Нейтронная радиография и компьютерная томография биологических систем в высокопоточном изотопном реакторе Национальной лаборатории Ок-Ридж

Резюме

В этой рукописи описывается протокол нейтронной радиографии и компьютерной томографии биологических образцов с использованием высокопоточного изотопного реактора (HFIR) CG-1D для измерения металлического имплантата в бедренной кости крысы, легком мыши и системе корня / почвы травянистых растений.

Аннотация

Нейтроны исторически использовались для широкого спектра биологических применений с использованием таких методов, как малоугловое рассеяние нейтронов, спиновое эхо нейтронов, дифракция и неупругое рассеяние. В отличие от методов рассеяния нейтронов, которые получают информацию в обратном пространстве, нейтронная визуализация на основе затухания измеряет сигнал в реальном пространстве, который разрешается порядка десятков микрометров. Принцип нейтронной визуализации следует закону Бера-Ламберта и основан на измерении объемного затухания нейтронов через образец. Большее затухание проявляется некоторыми легкими элементами (в первую очередь водородом), которые являются основными компонентами биологических образцов. Контрастные вещества, такие как соединения дейтерия, гадолиния или лития, могут использоваться для усиления контраста так же, как это делается в медицинской визуализации, включая такие методы, как оптическая визуализация, магнитно-резонансная томография, рентгеновская и позитронно-эмиссионная томография. Что касается биологических систем, нейтронная радиография и компьютерная томография все чаще используются для исследования сложности подземной корневой сети растений, ее взаимодействия с почвами и динамики потока воды in situ. Кроме того, были исследованы усилия по пониманию контрастных деталей в образцах животных, таких как мягкие ткани и кости. Эта рукопись посвящена достижениям в области нейтронной биовизуализации, таким как подготовка образцов, контрольно-измерительные приборы, стратегия сбора данных и анализ данных с использованием линии пучка нейтронной визуализации CG-1D высокопоточного изотопного реактора. Вышеупомянутые возможности будут проиллюстрированы на примере физиологии растений (травянистые растения/корневые/почвенная система) и биомедицинских применений (бедренная кость крысы и легкое мыши).

Введение

Принцип нейтронной радиографии (нР) основан на ослаблении нейтронов через материю, через которую они проходят. В отличие от рентгеновских лучей, которые рассеиваются электронным облаком атома, нейтроны могут поглощаться или рассеиваться его ядром. Нейтроны чувствительны к легким элементам, таким как водород (H), и, следовательно, могут использоваться для рентгенографии биологических применений, таких как животные 1,2,3,4,5,6,7 или ткани человека ^8,9 и подземные почвенные/корневые системы 10,11,12,13,14 ^,15. Нейтронная визуализация является дополнительным методом рентгеновской визуализации, который способен обнаруживать тяжелые элементы^16,17,18. nR на основе затухания определяется линейными коэффициентами затухания материалов в образце и толщиной образца, как описано законом Бера-Ламберта, который гласит, что проходящий луч прямо пропорционален количеству материала и длине пути через материал. Таким образом, коэффициент пропускания, T, может быть рассчитан как:

(1)

где I, ₀ и I, соответственно, интенсивность падающего и передаваемого луча; μ и x — линейный коэффициент затухания и толщина однородного образца соответственно. Коэффициент затухания μ определяется по формуле:

(2)

где σ — сечение затухания нейтронов образца (как рассеяние, так и поглощение), ρ — его плотность, N_A — число Авогадро, M — молярная масса.

Контраст в рентгенографии биологических образцов с использованием нейтронов низких энергий (т.е. энергий ниже 0,5 эВ) в основном обусловлен изменением плотности H (для фиксированной толщины образца). Это связано с вероятностью взаимодействия нейтрона с ядром H, которая больше, чем с другими ядрами, присутствующими в биологических образцах, и тем фактом, что плотность атома H имеет первостепенное значение, поскольку он является наиболее распространенным атомом в биологических образцах.

С ранних стадий нР и нейтронная компьютерная томография (нКТ) широко использовались для материалов и инженерных применений 19,20,21,22,23. Первые демонстрационные эксперименты по нейтронной чувствительности к H в биологических образцах начались в середине 1950-х годов²⁴ года с измерений образцов растений. Работа продолжалась в течение 1960-х годов, например, с рентгенографией грудной клетки^{человека 25} или крыс²⁶, в которой изучалось использование контрастных веществ, таких как оксид гадолиния (Gd₂O₃). Более того, была выдвинута гипотеза о том, что контраст в опухолевой ткани человека по сравнению с нормальной тканью был обусловлен локальным увеличением содержания H. В ходе этих первоначальных испытаний был сделан вывод, что увеличение потока нейтронов и пространственного разрешения улучшит качество нР и, вероятно, повысит его популярность в качестве дополнительного метода для промышленных или биомедицинских применений. Самые последние исследования включают измерения nR и nCT, выполненные на образцах^{раковой ткани 1} и срезах органов животных 2,3,27 для биомедицинских и судебно-медицинских применений.

