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Neste Artigo

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Resumo

Descrevemos aqui um método de injeção intravitaliana e subsequente quantitação bacteriana no modelo de camundongos de endophthalmite bacteriana. Este protocolo pode ser estendido para medir as respostas imunes do hospedeiro e a expressão genética bacteriana e hospedeira.

Resumo

Infecções bacterianas intraoculares são um perigo para a visão. Pesquisadores usam modelos animais para investigar os fatores hospedeiros e bacterianos e vias de resposta imune associadas à infecção para identificar alvos terapêuticos viáveis e testar drogas para prevenir a cegueira. A técnica de injeção intravitreal é usada para injetar organismos, drogas ou outras substâncias diretamente na cavidade vítrea no segmento posterior do olho. Aqui, demonstramos essa técnica de injeção para iniciar a infecção no olho do rato e a técnica de quantificar bactérias intraoculares. Bacillus cereus foi cultivado em mídia líquida de infusão cardíaca cerebral por 18 horas e resuspended a uma concentração de 100 unidades formadoras de colônias (UFC)/0,5 μL. Um rato C57BL/6J foi anestesiado usando uma combinação de cetamina e xilazina. Usando um microinjetor picoliter e agulhas capilares de vidro, 0,5 μL da suspensão bacilo foi injetado no vitreous médio do olho do rato. O olho de controle contralateral foi injetado com mídia estéril (controle cirúrgico) ou não foi injetado (controle absoluto). Às 10 horas após a infecção, os camundongos foram eutanizados, e os olhos foram colhidos usando pinças cirúrgicas estéreis e colocadas em um tubo contendo 400 μL estéreis PBS e 1 mm de vidro estéril. Para os ensaios ELISAs ou mieloperoxidase, o inibidor de proteinase foi adicionado aos tubos. Para extração de RNA, foi adicionado o tampão de lise apropriado. Os olhos foram homogeneizados em um homogeneizador de tecido por 1-2 minutos. Os homogeneizadores foram diluídos em 10 vezes em PBS e faixa diluída em placas de ágar. O restante dos homogeneizadores foi armazenado a -80 °C para ensaios adicionais. As placas foram incubadas por 24 horas e a UFC por olho foi quantificada. Essas técnicas resultam em infecções reprodutíveis nos olhos do camundongo e facilitam a quantitação de bactérias viáveis, a resposta imune hospedeira e a omics da expressão genética hospedeira e bacteriana.

Introdução

A endophtalmite bacteriana é uma infecção devastadora que causa inflamação e, se não tratada corretamente, pode resultar em perda de visão ou cegueira. Endophtalmite resulta da entrada de bactérias no interior do olho1,2,3,4,5. Uma vez no olho, as bactérias se replicam, produzem toxinas e outros fatores nocivos, e podem causar danos irreversíveis a delicadas células e tecidos da retina. Danos oculares também podem ser causados por inflamação, devido à ativação de vias inflamatórias que levam ao influxo de células inflamatórias no interior do olho1,5,6. A endophtalmite pode ocorrer após cirurgia intraocular (pós-operatório), lesão penetrante no olho (pós-traumática), ou de propagação metastática de bactérias no olho de um sítio anatômico diferente (endógeno)7,8,9,10. Os tratamentos para endophtalmite bacteriana incluem antibióticos, anti-inflamatórios ou intervenção cirúrgica3,4,11. Mesmo com esses tratamentos, a visão ou o próprio olho podem ser perdidos. O prognóstico visual após a endophthalmitis bacteriana geralmente varia dependendo da eficácia do tratamento, da acuidade visual na apresentação e da virulência do organismo infectante.

