細菌性内眼炎マウスモデルにおけるウイルス感染の注入と感染量の定量

要約

ここでは細菌性内膜炎のマウスモデルにおけるビトリアル内注射とその後の細菌定量の方法について説明する。このプロトコルは、宿主の免疫応答および細菌および宿主遺伝子発現を測定するために拡張することができる。

要約

眼内細菌感染は視力にとって危険である。研究者は、動物モデルを使用して、感染に関連する宿主および細菌因子および免疫応答経路を調査し、実行可能な治療標的を同定し、失明を予防するための薬物を検査する。細胞内注射技術は、眼の後部の膜腔に生物、薬物、または他の物質を直接注入するために使用される。ここでは、マウス眼での感染を開始するこの注射技術と眼内細菌を定量する技術を実証した。 セレウス菌 は脳心注入液培地中で18時間成長し、100コロニー形成ユニット(CFU)/0.5μLの濃度に再懸濁した。ケタミンとキシラジンを併用してC57BL/6Jマウスを麻酔した。ピコリットルマイクロインジェクターとガラス毛細血管針を用いて、0.5μLの バチルス 懸濁液をマウス眼の中硝子に注入した。対照眼は滅菌培地を注射したか(外科的制御)、注入されなかった(絶対対照)。感染後10時間で、マウスを安楽死させ、無菌手術用ピンセットを使用して目を採取し、400μLの無菌PBSおよび1mmの無菌ガラスビーズを含むチューブに入れた。ELISAまたは骨髄ペルオキシダーゼアッセイの場合、プロテイナーゼ阻害剤をチューブに添加した。RNA抽出のために、適当なリシスバッファーを添加した。目を組織ホモジナイザーで1〜2分間ホモジナイザー化した。ホモジェナートをPBSで10倍に連続して希釈し、寒天プレートにトラック希釈した。ホモジエートの残りの部分は、追加のアッセイのために-80°Cで保存した。プレートを24時間インキュベートし、1眼当たりのCFUを定量化した。これらの技術は、マウスの目に再現性の感染症をもたらし、生存可能な細菌、宿主の免疫応答、および宿主および細菌遺伝子発現のオミックスの定量を促進する。

概要

細菌性心内炎は炎症を引き起こす壊滅的な感染症であり、適切に治療しないと視力や失明を引き起こす可能性があります。眼内炎は、目^{1、2、3、4、5}の内部に細菌が入り^{込んだ結果である}。一度目に入ると、細菌は複製し、毒素やその他の有害因子を産生し、繊細な眼下の細胞および組織に不可逆的な損傷を引き起こす可能性がある。眼の損傷は、炎症によっても引き起こされ得るが、眼の内部に炎症細胞が流入する炎症経路の活性化に起因する^1、5、6。子宮内膜炎は、眼内手術(術後)、眼への貫通傷害(心的外傷後)、または異なる解剖学的部位(内因性)7、8、9、10から眼への細菌の転移性の広がりから起こり得る。細菌性眼内炎の治療には、抗生物質、抗炎症薬、または外科的介入^3、4、11が含まれる。これらの治療を受けても、視力や目自体が失われる可能性があります。細菌性心内炎後の視覚予後は、一般に、治療効果、提示時の視力、および感染性生物の毒性によって異なる。

セレウス菌(B.セレウス)は、心的外傷後心内膜炎^7、12を引き起こす主要な細菌病原体の1つである。B.セレウス心内炎の症例の大半は急速な経過を有し、数日以内に失明を引き起こす可能性がある。B.セレウス心内炎の特徴は、急速に進化する眼内炎症、眼痛、視力の急速な喪失、発熱を含む。B. セレウスは、一般的に眼感染症^2、4、12を引き起こす他の細菌と比較して目に急速に成長し^、多くの病原性因子を有する。したがって、治療介入を成功させるためのウィンドウは、1、2、3、4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25である。 この感染症の治療は、通常、他の毒性の低い病原体によって引き起こされる心内炎の治療に成功するが、B.セレウス心内膜炎は一般的に有意な視力低下に苦しむ患者の70%以上をもたらす。これらの患者の約50%は、感染した眼の摘出または摘出を受ける^{7、16、22、23}である。B.セレウス眼内炎の破壊的かつ迅速な性質は、即時かつ適切な治療を必要とする。最近、疾患開発の基礎的なメカニズムを見極める上での進歩は^、介入のための潜在的な標的を特定した^19,26,27.B.セレウス眼内炎の実験的マウスモデルは、感染のメカニズムを識別し、視力低下を防ぐ可能性のある潜在的な治療法をテストするのに引き続き有用である。