Расположенный в Национальной лаборатории Ок-Ридж, Ок-Ридж, штат Теннесси, высокопоточный изотопный реактор (HFIR) является мощным источником нейтронов, который производит нейтроны в результате реакции деления. Эти нейтроны имеют энергию порядка 2 МэВ и «охлаждаются» в бассейне реактора кинетическими реакциями с тяжелой водой до достижения энергий порядка 100-300 эВ. Оптимизация нейтронного эксперимента, будь то рассеяние или визуализация, начинается с понимания свойств источника нейтронов и линий пучка, таких как интенсивность пучка, распределение энергии и влияние фона (быстрые нейтроны, запаздывающие нейтроны, гамма-лучи). В холодном направляющем зале HFIR, где расположена линия луча изображения, нейтроны дополнительно «охлаждаются» кинетическим взаимодействием с жидким H-замедлителем. Затем они транспортируются в изогнутой направляющей системе вдали от прямой видимости источника, тем самым устраняя быстрые нейтроны и гамма-загрязнение. Как показано на рисунке 1, нейтронно-визуальный пучок^{CG-1D 28,29} размещен на холодном канале, подразумевая, что диапазон энергий нейтронов изменяется от нескольких мэВ до нескольких десятков эВ (в этом случае соответствующая полезная длина волны нейтрона колеблется от ^0,8 до 10 Å) с потоком в диапазоне 10⁷ н/(^см2∙s) в положении образца. Моторизованная система апертуры/рассеивателя определяет геометрию точечного отверстия прибора для получения изображения. Нейтроны проходят расстояние 6,59 м в заполненной гелием (He) полетной трубе с алюминиевыми (Al) окнами на каждом конце. Полетные трубы используются для транспортировки нейтронов при ограничении рассеяния воздуха, так что потери интенсивности пучка минимальны. Для измерений, описанных в этой рукописи, рассеиватель изготовлен из нанопорошка оксида алюминия толщиной 50 нм толщиной 1 мм (Al₂O₃), заключенного в контейнер Al. Рассеиватель уменьшает артефакты пучка, исходящие от нейтроновода (которые увеличиваются за счет геометрии точечного отверстия линии луча изображения), в противном случае на рентгенограмме видны резкие горизонтальные и вертикальные колебания интенсивности, и нормализация данных становится сложной задачей.   Для проиллюстрированных здесь экспериментов нейтроны преобразуются в свет с использованием фторида лития-6 / люминофора сульфида цинка толщиной ²⁵мкм (6 LiF/ZnS:Ag).

Оптимизация коллимации зависит от положения образца к детектору, требуемого пространственного разрешения и времени регистрации. Когда образец находится на расстоянии нескольких см от сцинтиллятора, высокие коллимации (L/D выше 800, где L — расстояние от отверстия точечного отверстия диаметром, D и детектора) дают лучшее пространственное разрешение за счет потока нейтронов. Низкая коллимация (L/D ниже 800) предпочтительна для динамических исследований in situ, когда временное разрешение преобладает над пространственным разрешением. Для измерений, описанных в этой рукописи, L/D и пространственное разрешение составляли приблизительно 355 и 75 мкм соответственно. Временное разрешение варьировалось в зависимости от отношения сигнал/шум (SNR). Образец был расположен как можно ближе к сцинтиллятору, чтобы уменьшить геометрические искажения, такие как размытие. Доступны ступени перемещения и вращения для установки образца близко к детекторам и выполнения компьютерной томографии (КТ). CG-1D предлагает три типа детекторов: устройство с зарядовой связью (ПЗС) с разрешением 2048 x 2048 пикселей с шагом пикселя 13,5 мкм, научный детектор на основе комплементарного металл-оксидного полупроводника (sCMOS) с разрешением 2560 x 2160 пикселей с шагом пикселя 6,5 мкм и детектор с микроканальной пластиной (MCP)^30,31 с разрешением 512 x 512 пикселей с размером пикселя 55 мкм. Рассеянные нейтроны поглощаются борным каучуком толщиной ~5 мм, чтобы защитить чип детектора от видения нейтронов. Это поглощение генерирует гамма-лучи, которые могут быть остановлены свинцом (Pb), помещенным между борным каучуком и детектором. Каждый детектор оптимизирован для разного поля зрения (FOV), а также пространственного и временного разрешения. Для измерений бедренной кости крысы и легких мыши использовался ПЗС-детектор из-за его большой возможности поля зрения (~ 7 см x 7 см) и разумного пространственного разрешения около 75 мкм. nCT корневой / почвенной системы растений была выполнена с помощью sCMOS, так как цель состояла в том, чтобы как можно быстрее получить nCT за счет FOV (который был ограничен ~ 5 см x 4,2 см); Таким образом, пространственное разрешение, очевидно, пострадало. В этих детекторах нейтроны либо превращаются в свет, либо в альфа-частицу для целей обнаружения. Вращение образца вокруг его вертикальной оси и получение рентгенограмм под последовательными углами поворота позволяет получать нКТ. 3-мерная объемная визуализированная модель исследуемого образца получена с использованием собственного блокнота Jupyter с фильтрованной обратной проекцией (FBP) на основе iMARS3D на основе python, pyMBIR или коммерческого программного обеспечения, описанного ниже.