Bacillus cereus (B. cereus)é um dos principais patógenos bacterianos que causa endophthalmite pós-traumática7,12. A maioria dos casos de endophthalmitis de B. cereus tem um curso rápido, que pode resultar em cegueira dentro de alguns dias. As marcas de Endophthalmitis B. cereus incluem inflamação intraocular em rápida evolução, dor ocular, perda rápida de acuidade visual e febre. B. cereus cresce rapidamente no olho em comparação com outras bactérias que comumente causam infecções oculares2,4,12 e possui muitos fatores de virulência. Portanto, a janela para intervenção terapêutica bem sucedida é relativamente curta1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Os tratamentos para esta infecção geralmente são bem sucedidos no tratamento da endophthalmitis causada por outros patógenos menos virulentos, mas b. cereus endophthalmitis geralmente resulta em mais de 70% dos pacientes que sofrem de perda significativa da visão. Cerca de 50% desses pacientes são submetidos à evisceração ou enucleação do olho infectado7,16,22,23. A natureza destrutiva e rápida da endophthalmitis de B. cereus exige tratamento imediato e adequado. Avanços recentes no discernimento dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento de doenças identificaram potenciais metas de intervenção19,26,27. Modelos experimentais de camundongos de Endophthalmitis B. cereus continuam a ser úteis para discernir os mecanismos de infecção e testar potenciais terapêuticas que possam prevenir a perda de visão.

A infecção intraocular experimental de camundongos com B. cereus tem sido um modelo instrumental para a compreensão de fatores bacterianos e hospedeiros, bem como suas interações, durante a endophthalmite28. Este modelo imita um evento pós-traumático ou pós-operatório, no qual bactérias são introduzidas no olho durante uma lesão. Este modelo é altamente reprodutível e tem sido útil para testar terapias experimentais e fornecer dados para melhorias no padrão de atenção1,6,19,29,30. Como muitos outros modelos de infecção, este modelo permite o controle independente de muitos parâmetros de infecção e permite um exame eficiente e reprodutível dos desfechos de infecção. Estudos em modelo semelhante em coelhos nas últimas décadas examinaram os efeitos dos fatores de virulência de B. cereus no olho2,4,13,14,31. Ao injetar cepas mutantes B. cereus sem fatores individuais ou múltiplos de virulência, a contribuição desses fatores de virulência para a gravidade da doença pode ser medida por desfechos como a concentração de bactérias em diferentes horas de pós-infecção ou a perda da função visual13,14,27,31,32. Além disso, fatores hospedeiros foram examinados neste modelo infectando cepas de camundongos nocauteados sem fatores de hospedeiro inflamatórios específicos26,29,33,34,35. O modelo também é útil para testar tratamentos potenciais para esta doença injetando novos compostos no olho após a infecção30,36. Neste manuscrito, descrevemos um protocolo detalhado que inclui infectar um olho de rato com B. cereus,colher o olho após infecção, quantificar a carga bacteriana intraocular e preservar espécimes para avaliar parâmetros adicionais de gravidade da doença.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados seguindo as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e De Visão. Os protocolos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Oklahoma (números do protocolo 15-103, 18-043 e 18-087).

1. Agulhas de vidro estéreis

  1. Ligue o puxador de pipeta da agulha.
  2. Ajuste o botão aquecedor até que o visor apareça 12,6.
  3. Abra a porta e alimente manualmente o tubo capilar de 5 μL através do grampo superior e do filamento do aquecedor até que metade da tubulação se estenda abaixo do filamento(Figura 1A).
  4. Confirme se o tubo capilar está na ranhura "V" no grampo superior. Aperte o grampo superior.
  5. Com o grampo inferior aberto, ajuste manualmente o slide vertical até que o grampo inferior atinja seu limite superior. Confirme se o tubo está na ranhura "V" no grampo inferior. Aperte o grampo inferior.
  6. Feche a porta e confirme que a luz 'Pronta' está acesa. Pressione o botão Iniciar para iniciar o aquecedor e a sequência de puxar(Figura 1B).
  7. Certifique-se de que o aquecedor se desfaz automaticamente após o calor e a gravidade separarem o tubo capilar(Figura 1C),e o slide se move para baixo.
  8. Abra a porta. Enquanto segura a parte superior do tubo capilar, desfia o grampo superior. Retire o tubo capilar superior e reserve-o.
  9. Segure o tubo capilar no slide inferior e desnque o grampo inferior. Retire o tubo capilar inferior e reserve-o.
  10. Use um bipar microelerode com uma placa de moagem abrasiva de 0,05 μm de alumina para bivelar o tubo capilar puxado para criar as agulhas de injeção.
  11. Pipeta água suficiente na placa de moagem para cobrir a superfície(Figura 1D).
  12. Ligue o beveller para que comece a girar a 60 rpm. Coloque o tubo capilar puxado no grampo de pipeta na ranhura "V". Aperte o grampo e ajuste o ângulo do grampo de pipeta para 30°.
  13. Ajuste a ponta da borda pontiaguda do tubo capilar a aproximadamente dois terços da distância do centro de rotação da placa de moagem.
  14. Abaixe o tubo capilar fixado ajustando o botão de controle grosseiro na parte superior do manipulador. Continue a baixar o tubo capilar até que a ponta do tubo capilar se estenda abaixo da superfície da água e entre em contato com a superfície abrasiva da placa de moagem.
  15. Monitore o progresso do chanfrado usando o microscópio ligado ao beveller. Depois de 5 min, ajuste o controle fino para levantar a agulha de vidro da placa de moagem.
  16. Retire a agulha de vidro e coloque-a sob ampliação de 10x para verificar a ponta do tubo capilar (Figura 1E,F).
  17. Para garantir que não haja bloqueios, insira a agulha de vidro em um suporte de pipeta em uma seringa e empurre o ar para um tubo de 1 mL de 99% de etanol. Se as bolhas de ar se formarem na ponta da agulha, a agulha não tem bloqueios e pode ser usada para microinjeção. Este processo também garante a esterilidade das agulhas de vidro.
  18. Um tubo capilar pode conter até 5 μL de fluido. Marque o tubo capilar em 10 seções para calcular as distâncias na agulha para marcar para 0,5 μL de volumes. Marque uma escala com essa distância que contém 0,5 μL para preparação futura. Para uma agulha de 5 μL, distâncias de 0,7 mm de distância equivalem a 0,5 μL(Figura 1G).