B.セレウスを有するマウスの実験的眼内感染は、子宮内膜炎²⁸の間に細菌および宿主因子、ならびにそれらの相互作用を理解するためのインストゥルメンタルモデルであった。このモデルは、外傷後または術後の事象を模倣し、怪我の間に細菌が目に導入される。このモデルは非常に再現性が高く、試験的療法のテストや、ケアの標準の改善のためのデータを提供するのに有用であった^1、6、 19^、29、30。他の多くの感染モデルと同様に、このモデルは感染の多くのパラメータの独立した制御を可能にし、感染結果の効率的で再現可能な検査を可能にする。過去数十年にわたるウサギの同様のモデルの研究は、目^{2、4、13、14、31}におけるB.セレウス毒性因子の影響を調べた。個々または複数の病原性因子を欠く変異株B.セレウスを注入することにより、これらの病原性因子の疾患重症度への寄与は、異なる時間の感染時における細菌の濃度または視覚機能13、14、27、31、32の喪失などの結果によって測定することができる。さらに、特定の炎症性宿主因子26、29、33、34、35を欠くノックアウトマウス株に感染することにより^、このモデルでホスト因子が検討されている。このモデルは、感染後に目に新しい化合物を注入することによって、この疾患の潜在的な治療法をテストするのにも有用である^30,36.本稿では、B.セレウスにマウスの眼を感染させること、感染後の眼を収穫すること、眼内細菌負荷を定量化すること、および疾患の重症度の追加パラメータをアッセイするために標本を保存することを含む詳細なプロトコルを記述する。

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プロトコル

すべての手順は、実験動物のケアと使用のためのガイドと眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚および眼科研究協会の勧告に従って行われました。このプロトコルは、オクラホマ大学保健科学センターの施設動物管理および使用委員会(プロトコル番号15-103、18-043、および18-087)によって承認されました。

1. 滅菌ガラス針

1. 針ピペットの引き手を オンに します。
2. ディスプレイに 12.6 が表示されるまで ヒーター ノブを調整します。
3. ドアを開けて、5 μL のキャピラリーチューブを上部クランプとヒーターフィラメントに手動で供給し、チューブの半分がフィラメントの下に広がるまで(図 1A)。
4. キャピラリーチューブが上部クランプの「V」溝に入っていることを確認します。上部クランプを締めます。
5. 下側のクランプを開いた後、下側クランプが上限に達するまで垂直スライドを手動で調整します。チューブが下側クランプの「V」溝に入っていることを確認します。下側クランプを締めます。
6. ドアを閉めて、「レディ」ライトが点灯していることを確認します。[スタート]ボタンを押してヒーターとプルシーケンスを開始します(図1B)。
7. 熱と重力がキャピラリーチューブを引き離した後、ヒーターが自動的にオフになっていることを確認します(図1C)、スライドは下方に移動します。
8. 戸を開けて下さい。キャピラリーチューブの上部を保持したまま、上部クランプを締め付けます。上の毛管チューブを取り外し、脇に置きます。
9. キャピラリーチューブを下のスライドに持ち、下側クランプを締め付けます。下の毛管チューブを取り外し、脇に置きます。
10. 0.05 μm アルミナ研磨砥石プレート付きのマイクロ電極ベベラーを使用して、引っ張られた毛細管をベベルして注射針を作成します。
11. 表面を覆うのに十分な水を研削板にピペット(図1D)。.
12. ベベラーを オンに して、60 rpmで回転し始めます。引っ張られたキャピラリーチューブを「V」溝のピペットクランプに入れなさい。クランプを締め、ピペットクランプの角度を30°に調整します。
13. 粉砕プレートの回転の中心から約 3 分の距離のキャピラリー チューブの先端を調整します。
14. マニピュレータの上部にある粗いコントロールノブを調整して、クランプされたキャピラリーチューブを下げます。キャピラリーチューブの先端が水面の下に伸び、粉砕板の研磨面に接触するまでキャピラリーチューブを下げ続けます。
15. ベベラーに取り付けられた顕微鏡を使用して、ベベルの進行を監視します。5分後、細かいコントロールを調整して、グラス針を研削板から上げます。
16. ガラス針を取り外し、10倍の倍率でキャピラリーチューブの先端を確認します(図1E,F)。
17. 閉塞がないことを確認するには、ガラスの針をシリンジのピペットホルダーに挿入し、空気を99%エタノールの1 mLチューブに押し込みます。針の先端に気泡が形成される場合、針は閉塞を持たないし、マイクロインジェクションに使用することができます。このプロセスはまたガラスの針の無菌性を保障する。
18. 1つの毛細管は5 μLまで液体を握ることができる。毛細管を10セクションにマークして、針の距離を計算して0.5 μLのボリュームにマークします。将来の準備のために0.5 μLを保持する距離でスケールをマークします。5 μL 針の場合、0.7 mm 離れた距離は 0.5 μL に相当します (図 1G)。