Наконец, нейтроны, которые не взаимодействовали с образцом или детектором, собираются в положении остановки луча примерно в 1 м ниже по течению от детекторной системы, чтобы свести к минимуму фоновый шум. Ограничитель балки CG-1D имеет ширину 0,75 м, высоту 0,5 м и толщину 35 мм и изготовлен из эпоксидной смолы B₄C. Ограничитель пучка армирован 10 мм 95% обогащенного карбоната лития (6 Li₂CO₃) в огнестойкой эпоксидной смоле, куда попадает нейтронный пучок, с полостью, облицованной ⁶Li, свинцом (Pb) и сталью, предназначенной для сдерживания высокой скорости вторичных гамма-лучей. Упор балки крепится непосредственно к стальной экранирующей стенке балки. Фотография линии луча CG-1D приведена на рисунке 2.

Три программы реконструкции были использованы для реконструкции трех экспериментальных данных в 3D соответственно. Реконструкция образца легкого мыши была выполнена с использованием Octopus³², коммерческого программного обеспечения для реконструкции, использующего FBP. Программное обеспечение Octopus находится на серверном ПК и может использоваться для восстановления данных, собранных на линии луча. Программное обеспечение для реконструкции под названием iMARS3D доступно в CG-1D. Он основан на открытом исходном коде TomoPY³³ с дополнительными функциями, такими как автоматическая коррекция наклона, фильтры постобработки и т. д. iMARS3D включает в себя предварительную обработку данных (вычитание фона и шума), кадрирование, медианную фильтрацию (для коррекции гамма-ударов и битых пикселей), автоматическую коррекцию колебаний интенсивности луча и коррекцию наклона образца. После создания синограмм возможна дальнейшая обработка данных, такая как удаление кольцевых артефактов и сглаживание. Различные этапы реконструкции сохраняются на сервере анализа (а затем перемещаются в общую папку предложения), в то время как окончательные 2D-фрагменты сразу же сохраняются в общей папке предложения. Бедренная кость крысы была реконструирована с помощью iMARS3D. Образец корня / почвы растений был предварительно обработан путем медианной фильтрации данных с использованием TomoPY с последующей коррекцией оси наклона с использованием библиотеки Python SciPy.  Реконструкция была выполнена с использованием разработанного собственными силами пакета python под названием pyMBIR (построенного с использованием ядер из набора^{инструментов ASTRA 34}), который реализует набор томографических алгоритмов от базового FBP до передовых методов итеративной реконструкции^{на основе моделей 35}, которые могут получать высококачественные реконструкции из чрезвычайно разреженных и зашумленных наборов нейтронных данных. Все визуализированные объемы, основанные на вышеупомянутых инструментах реконструкции, представлены в контрасте затухания. Вся визуализация была выполнена с использованием программного комплекса коммерческой визуализации, сегментации и анализа данных AMIRA³⁶.

Целью данной рукописи является демонстрация процедуры использования нейтронной визуализации (nR и nCT) на линии пучка HFIR CG-1D. Это исследование также иллюстрирует современные возможности nR и nCT для биологических образцов, в частности, легких мыши, кости крысы и корневых/почвенных систем растений. Легкое мыши было выбрано, чтобы проиллюстрировать комплементарность нейтронов для измерения легочной ткани, тогда как рентгеновские лучи в основном чувствительны к костям. Образец кости, бедренная кость крысы, имел титановый (Ti) имплантат, что иллюстрирует контраст между костью и металлом, а также возможность увидеть границу раздела кость / металл (что трудно измерить с помощью рентгеновских лучей, поскольку металлы сильно ослабляют их⁴). Наконец, система водоснабжения растений и корней иллюстрирует трехмерную (3D) способность nCT измерять корневые / почвенные системы in situ. Кроме того, показаны преимущества/недостатки использования nR для биологических образцов. Очевидно, что этот метод может быть безопасно использован для измерения динамики воды в корневой системе растений, но не может рассматриваться как метод визуализации живых животных или человека из-за рисков, связанных с радиационным облучением, таким образом, ограничивая исследования либо (мертвыми) мышами, либо патологоподобными измерениями, в которых, например, образец ткани резецируется у пациента (животного или человека) и подготавливается путем фиксации перед измерением в нейтронном пучке.