2. Cultura Bacillus cereus

  1. Realize todos os procedimentos nesta seção sob condições de Biossegurança Nível 2.
  2. Estoque de congelador de b. cereus ATCC 14579 para isolamento de colônia única em uma placa de ágar de sangue de ovelha de 5% e incubar durante a noite a 37 °C (Figura 2A).
  3. Pipeta 5 mL de caldo de infusão cerebral estéril (BHI) em um tubo de tampa estéril de 10 mL(Figura 2B). Usando um laço ou agulha estéril, escolha uma única colônia de B. cereus ATCC 14579 da placa de ágar e inocular o BHI líquido.
  4. Vórtice a amostra brevemente. Coloque o tubo de tampa de estalo em uma incubadora giratória. Estafina a temperatura em 37 °C e a velocidade a 200 rpm. Após 18h, remova a cultura da incubadora (Figura 2B).

3. Diluição bacteriana para injeção intravitaliana

  1. Realize todos os procedimentos nesta seção sob condições de Biossegurança Nível 2.
  2. Calcule o volume da cultura B. cereus durante a noite para adicionar a 10 mL de BHI fresco para alcançar 200 unidades formadoras de colônias por microliter (UFC/μL). Por exemplo, uma cultura noturna de B. cereus em BHI replica-se para aproximadamente 2 x 108 UFC/mL, que pode então ser diluída para 200 UFC/μL por pipetação de 10 μL de cultura durante a noite em 10 mL de BHI fresco.
  3. Pipeta 1 mL da cultura recém-diluída em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL. Mantenha este tubo no gelo até a injeção intravitreal. Realize a injeção intravitreal dentro de 60 minutos de diluição da cultura bacteriana.

