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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous décrivons ici une méthode d’injection intravitreal et de quantitation bactérienne suivante dans le modèle de souris de l’endophtalmitis bactérien. Ce protocole peut être étendu pour mesurer les réponses immunitaires de l’hôte et l’expression bactérienne et du gène hôte.

Résumé

Les infections bactériennes intraoculaires sont un danger pour la vision. Les chercheurs utilisent des modèles animaux pour étudier les facteurs hôtes et bactériens et les voies de réponse immunitaire associées à l’infection afin d’identifier des cibles thérapeutiques viables et de tester des médicaments pour prévenir la cécité. La technique d’injection intravitreal est employée pour injecter des organismes, des drogues, ou d’autres substances directement dans la cavité vitreuse dans le segment postérieur de l’oeil. Ici, nous avons démontré cette technique d’injection pour initier l’infection dans l’œil de la souris et la technique de quantification des bactéries intraoculaires. Bacillus cereus a été cultivé dans les médias liquides d’infusion de coeur de cerveau pendant 18 heures et résuspendait à une concentration 100 unités de formation de colonie (CFU)/0.5 μL. Une souris C57BL/6J a été anesthésiée à l’aide d’une combinaison de kétamine et de xylazine. À l’aide d’un microinjecteur picolitre et d’aiguilles capillaires en verre, 0,5 μL de la suspension Bacillus a été injecté dans le milieu vitreux de l’œil de la souris. L’oeil contralatéral de commande a été injecté avec le médias stérile (contrôle chirurgical) ou n’a pas été injecté (contrôle absolu). À 10 heures après l’infection, les souris ont été euthanasiées, et les yeux ont été récoltés à l’aide de pinces chirurgicales stériles et placés dans un tube contenant 400 μL de PBS stérile et 1 mm de perles de verre stériles. Pour les ELISAs ou myeloperoxidase assays, inhibiteur de la proteinase a été ajouté aux tubes. Pour l’extraction de l’ARN, le tampon de lyse approprié a été ajouté. Les yeux ont été homogénéisés dans un homogénéiseur de tissu pendant 1-2 minutes. Les homogénéisations ont été diluées en série 10 fois dans pbs et la voie diluée sur des plaques d’agar. Le reste des homogénées ont été stockés à -80 °C pour des analyses supplémentaires. Les plaques ont été incubées pendant 24 heures et cfu par oeil a été quantifié. Ces techniques entraînent des infections reproductibles dans les yeux des souris et facilitent la quantitation des bactéries viables, la réponse immunitaire de l’hôte et l’omique de l’expression des gènes de l’hôte et des bactéries.

Introduction

L’endophtalmite bactérienne est une infection dévastatrice qui provoque une inflammation et, si elle n’est pas traitée correctement, peut entraîner une perte de vision ou de cécité. L’endophtalmite résulte de l’entrée de bactéries dans l’intérieurde l’œil 1,2,3,4,5. Une fois dans l’œil, les bactéries se répliquent, produisent des toxines et d’autres facteurs nocifs, et peuvent causer des dommages irréversibles aux cellules et tissus rétiniens délicats. Les dommages oculaires peuvent également être provoqués par l’inflammation, due à l’activation des voies inflammatoires menant à l’afflux inflammatoire de cellules dansl’intérieur de l’oeil 1,5,6. L’endophtalmite peut survenir à la suite d’une chirurgie intraoculaire (postopératoire), d’une lésion pénétrante de l’œil (post-traumatique) ou d’une propagation métastatique de bactéries dans l’œil à partir d’un autre site anatomique (endogène)7,8,9,10. Les traitements de l’endophtalmite bactérienne comprennent des antibiotiques, des anti-inflammatoires ou une interventionchirurgicale 3,4,11. Même avec ces traitements, la vision ou l’œil lui-même peut être perdu. Le pronostic visuel après endophtalmite bactérienne varie généralement selon l’efficacité du traitement, l’acuité visuelle à la présentation, et la virulence de l’organisme infectieux.