протокол

1. Настройка прибора (см. рис. 3, раздел 3)

1. На компьютере beamline откройте окно терминала, введите css и нажмите клавишу ВВОД , чтобы запустить пользовательский интерфейс.
2. Если по умолчанию он не открыт, выберите параметр «Главная страница пользователя» на вкладке «Меню», чтобы открыть интерфейс визуализации экспериментальной физики и промышленной системы управления (EPICS).
3. Используя первую вкладку (называемую «Предложение/Камера/Устройство SE») интерфейса, выберите оптику луча, нажав кнопку «Оптика» рядом с «Камера/Детекторы», т. е. размер отверстия и открытие щелевой системы, нажав кнопку «Щели».
4. Прикрутите ступень вращения к столикам XY, куда должен быть помещен образец, и установите детектор (sCMOS или CCD).
   1. Для ПЗС-детектора или sCMOS-детектора выберите объектив с увеличением, обеспечивающим желаемое пространственное разрешение и фокусное расстояние, по согласованию с группой приборов. Используя сначала свет, сфокусируйте камеру, переместив детектор ближе или дальше от зеркала или вручную настроив объектив в фиксированном положении детектора. Сфокусируйте изображение в месте нахождения нейтронного сцинтиллятора.
   2. Для ПЗС-матрицы или КМОП-детектора выполните точную настройку фокусировки линзы с помощью нейтронов с помощью маски³⁷ разрешения, поглощающей нейтроны, расположенной напротив сцинтиллятора детектора. Собирайте последовательные рентгенограммы, используя различные настройки (т. е. различные положения детектора с зеркала, автоматически перемещая двигатель детектора в EPICS).
   3. Сравните рентгенограммы, оценив пары линий в ImageJ / Fiji³⁹ или аналогичном программном инструменте для обработки изображений.
5. При необходимости закрепите образец в подходящем контейнере (алюминиевом контейнере и/или алюминиевой сверхпрочной фольге), поместив образец на вращающуюся ступень как можно ближе к детектору. Экранируйте детектор и оборудование с помощью нейтронной (борный каучук) и гамма-экранирования (кирпичи Pb).
6. Измерьте расстояние от образца до детектора и извлеките образец. Замените его маской разрешения, чтобы оценить размер пикселя в положении образца в этой конфигурации линии луча. Используя известное измерение объекта, оцените количество пикселов на объекте, чтобы определить размер пикселя.
7. Переместите образец на ступень вращения.
8. Используя интерфейс EPICS и вкладку «Выровнять образец», выровняйте образец с нейтронным пучком, сделав последовательные быстрые (мс до 1 с) рентгенограммы во время движения образца, пока он не окажется в поле зрения детектора. Сохраните файл выравнивания образца как файл .csv, который будет повторно использован перед началом компьютерной томографии.
9. Перед началом компьютерной томографии используйте опцию автоматической проверки выравнивания КТ (на вкладке «Выравнивание »), чтобы убедиться, что образец остается в поле зрения под разными углами, оценив рентгенограммы, поскольку они генерируются при разной ориентации образца с лучом.

2. Стратегия подготовки образцов и сбора данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы образцов животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Теннесси для легкого мыши и Комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинским центром Университета Раша для бедренной кости крысы.