4. Injeção intravitreal do rato

  1. Realize todos os procedimentos nesta seção sob condições de Biossegurança Nível 2.
  2. Prepare o local do procedimento colocando subpads médicos na mesa de operação.
  3. Ligue o microinjetor e abra a válvula de gás no tanque de ar comprimido ligado ao microinjetor. Ajuste o regulador do tanque até que a entrega do gás seja de aproximadamente 60 psi.
  4. No microinjetor, pressione o modo até que a tela mostre Balance. Pressione balance e coloque o mouse do computador na mesa de operação. Conecte o suporte de pipeta de aço inoxidável à tubulação anexada ao 'Preenchimento/Saída' do injetor. Este tubo está sempre conectado ao injetor.
  5. Insira a agulha capilar na outra extremidade do suporte da pipeta, aparafusando o conector do suporte da pipeta ao redor da agulha.
  6. Ligue o microscópio oftálmico e ligue sua luz para uma intensidade de 50%. Ajuste o microscópio sobre o local do procedimento na tabela de operação e ajuste o microscópio para o foco desejado.
  7. Antes do procedimento começar, confirme se o mouse está adequadamente anestesiado testando o reflexo de retirada do pedal. Não deixe de seguir seu protocolo aprovado pela IACUC para anestesia.
  8. Coloque o rato anestesiado nos blocos médicos com o nariz apontado para a direita e inclinando-se para o lado esquerdo.
  9. Olhe para o olho direito do mouse através do microscópio oftálmico e abra as tampas abrindo as pinças de uma asseps de ação reversa em ambos os lados do olho para expor o local da injeção(Figura 3C).
  10. Encha a agulha capilar com a diluição de 200 UFC/μL à esquerda clicando no mouse pad conectado ao microinjetor(Figura 3D).
  11. Segure a cabeça do animal com a mão esquerda e coloque a ponta da agulha no limbus do olho. Com a agulha na posição bevel up e no ângulo de 45°, fure o olho do mouse, mas certifique-se de que apenas a ponta afiada da agulha (~0,5 mm) seja inserida ao injetar.
  12. Uma vez que a ponta da agulha seja inserida, mova a mão esquerda da cabeça do mouse para o mouse pad e clique à direita no mouse pad para injetar 0,5 μL da diluição B. cereus. Para evitar vazamentos, deixe a ponta da agulha dentro do olho do rato por 2-3 segundos antes de remover (Figura 3E)1,19,26,27,32,34,36,37,38.
  13. Solte os fórceps e coloque o rato em uma gaiola que está sentada em uma almofada de aquecimento. Monitore esses camundongos até que tenham se recuperado da anestesia(Figura 3F).
  14. Uma vez que os ratos são recuperados da anestesia, devolva a gaiola ao seu rack adequado. Se os camundongos serão submetidos à análise da função da retina por eletroretinaografia, as gaiolas devem ser devolvidas a uma sala escura para adaptação escura adequada.

5. Preparação do tubo de colheita

  1. Coloque contas de vidro estéreis de 1 mm em tubos de tampa de parafuso de 1,5 mL.
  2. Esterilize esses tubos em uma autoclave em um ambiente seco. Deixe os tubos esfriarem até a temperatura ambiente antes de usar.
  3. Adicione 10 mL de salina tamponada de fosfato estéril (PBS) a um tubo de centrífuga estéril de 15 mL.
  4. Adicione 1 comprimido de comprimido de coquetel inibidor de protease no tubo. Misture por vórtice19,27,29,34,35.
  5. Pipeta 400 μL de salina tamponada de fosfato de 1x (PBS) contendo inibidor de protease em cada tubo de colheita autoclaved. Rotule os tubos e coloque no gelo. (Figura 4A).

6. Colhendo os olhos

  1. Realize todos os procedimentos nesta seção sob condições de Biossegurança Nível 2.
  2. Eutanize o mouse por inalação de CO2. Use um método secundário para confirmar a eutanásia.
  3. Segure a cabeça do rato eutanizado segura e abra os fórceps finos de ponta em ambos os lados do olho infectado. Empurre para baixo em direção à cabeça para sustentar o olho. Uma vez que as pinças estão atrás do globo do olho, aperte as pinças juntas. Puxe fórceps para longe da cabeça para desprender o globo ocular(Figura 4B).
  4. Coloque imediatamente o globo ocular em um tubo de colheita rotulado. Coloque tubos no gelo por no máximo 60 min(Figura 4C).

