウェアにロードし、可視化、フィルタリング、解析を進めます。

結果

図5Aは、測定されたものと同様のサイズの代表的なラット大腿骨の写真である。図5B、Cは、Tiインプラントを用いたラットの大腿骨のnCTを表す。図5Bは大腿骨の偽色減衰ベースのnCTを示し、図5Cは図5Bと同じ向きで骨を斜めに切り取ったものを表し、X線医療用CTに似たTiインプラント(グレースケール)を明らかにします。このインプラントは、骨材料ほど中性子と相互作用しません。したがって、その減衰は最小限であり、周囲の骨よりも暗く(つまり、減衰が少ない)ように見えます。大腿骨の髄質腔内に存在する骨梁は、サンプルの近位端にはっきりと見えます(図5Bの赤い矢印)。

図6A、Bは、軟部組織標本を検出する中性子の能力を実証するためにnCTに使用された、2つの異なる位置でのエタノール固定マウス肺の代表的な写真を示す。nCTから得られたマウス肺の再構築容積を図6C、Dに示し、図6A、Bと同様の様式で位置付ける。肺の右葉を通る切断を図6Eに示します。サンプルのサイズが比較的小さいにもかかわらず、中性子感度は、~75μmの空間分解能で肺の構造を検出することによって明確に実証されています。予想通り、肺は空気を含むスポンジ状の構造をしているため、減衰の範囲は非常に広く、大部分は低から中中性子の減衰に対応します。

図7Aは植物サンプルの写真を示し、図7Bは長方形のAl容器内の植物の根/土壌システムの偽色の体積レンダリングを表しています(Alは中性子に対してほとんど透明であるため見えません)。以前のデータセットと比較して、2.5日間にわたって根の水分取り込みの動的な動きを追跡するためにデータがより速く取得されたため、SNRは予想通り貧弱です。したがって、各CTスキャンは、~1.75時間のウィンドウ内で測定されるように最適化されました。SNRが低いにもかかわらず、土壌中の根系は、図7C、Dに偽色で表示されたサンプルの垂直カットではっきりと見えます。

figure-results-1539
図1:HFIR CG-1D中性子イメージングビームラインの模式図。イメージングビームは、コーンビームジオメトリを定義するアパーチャシステムによって定義されます。ビームは、不要な漂遊中性子を除去するためにビームスクレーパーを備えたHe充填飛行管を介して輸送されます。フライトチューブ内のホウ酸塩ゴムライナーは、隣接するビームラインからのバックグラウンドを低減します。略語:HFIR =高フラックス同位体反応器;彼=ヘリウム;L =直径Dのピンホール開口部と検出器からの距離。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2092
図2:高フラックス同位体原子炉のCG-1D中性子イメージング施設。写真は、右手前から、フライトチューブ、サンプルエリア、ビームストップを示しています。中性子ビームは写真の右側から来ています。フライトチューブは、機器を利用する科学および業界の研究コミュニティによって署名されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2551
図 3: エピック インターフェイス。 CG-1D EPICインターフェースは、ステータスセクション(左)、表示領域(この例では真ちゅう製の航海日時計の生のX線写真)、および2Dおよび3Dイメージング用のパラメーター入力の3つのセクションに分かれています。略語:EPICS =実験物理学および産業用制御システム。2D = 2次元;3D = 3次元。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3042
図 4: Jupyter ノートブックのスクリーンショット。 このノートブックは、正規化する前に一連のX線写真をプレビューするために使用されます。この例では、 図 3 に示すのと同じ真鍮製の航海日時計が視覚化されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3501
図5:チタンインプラントを備えたラット大腿骨。 (A)代表的なラット大腿骨の写真。(B)nCTから得られたラット大腿骨の3Dレンダリングボリューム。(C)大腿骨内側のチタン棒を示す斜めのスライス。赤い矢印は骨梁を示しています。縮尺記号は、それぞれ x 軸と y 軸で表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:マウス肺nCT 。 (A)および(B)マウス肺の代表的な写真。(C)および(D)(A)および(B)と同じ位置を使用した減衰ベースの3Dレンダリングされたマウスのボリューム。(E)マウス肺の右葉を通る代表的なスライス(D)は、中性子減衰の異なる勾配(主に低減衰)で得られた肺の構造を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図7:中性子コンピューター断層撮影と植物の根/土壌システムをスライス します。 (A)植物サンプルの写真。(B)地上の茎と水を含む土壌システムを示す植物の中性子コンピューター断層撮影からの3Dレンダリングボリューム(赤)。(C)および(D)は、土壌中の茎および根を示す角度(赤い矢印)を示すためにサンプルを切断する。土壌中の濃い青色の領域は、水の存在を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