1. Бедренные кости крысы
   1. Имплантируйте стержни Ti₆Al₄V (диаметром 1,5 мм и длиной 15 мм) в бедренные кости самцов крыс Sprague-Dawley, поместив их в интрамедуллярное пространство через дистальные мыщелки бедренной кости.
   2. Принесите крыс в жертву через 12 недель и соберите бедренные кости. Удалите все мягкие ткани (что способствует ослаблению нейтронов) и заморозьте бедренные кости с имплантатами в марле, пропитанной физиологическим раствором. Полностью погрузите 2-дюймовые квадратные марлевые губки в фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) и полностью оберните каждый образец этими пропитанными губками (см. Таблицу материалов).
   3. Разморозьте бедренные кости до комнатной температуры для рентгеновской микрокомпьютерной томографии³⁸, прежде чем транспортировать их в замороженном состоянии в HFIR.
      1. Перед nCT разморозьте образец и доведите его до комнатной температуры в лаборатории HFIR Biohazard Safety Level 2 (BSL2), расположенной рядом с линией пучка нейтронной визуализации CG-1D. При комнатной температуре заверните образец в сверхпрочную алюминиевую фольгу и поместите его в алюминиевый цилиндр.
      2. Расположите цилиндр вертикально на ступени вращения на линии луча и просканируйте бедренную кость на линии луча при комнатной температуре от 0 до 360° с углом шага 0,25°. Приобретайте каждую рентгенограмму в течение 50 с.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая мертвое время для движения ступени вращения и передачи каждой рентгенограммы с ПЗС-матрицы на компьютер сбора данных, общее время сканирования составило примерно 24 часа.
   4. После того, как nCT будет завершена и образец будет разрешен к удалению из лучевой линии, верните образец в лабораторию BSL2, снимите защитную оболочку и снова заморозьте образец, чтобы сохранить его для дальнейших экспериментальных измерений.
2. Легкие мыши
   1. Резекция легочной ткани мертвой мыши использовалась для экспериментов, не связанных с этим исследованием. Зафиксируйте образец в растворе 70% этанола перед нейтронными экспериментами.
   2. Заверните ткань в сверхпрочную алюминиевую фольгу и транспортируйте ее из лаборатории BSL2 непосредственно на линию пучка CG-1D. Вставьте образец в алюминиевый цилиндр для двойной локализации и для поддержания положения образца в луче во время сканирования nCT.
   3. Расположите образец рядом с ПЗС-матрицей и выполните сканирование в течение ночи при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая рентгенограмма составляла 150 с, а угол шага поворота составлял 0,5°, от 0 до 182°. Общее время сканирования составило около 16 часов.
3. Корневая / почвенная система травянистых растений
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в случае с другими биологическими образцами, растительно-почвенные системы ограничены по размеру из-за сильного ослабления водорода, особенно воды в почве или корнях растений. Семена или раметы могут быть посажены в контейнеры (алюминий или кварц - оба имеют низкое затухание нейтронов), или более зрелое растение может быть пересажено в контейнер.
   1. Осторожно выкопайте и пересадите местную траву, растущую на месте (здесь, тутовый сорняк (Fatoua villosa (Thunb .) Nakai) в контейнер Al сечением 2,38 см х 2,58 см, высотой 6,3 см, толщиной стенки 0,055 см, содержащий чистый песок (SiO₂).
   2. Промойте корни растений деионизированной водой и осторожно поместите их в контейнер Al, заполняя контейнер суспензией влажного песка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При заполнении контейнеров грунтом важно использовать влажную почву, так как сухая почва будет отделяться по размеру частиц и создавать текстурные артефакты в контейнерах^12,13.
   3. После посадки измерьте насыщенный вес растительной системы и взвешивайте растительную систему каждый день, чтобы оценить норму использования воды. Наносите воду либо на верхнюю поверхность почвы, либо через порт или отверстие в нижней части емкости с помощью трубки или шприца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь растительная система была помещена на весы, и вода подавалась наверх каждый день, чтобы заменить ежедневное потребление воды в зависимости от веса. Вода может быть удержана перед визуализацией, чтобы уменьшить содержание воды в почве и усилить контраст в корнях.
   4. Размножайте растительную систему в камере выращивания на месте с контролируемой температурой и светом¹². Поддерживайте растительную систему в течение 1 недели перед визуализацией, чтобы обеспечить акклиматизацию корней растений к контейнеру Al.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После начала визуализации не поливайте растение.
   5. Выполняйте сканирование nCT за ~ 1,75 часа каждое и непрерывное сканирование в течение 2,5 дней, чтобы отобразить динамические 3D-изменения содержания воды в почве и растениях. Для этих измерений уменьшите пространственное разрешение до нескольких сотен мкм в пользу временного разрешения (т. е. более быстрого времени сбора данных для каждой проекции).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая компьютерная томография выполнялась с углом поворота 0,93° и временем сбора данных 10 с на проекцию. Для целей данной рукописи представлена только первая компьютерная томография.

3. Сбор данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Система сбора данных в CG-1D использует программное обеспечение^{EPICS 40}. EPICS разработан для руководства экспериментальным протоколом и минимизации человеческих ошибок; этот интерфейс логически выполняет различные необходимые шаги перед измерением образца, как показано на рисунке 3.  Протокол сбора данных EPICS выглядит следующим образом (рис. 3). В левом разделе отображается состояние текущего эксперимента, а также положения двигателей и сведения об эксперименте (информация об образце, номер предложения и члены команды). Каждый эксперимент связан с номером предложения и одним или несколькими образцами. Информация о предложении, такая как члены команды и название выбранного образца, также доступна справа (первая вкладка называется «Предложение/камера/устройство среды выборки»). Центральная секция состояла из текущей рентгенограммы со шкалой динамического диапазона сбоку, а также информации о состоянии и журнале под изображением.