7. Contagem bacteriana intraocular

  1. Realize todos os procedimentos nesta seção sob condições de Biossegurança Nível 2.
  2. Confirme se todos os tubos de colheita estão bem fechados e são equilibrados enquanto no homogeneizador de tecido(Figura 5A). Ligue o homogeneizador de tecido por 1 min para homogeneizar as amostras. Espere por 30 s, depois ligue por mais um minuto. Coloque tubos no gelo(Figura 5B,C).
  3. Diluir cada amostra em 10 vezes transferindo sequencialmente 20 μL do homogeneado para 180 μL de PBS 1x estéril. Diluir até que um fator de 10-7 seja atingido(Figura 5D).
  4. Rotule cada linha de uma placa BHI quente e quadrada com os fatores de diluição adequados. Transfira 10 μL de cada diluição seguida para a placa bhi superior que é inclinada aproximadamente 45°. Deixe a amostra funcionar até que quase atinja a parte inferior da placa, em seguida, coloque a placa plana (Figura 5E)39.
  5. Quando a amostra for absorvida no ágar BHI, transfira a placa para uma incubadora de 37 °C. As colônias devem começar a ser visíveis 8h após serem colocadas na incubadora.
  6. Retirar a placa da incubadora antes que o crescimento das colônias B. cereus interfira na identificação de colônias individuais(Figura 5F).
  7. Para uma representação precisa da concentração na amostra, conte a linha que tem entre 10-100 colônias. Por exemplo, uma linha com a fração de diluição de 10-4 que tem 45 colônias terá uma concentração de 4,5 x 105 UFC/mL.
  8. Para calcular o número total de bactérias por olho, multiplique a concentração por 0,4, o que representa o volume mililitro de 1x PBS usado para homogeneizar o olho. Por exemplo, a concentração de 4,5 x 105 UFC/mL se traduziria em 1,8 x 105 CFU B. cereus por olho.

8. Preservação de amostras

  1. Coloque amostras homogeneizadas em uma caixa de congelador rotulada e coloque esta caixa em um congelador de -80 °C. Estas amostras podem ser utilizadas posteriormente para análise de mediadores inflamatórios pela ELISA.

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Resultados

Gerar um inóculo reprodutível e precisão do procedimento de injeção intravitreal são passos fundamentais no desenvolvimento de modelos de endophthalmite microbiana. Aqui, demonstramos o procedimento de injeção intravitreal usando Bacillus cereusGram-positivo . Injetamos 100 UFC/0,5 μL de B. cereus no meio do vitreous de cinco camundongos C57BL6. Após 10h de pós-infecção, observou-se crescimento intraocular de B. cereus para aproximadamente 1,8 x 105 UFC/olho.

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Discussão

Mesmo com a disponibilidade de antibióticos potentes, anti-inflamatórios e cirurgia de vitrectomia, a endophtalmite bacteriana pode cegar um paciente. Estudos clínicos têm sido úteis no estudo da endophthalmite; no entanto, modelos experimentais de endophthalmitis proporcionam resultados rápidos e reprodutíveis que podem ser traduzidos para o progresso no padrão de cuidado, resultando em melhor resultado visual para os pacientes.

O volume vítreo do olho do rato é de aproximadamente 7...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos financeiros para divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Dr. Feng Li e Mark Dittmar (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) por sua ajuda. Nossa pesquisa foi apoiada pelos Institutos Nacionais de Saúde bolsas R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 e R01EY024140. Nossa pesquisa também foi apoiada pelo P30EY21725 (bolsa NIH CORE para Imagem e Análise De Animais Vivos, Biologia Molecular e Imagem Celular). Nossa pesquisa também foi apoiada pelo programa de pré-doutorado NEI Vision Science 5T32EY023202, uma bolsa de apoio à pesquisa da Fundação Presbiteriana de Saúde e uma bolsa irrestrita ao Instituto Desaprocurado A. McGee Eye de Pesquisa para Prevenir a Cegueira.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
2-20 µL pipetteRANINL0696003GNA
37oC IncubatorFisher Scientific11-690-625DNA
Bacto Brain Heart InfusionBD90003-032NA
Cell MicroinjectorMicroData Instrument, Inc.PM2000NA
Fine tip forcepsThermo Fisher Scientific12-000-122NA
Glass beads 1.0 mmBioSpec11079110NA
Incubator ShakerNew Brunswick ScientificNB-I2400NA
Microcapillary Pipets 5 MicrolitersKimble71900-5NA
Micro-Pipette BevelerSutter Instrument Co.BV-10NA
Microscope Axiostar PlusZeissNA
Microscope OPMI LumeraZeissNA
Mini-Beadbeater-16BioSpecModel 607NA
Multichannel pipette 30-300 µLBiohit15626090NA
Multichannel pipette 5-100 µLBiohit9143724NA
Needle/Pipette PullerKopf730NA
PBSGIBCO1897315Molecular grade
Protease Inhibitor CocktailRoche4693159001Molecular grade
Reverse action forcepsKatenaK5-8228NA

Referências

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