2.バチルス・セレウス文化

1. バイオセーフティレベル2の条件下で、このセクションのすべての手順を実行します。
2. 5%の羊の血液寒天プレート上の単一コロニー分離のためのB.セレウスATCC 14579のストリークフリーザーストックは、37°Cで一晩インキュベートする(図2A)。
3. ピペット5 mLの無菌脳心注入(BHI)は、10 mLの無菌スナップキャップチューブにブロスする(図2B)。滅菌ループまたは針を使用して、寒天プレートから B.セレウス ATCC 14579の単一コロニーを選び、液体BHIを接種する。
4. サンプルを簡単に渦を出す。スナップキャップチューブを回転インキュベーターに入れる。温度を37°C、速度を200rpmに設定します。18時間後、培養器から培養液を取り除く(図2B)。

3. ビトリアルインジェクション用の細菌希釈液

1. バイオセーフティレベル2の条件下で、このセクションのすべての手順を実行します。
2. 1マイクロリットル当たり200コロニー形成単位(CFU/μL)を達成するために新鮮なBHIの10 mLに加える一晩 のB.セレウス 培養の体積を計算する。例えば、BHIの B.セレウス の一晩培養は約2 x 10⁸ CFU/mLに複製され、10μLの一晩培養を10mLの新鮮なBHIにピペット化することによって200 CFU/μLに希釈することができる。
3. 1.5 mLマイクロ遠心チューブに希釈したばかりの培養のピペット1mL。このチューブを氷の上に置いて、ビトリアルインジェクションまで続けます。細菌培養物を希釈して60分以内にビトリアル注射を行う。

4. マウスのビトリア内注射

1. バイオセーフティレベル2の条件下で、このセクションのすべての手順を実行します。
2. 手術台の上に医療の下パッドを置くことによって処置の場所を準備する。
3. マイクロインジェクター をオンに し、マイクロインジェクタに取り付けられた圧縮空気タンクのガスバルブを開きます。ガスの供給がおよそ60 psiになるまでタンクレギュレータを調節して下さい。
4. マイクロインジェクタで、画面にバランスが表示されるまでモードを押します。バランスを押して、コンピュータを操作テーブルの上に置きます。ステンレス製のピペットホルダーを、インジェクタの「充填/出力」に取り付けられたチューブに接続します。この管は常に注入器に接続される。
5. ピペットホルダーのコネクタを針の周りにしっかりとねじ込んで、ピペットホルダーのもう一方の端に毛細血管針を挿入します。
6. 眼科顕微鏡をオンにし、その光を50%の強度に点灯します。手術台の手順部位に顕微鏡を調整し、顕微鏡を所望の焦点に合わせます。
7. 手順が始まる前に、ペダル離脱反射をテストしてマウスが適切に麻酔されていることを確認します。麻酔のためのあなたのIACUC承認されたプロトコルに従ってください。
8. 麻酔マウスを医療下パッドの上に置き、鼻を右に向け、左側に傾きます。
9. 眼科顕微鏡を通してマウスの右目を見て、眼の両側の逆作用鉗子のトングを開いて注射部位を露出させることで蓋を開けて、注射部位を露出させる(図3C)。
10. マイクロインジェクターに接続されたマウスパッドを左クリックして、キャピラリー針に200 CFU/μL希釈液を充填します(図3D)。
11. 左手で動物の頭を固定し、針の先端を目の手足に置きます。針をベベルアップ位置と45°角度にして、マウスの目を穿刺しますが、注射時には針の鋭い先端(約0.5mm)のみが挿入されるようにします。
12. 針先を挿入したら、マウスヘッドからマウスパッドに左手を動かし、マウスパッドを右クリックしてB.セレウス希釈液の0.5 μLを注入します。漏れを防ぐために、マウスの目の中に針の先端を2〜3秒間放置してから(図3E)1、19、26、27、32、34、36、37、38を取り除きます。
13. 鉗子を放し、加温パッドに座っているケージにマウスを置きます。麻酔から回復するまでこれらのマウスを監視する(図3F)。
14. マウスが麻酔から回復したら、ケージを適切なラックに戻します。マウスが電気レティノグラフィーによるレチン機能解析を受ける場合、ケージは適切な暗い適応のために暗い部屋に戻す必要があります。

5.収穫管の準備

1. 1 mmの無菌ガラスビーズを1.5 mLのスクリューキャップチューブに入れます。
2. 乾燥した設定でオートクレーブでこれらのチューブを殺菌します。チューブを室温まで冷ましてから使用してください。
3. 1x無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の10 mLを無菌15 mL遠心チューブに加えます。
4. 1錠のプロテアーゼ阻害剤カクテルタブレットをチューブに加えます。^{19、27、29、34、35}を渦によって混ぜ^ます。
5. プロテアーゼ阻害剤を含む1xリン酸緩衝生理食塩基(PBS)のピペット400μLをオートクレーブ収穫チューブに各オートクレーブ収穫管に入れた。チューブにラベルを付け、氷の上に置きます。(図4A)