1. Выберите первую вкладку EPICS под названием Proposal/Camera/SE Device. Нажмите кнопку « Переключить предложение» или «Образец ». Выберите номер проекта и идентификатор образца # для измерения в списках предложений (слева) и «Образец » (справа), которые заменили предыдущую вкладку.
2. Используйте стрелку назад , чтобы вернуться к основному интерфейсу EPICS. Выберите детектор для использования (sCMOS или CCD), выбрав один из четырех доступных детекторов (Andor CCD, Andor sCMOS, SBIG CCD или MCP) в списке опций Камера/Детектор .
   ПРИМЕЧАНИЕ: ПЗС-матрица SBIG используется для тестирования прибором и может быть проигнорирована для данной рукописи.
3. Выберите стадию вращения, которая будет использоваться, в разделе Sample Environment Device .
   1. Сначала нажмите на стадию вращения (компьютерная томография) в списке устройств среды образца . Затем выберите один из этапов вращения (который соответствует сканируемому образцу).
4. Наконец, в нижней части вкладки выберите режим сбора данных. В этом случае выберите первый вариант, White Beam.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Режим регистрации либо белый луч (охватывающий весь диапазон длин волн нейтронов), либо монохроматический на линии пучка CG-1D.
5. Выберите вторую вкладку EPICS под названием «Образец выравнивания». Введите имя файла образца и нажмите клавишу ВВОД. Повторите процесс для имени вложенной папки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Интерфейс EPICS запрограммирован на автоматическое сохранение данных в соответствующих экспериментальных каталогах, которые внутреннее программное обеспечение для реконструкции использует для создания 2-мерных (2D) срезов исследуемого 3D-объекта. Вторая вкладка, «Выровнять образец», позволяет выровнять образец с помощью рентгенограмм, которые длятся всего несколько секунд, поскольку эти рентгенограммы не используются позже для обработки и анализа данных. После того, как все двигатели расположены правильно, их положения могут быть сохранены в формате файла .csv; таким образом, каждое выравнивание образца имеет соответствующий файл .csv, который можно вызвать обратно, чтобы расположить образцы для компьютерной томографии позже.
6. Пропустите юстировку трех двигателей, т. е. предположим, что образец выровнен и готов к КТ. Выберите желаемое время съемки и нажмите кнопку «Сделать быстрые снимки ». Соберите серию рентгенограмм с разным временем получения, чтобы оценить отношение сигнал/шум.
7. Откройте ImageJ/Fiji; Перетащите различные рентгенограммы. Построить профиль, идущий от образца к открытой местности; оцените отношение сигнал/шум.
8. Если на этапе XY установлено несколько образцов (несколько этапов вращения, каждый для одного образца), запишите положение каждого образца после выравнивания и сохраните данные в виде файла .cvs, нажав кнопку « Сохранить в файле ».
9. Выберите третью вкладку EPICS под названием «Сбор данных », чтобы настроить параметры компьютерной томографии. Введите имя файла в первую строку, доступную для записи, и нажмите клавишу ВВОД. Повторите эти действия для имени вложенной папки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Расположение вкладки «Сбор данных » зависит от выбора серии прошедших во времени рентгенограмм (без SE) или компьютерной томографии (выбор этапа вращения) на первой вкладке.
10. В разделе Выровнять образец с помощью сохраненного файла выберите файл, в котором ранее были записаны образцы положений двигателя (этап 1.8). Используйте раздел «Недавно сохраненные файлы » для просмотра недавно сохраненных образцов файлов выравнивания. Нажмите « Выровнять с помощью файла », чтобы образец вернулся в нужное положение в нейтронном пучке.
11. Рассчитайте количество проекций, необходимых для КТ, на основе теоремы Найквиста о выборке. Вычислите количество пикселей в горизонтальном измерении образца и умножьте на 1,5, чтобы получить количество проекций, необходимых для выполнения выборки Найквиста.
12. Введите начальный угол вращения (обычно 0°), конечный угол поворота (обычно 180°), размер шага вращения, количество изображений на шаг (обычно устанавливается равным 1) и время экспозиции для каждого изображения. Запустите компьютерную томографию, нажав кнопку «Собрать данные».

4. Объемная реконструкция и обработка/анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Все программные инструменты CG-1D для нормализации, реконструкции и анализа данных доступны в репозитории Python объекта ORNL и на серверах анализа объекта. Для 2D-измерений предварительная обработка может быть выполнена с помощью записных книжек^{Jupyter Python 41}. Иллюстрация записной книжки показана на рисунке 4. Можно загрузить и просмотреть их данные, прежде чем выбрать интересующую область за пределами образца, которая используется для нормализации до 1 (или 100%) пропускания любых колебаний луча. Эти блокноты могут быть адаптированы к каждому измерению, что упрощает предварительную обработку. Кроме того, 2D-анализ может быть выполнен в том же блокноте, например, отслеживание кинетических изменений (т.е. поглощения воды в образце) в образце во времени.