生体試料の中性子ラジオグラフィーとCTは、X線イメージングや磁気共鳴イメージングを補完する有望なイメージング技術です。生物学的試料の中性子イメージング実験を行う際の重要なステップは、その準備とビームラインでの封じ込めに関連しています。実験の最適化は、答えられるべき科学的な質問によって推進されます。科学の問題が現象を観察するために高い空間分解能を必要とする場合、長い取得時間が必要であり、nCT(cmサイズの視野を持つ)の欠点は、スキャンの実行に数時間かかることです。これは主に、X線CTスキャンが数mm2 の視野で数秒から数分かかるシンクロトロン源と比較して、原子炉で利用可能な全体的な中性子束の違いによるものです。この方法は、動物から抽出された生体外組織サンプルに適用できますが、放射線被曝のリスク(中性子によって生成されるガンマ線やサンプル中の原子との中性子相互作用など)のために、生体内で生きた動物や人間に拡張することはできません。ただし、水分吸収動態などの植物の根/土壌相互作用(図7)のイメージングに適しています。

植物のダイナミクスに高速nCTを使用する利点は、X線CTとは異なり、水中のHに対する感度と植物への放射線損傷がないことです。さらに、ラット大腿骨などの骨/金属サンプルでは、金属が周囲の組織に比べて比較的透明であるため(図5)、X線CT39によって誘発される金属アーチファクトを回避できる可能性があります。マウス肺(図6)などの動物組織は、中性子がHに敏感であるため、軟組織構造の印象的な検出を示しますが、空間分解能はこれらの測定のやや制限要因です。対照は、生物学的試料19、39中に存在するH原子によって提供される。

中性子格子干渉法などの新しい技術の進歩と空間分解能の向上(数ミクロンが最近報告されています42,43)により、中性子イメージングは、空間分解能が向上した生物学的組織にさらに新しいコントラストメカニズムを提供する可能性があります。より高エネルギーの中性子の探査(厚いサンプルの測定を可能にするため)は、無傷のマウスなどの動物組織のより大きな切片を測定する能力も約束し、生物医学研究にさらに新しい可能性を提供します。

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

この研究の一部は、ORNLが運営し、UT-Battelle, LLCとの契約DE-AC05-00OR22725に基づいて、米国エネルギー省科学局、ユーザー施設が後援する高フラックス同位体原子炉のリソースを利用しました。 この研究の一部は、ユージンウィグナー特別スタッフフェローシッププログラムを通じてORNLによってサポートされました。この研究は、DOE科学局、生物環境研究局によっても後援されました。ラット大腿骨サンプルは、NIH(R01AR066562)および整形外科研究教育財団-スミスアンドネフュー賞から得た資金で、ラッシュ大学医療センターのリックサムナー博士と共同で実施された実験から得られました。チームは、中性子散乱ビームラインの使用を可能にしたHFIRサポートチームに感謝したいと思います。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Aluminum containerscustomMade from aluminum plates or tubing (alternate is quartz), plant and mouse sample
Aluminum foilFisher01-213-100Mouse lung sample containment
Deionized water or deuterium oxideWater or D2O can be used to enhance contrast, plant sample
EthanolFisher04-355-223Mouse lung sample
Gauze spongesCardinalHealthFully submerged in phosphate-buffered saline (PBS) and used to wrap samples, rat femur sample
Growth chamberConvironA1000Any growth chamber or greenhouse with controlled conditions would work, plant sample
Laboratory balanceWeighing plant system can be used to measure actual water content in the soils, plant sample
Pure silica sandUS Silica Co.Flint#13Pure SiO2 provides low neutron attenuation compared to soils, plant sample
Sprague-Dawley RatsHarlanOrder Code: 002-USRat femur sample
Titanium RodGoodfellowTI007905Rat femur sample

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