6. 目の収穫

1. バイオセーフティレベル2の条件下で、このセクションのすべての手順を実行します。
2. マウスを_CO2 吸入で安楽死させる。安楽死を確認するために二次的な方法を使用してください。
3. 安楽死させたマウスヘッドを安全に保持し、感染した眼の両側の細かい先端鉗子を開きます。頭に向かって押し下げて目をプロトーゼします。トングが目の地球の後ろになったら、トングを一緒に絞ります。鉗子を頭から引き離して眼球を取り外す(図4B)。
4. すぐに眼球を標識された収穫管に入れます。氷の上にチューブを60分以下に置きます(図4C)。

7. 眼内細菌数

1. バイオセーフティレベル2の条件下で、このセクションのすべての手順を実行します。
2. すべての収穫管がしっかりと閉じられ、組織ホモジナイザーの中でバランスが取れているか確認してください(図5A)。サンプルを均質化するために1分間、組織ホモジナイザーをオンにします。30 s を待ってから、さらに 1 分間電源を入れます。氷の上にチューブを置く(図5B,C)。
3. ホモジネートの20 μLを180 μLの無菌1x PBSに順次移して、各サンプルを10倍に連続して希釈します。10^-7の因子に達するまで希釈する(図5D)。
4. 適切な希釈因子で暖かい、正方形のBHIプレートの各行にラベルを付けます。各希釈液の10 μLを、約45°の傾きの上部BHIプレートに一列に移動します。サンプルがプレートの底に近くなるまで実行し、プレートを平らにして配置します(図5E)^39。
5. サンプルをBHI寒天に吸収したら、プレートを37°Cインキュベーターに移します。コロニーは、インキュベーターに入れられた後8時間目に見えるように開始する必要があります。
6. B.セレウスコロニーの成長前にインキュベーターからプレートを取り出し、個々のコロニーを識別するのを妨げる(図5F)。
7. サンプル中の濃度を正確に表す場合は、10~100コロニーの間の行を数えます。たとえば、45 コロニーを持つ^10-4 の希釈分率を持つ行は、4.5 x 10 5 CFU/mL の濃度^を 持つことになります。
8. 1眼あたりの細菌の総数を計算するには、濃度に0.4を掛け、眼の均質化に使用される1x PBSのミリリットル体積を表します。たとえば、4.5 x 10⁵ CFU/mL濃度は、1眼あたり1.8 x 10⁵ CFU B.セレウス に変換されます。

8. サンプルの保存

1. ホモジュネートサンプルをラベル付きの冷凍庫ボックスに入れ、この箱を-80°Cの冷凍庫に入れます。これらのサンプルは、後でELISAによる炎症性メディエーター分析に使用することができる。

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結果

再現性の接種およびビトウィーン内注入手順の精度を生成することは、微生物内眼炎のモデルを開発する上で重要なステップです。ここでは、グラム陽性 バチルスセレウスを用いたビトリア内注入手順を実証した。5匹のC57BL6マウスの中部に100CFU/0.5μLの B.セレウス を注入した。10時間の後の感染後、我々はおよそ1.8 x 10 5 CFU/眼に B.セレウス の眼内成長^を 観察した...

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ディスカッション

強力な抗生物質、抗炎症薬、および虚内切開手術が可能であっても、細菌性子宮内膜炎は患者を盲目にすることができます。臨床研究は、眼内炎の研究に有用であった;しかし、眼科医炎の実験モデルは、迅速かつ再現性の高い結果を提供し、治療水準の進歩に変換することができ、患者の視覚結果を向上させます。

マウスアイの膜状ボリュームは約7μL⁴⁰

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-20 µL pipette	RANIN	L0696003G	NA
37oC Incubator	Fisher Scientific	11-690-625D	NA
Bacto Brain Heart Infusion	BD	90003-032	NA
Cell Microinjector	MicroData Instrument, Inc.	PM2000	NA
Fine tip forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-122	NA
Glass beads 1.0 mm	BioSpec	11079110	NA
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific	NB-I2400	NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters	Kimble	71900-5	NA
Micro-Pipette Beveler	Sutter Instrument Co.	BV-10	NA
Microscope Axiostar Plus	Zeiss		NA
Microscope OPMI Lumera	Zeiss		NA
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	NA
Multichannel pipette 30-300 µL	Biohit	15626090	NA
Multichannel pipette 5-100 µL	Biohit	9143724	NA
Needle/Pipette Puller	Kopf	730	NA
PBS	GIBCO	1897315	Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001	Molecular grade
Reverse action forceps	Katena	K5-8228	NA