1. Войдите на сервер анализа Linux, используя имя пользователя и пароль. Откройте веб-браузер и введите jupyter.sns.gov.
2. Откройте записную книжку Python Jupyter с именем iMARS3D. Выполните первые несколько строк кода (который загружает инструменты, необходимые для запуска iMARS3D). Загрузите данные, плоское и темное поле. Убедитесь, что все три набора данных загружены правильно.
3. Приступайте к обрезке данных, фильтрации (при необходимости), нормализации (с автоматической коррекцией наклона образца) и объемной реконструкции (длительный процесс). Сохраните данные в папке с номерами проектов с именем Shared. После включения AMIRA³⁶, которая также доступна на серверах анализа объекта, загрузите восстановленные срезы в программное обеспечение и приступайте к визуализации, дальнейшей фильтрации и анализу.

Результаты

На рисунке 5А показана фотография репрезентативной бедренной кости крысы аналогичного размера, чем измеренная; На рисунке 5B,C представлена nCT бедренной кости крысы с имплантатом Ti. На рисунке 5B показана КТ бедренной кости на основе ложного ослабления цвета, а на рисунке 5C представлен диагональный разрез кости с той же ориентацией, что и на рисунке 5B, чтобы показать имплантат Ti (в оттенках серого), напоминающий рентгеновскую медицинскую КТ. Этот имплантат не взаимодействует с нейтронами так сильно, как костный материал; Таким образом, его затухание минимально, и он кажется темнее (т. е. менее ослабленным), чем окружающая кость. Трабекулярная кость, которая присутствует в медуллярном пространстве бедренной кости, хорошо видна на проксимальном конце образца (красные стрелки на рисунке 5B).

На рисунке 6A, B показаны репрезентативные фотографии фиксированного этанолом легкого мыши в двух разных положениях, используемых для nCT, чтобы продемонстрировать способность нейтронов обнаруживать образцы мягких тканей. Реконструированный объем легкого мыши, полученный с помощью nCT, показан на рисунке 6C, D, расположенном аналогично рисунку 6A, B. Разрез правой доли легкого показан на рисунке 6E. Несмотря на относительно небольшой размер образца, чувствительность к нейтронам наглядно демонстрируется детектированием структуры легкого при пространственном разрешении ~75 мкм. Как и ожидалось, диапазон затухания довольно широк, большая часть соответствует затуханию нейтронов от низкого до среднего, поскольку легкие имеют губчатую структуру, содержащую воздух.

На рисунке 7А показана фотография образца растения, а на рисунке 7В представлена ложная цветовая объемная визуализация корневой / почвенной системы растений в прямоугольном контейнере Al (который не виден, потому что Al в основном прозрачен для нейтронов). По сравнению с предыдущими наборами данных, SNR хуже, как и ожидалось, поскольку данные были получены быстрее, чтобы отслеживать динамические движения поглощения воды в корне в 3D в течение 2,5 дней. Таким образом, каждая компьютерная томография была оптимизирована для измерения в течение ~ 1,75 часа. Несмотря на плохое отношение сигнал/шум, корневая система в почве хорошо видна на вертикальных срезах образца, показанного на рисунке 7C,D в ложном цвете.

Рисунок 1: Схематический чертеж линии пучка нейтронной визуализации HFIR CG-1D. Луч изображения определяется системой апертуры, которая определяет геометрию конусного луча. Пучок транспортируется через заполненную He полетную трубу с пучковыми скребками для удаления нежелательных блуждающих нейтронов. Борированный резиновый вкладыш внутри полетной трубы уменьшает фон от соседних линий луча. Сокращения: HFIR = высокопоточный изотопный реактор; Он = гелий; L = расстояние от отверстия точечного отверстия диаметром D и детектора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Установка нейтронной визуализации CG-1D на высокопоточном изотопном реакторе. На фотографии спереди справа налево показаны полетные трубы, область образца и остановка луча. Пучок нейтронов идет с правой стороны фотографии. Полетная труба была подписана научными и отраслевыми исследовательскими сообществами, использующими этот прибор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Интерфейс EPICS. Интерфейс CG-1D EPICS разделен на три раздела: раздел состояния (слева), область отображения (в данном примере необработанная рентгенограмма латунных морских солнечных часов) и ввод параметров для 2D и 3D изображений. Сокращения: EPICS = экспериментальная физика и промышленная система управления; 2D = двумерный; 3D = трехмерный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Снимок экрана записной книжки Jupyter. Эта записная книжка используется для предварительного просмотра набора рентгенограмм перед их нормализацией. В этом примере визуализируются те же самые латунные морские солнечные часы, показанные на рисунке 3 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Бедренная кость крысы с титановым имплантатом. (А) Фотография репрезентативной бедренной кости крысы. (B) 3D-визуализированный объем бедренной кости крысы, полученный с помощью nCT. (C) Диагональный срез, показывающий титановый стержень внутри бедренной кости. Красными стрелками показана трабекулярная кость. Масштабные линейки представлены осями x и y соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: nCT легких мыши. (A) и (B) Репрезентативные фотографии легкого мыши. (C) и (D) 3D-визуализация объема мыши на основе затухания с использованием того же позиционирования, что и (A) и (B). (E) Репрезентативный срез через правую долю легкого мыши (D), показывающий структуру легкого, полученную с различным градиентом ослабления нейтронов (в основном с низким затуханием). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Нейтронная компьютерная томография и срезы корневой / почвенной системы растений . (А) Фотография образца растения. (B) 3D-визуализированный объем из нейтронной компьютерной томографии растения, показывающий стебель над землей и почвенную систему с водой (красным цветом). (C) и (D) представляют собой прорези в образце под углом, чтобы показать стебель и корни в почве (красные стрелки). Более темно-синие участки в почве указывают на наличие воды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Нейтронная рентгенография и КТ биологических образцов являются перспективными методами визуализации, которые дополняют рентгеновскую визуализацию или магнитно-резонансную томографию. Критические этапы проведения эксперимента по нейтронной визуализации биологического образца связаны с его подготовкой и локализацией на линии пучка. Оптимизация эксперимента обусловлена научным вопросом, на который необходимо ответить. Если научный вопрос требует высокого пространственного разрешения для наблюдения явления, то требуется длительное время получения, а недостатком nCT (с полем зрения размером в сантиметрах) является то, что для выполнения сканирования требуются часы. В основном это связано с разницей в общем потоке нейтронов, доступном в реакторе, по сравнению с синхротронным источником, где рентгеновская компьютерная томография может занимать от нескольких секунд до минут для поля зрения в несколько^мм2 . Хотя метод может быть применен к образцам тканей ex vivo, извлеченным у животных, он не может быть распространен in vivo на живых животных или людей из-за риска радиационного облучения (например, гамма-лучей, создаваемых нейтронами, и взаимодействия нейтронов с атомами в образце). Тем не менее, он хорошо подходит для визуализации взаимодействий корней растений с почвой (рис. 7), таких как динамика поглощения воды.

Преимуществом использования быстрой нКТ для динамики растений является чувствительность к H в воде и отсутствие радиационного поражения растения, в отличие от рентгеновской КТ. Кроме того, уникальный контраст можно наблюдать при использовании нейтронов в образцах костей / металлов, таких как бедренная кость крысы, где металл относительно прозрачен по сравнению с окружающими тканями (рис. 5), что потенциально позволяет избежать металлических артефактов, индуцированных рентгеновской КТ³⁹. Ткани животных, такие как легкое мыши (рис. 6), демонстрируют впечатляющее обнаружение структуры мягких тканей, поскольку нейтроны чувствительны к H, но пространственное разрешение является несколько ограничивающим фактором в этих измерениях. Контраст обеспечивается атомами H, присутствующими в биологических образцах^19,39.

С развитием новых методов, таких как нейтронная решетка, интерферометрия и улучшением пространственного разрешения (недавно сообщалось о нескольких микронах,^42,43), нейтронная визуализация может предложить еще новые механизмы контрастирования для биологических тканей с улучшенным пространственным разрешением. Исследование нейтронов более высоких энергий (чтобы позволить измерять толстые образцы) также обещает возможность измерять большие участки ткани животных, таких как неповрежденная мышь, тем самым предлагая еще новые возможности для биомедицинских исследований.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum containers	custom		Made from aluminum plates or tubing (alternate is quartz), plant and mouse sample
Aluminum foil	Fisher	01-213-100	Mouse lung sample containment
Deionized water or deuterium oxide			Water or D2O can be used to enhance contrast, plant sample
Ethanol	Fisher	04-355-223	Mouse lung sample
Gauze sponges	CardinalHealth		Fully submerged in phosphate-buffered saline (PBS) and used to wrap samples, rat femur sample
Growth chamber	Conviron	A1000	Any growth chamber or greenhouse with controlled conditions would work, plant sample
Laboratory balance			Weighing plant system can be used to measure actual water content in the soils, plant sample
Pure silica sand	US Silica Co.	Flint#13	Pure SiO2 provides low neutron attenuation compared to soils, plant sample
Sprague-Dawley Rats	Harlan	Order Code: 002-US	Rat femur sample
Titanium Rod	Goodfellow	TI007905	Rat femur sample