Bacillus cereus (B. cereus) est l’un des principaux pathogènes bactériens qui provoque l’endophtalmite post-traumatique7,12. La majorité des cas d’endophtalmite de B. cereus ont un cours rapide, qui peut avoir comme conséquence la cécité en quelques jours. Les caractéristiques de l’endophtalmite de B. cereus incluent l’inflammation intraoculaire en évolution rapide, la douleur oculaire, la perte rapide de l’acuité visuelle, et la fièvre. B. cereus se développe rapidement dans l’œil par rapport à d’autres bactéries qui causent généralement des infectionsoculaires 2,4,12 et possède de nombreux facteurs de virulence. Par conséquent, la fenêtre pour une intervention thérapeutique réussie estrelativement courte 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Les traitements pour cette infection réussissent habituellement à traiter l’endophtalmite provoquée par d’autres agents pathogènes moins virulents, mais b. cereus endophthalmitis a généralement comme résultat plus de 70% de patients souffrant de la perte significative de vision. Environ 50% de ces patients subissent l’éviscération ou l’enucleation del’oeil infecté 7,16,22,23. La nature destructrice et rapide de l’endophtalmite de B. cereus exige un traitement immédiat et approprié. Des progrès récents dans le discernement des mécanismes sous-jacents du développement de la maladie ont identifié des ciblespotentielles pour l’intervention 19,26,27. Les modèles expérimentaux de souris de b. cereus endophthalmitis continuent d’être utiles en discernant les mécanismes de l’infection et en testant les thérapeutiques potentielles qui peuvent empêcher la perte de vision.

L’infection intraoculaire expérimentale des souris avec B. cereus a été un modèle instrumental pour comprendre des facteurs bactériens et d’hôte, aussi bien que leurs interactions, pendant l’endophthalmitis28. Ce modèle imite un événement post-traumatique ou postopératoire, dans lequel des bactéries sont introduites dans l’œil lors d’une blessure. Ce modèle est hautement reproductible et a été utile pour tester des thérapies expérimentales et fournir des données pour l’amélioration de la normede soins 1,6,19,29,30. Comme beaucoup d’autres modèles d’infection, ce modèle permet un contrôle indépendant de nombreux paramètres de l’infection et permet un examen efficace et reproductible des résultats de l’infection. Des études menées dans un modèle similaire chez les lapins au cours des dernières décennies ont examiné les effets des facteurs de virulence B. cereus dansl’œil 2,4,13,14,31. En injectant des souches mutantes B. cereus dépourvues de facteurs de virulence individuels ou multiples, la contribution de ces facteurs de virulence à la gravité de la maladie peut être mesurée par des résultats tels que la concentration de bactéries à différentes heures de postinfection ou la perte de fonctionvisuelle 13,14,27,31,32. En outre, des facteurs d’hôte ont été examinés dans ce modèle en infectant des souches de souris de KO manquant des facteurs inflammatoires spécifiquesd’hôte 26,29,33,34,35. Le modèle est également utile pour tester les traitements potentiels pour cette maladie en injectant de nouveaux composés dans l’œil après l’infection30,36. Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole détaillé qui inclut infecter un oeil de souris avec B. cereus,récolter l’oeil après infection, quantifier la charge bactérienne intraoculaire, et préserver des spécimens pour évaluer des paramètres additionnels de la sévérité de la maladie.

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Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées à la suite des recommandations du Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Les protocoles ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université de l’Oklahoma (numéros de protocole 15-103, 18-043 et 18-087).

1. Aiguilles de verre stériles

  1. Allumez le tire-pipette à aiguilles.
  2. Réglez le bouton chauffage jusqu’à ce que l’écran affiche 12,6.
  3. Ouvrez la porte et alimentez manuellement le tube capillaire de 5 μL à travers la pince supérieure et le filament de chauffage jusqu’à ce que la moitié du tube s’étende sous le filament (Figure 1A).
  4. Confirmez que le tube capillaire se trouve dans la rainure « V » dans la pince supérieure. Serrer la pince supérieure.
  5. Lorsque la pince inférieure est ouverte, ajustez manuellement la glissière verticale jusqu’à ce que la pince inférieure atteigne sa limite supérieure. Confirmez que le tube est dans la rainure « V » dans la pince inférieure. Serrer la pince inférieure.
  6. Fermez la porte et confirmez que la lumière « Ready » est allumée. Appuyez sur le bouton Démarrer pour lancer la séquence de chauffage et de traction( Figure 1B).
  7. Assurez-vous que le chauffe-eau s’éteint automatiquement après que la chaleur et la gravité ont séparé le tube capillaire(figure 1C)et que la glissière se déplace vers le bas.
  8. Ouvre la porte. Tout en tenant le dessus du tube capillaire, désespèrez la pince supérieure. Retirer le tube capillaire supérieur et le mettre de côté.
  9. Tenez le tube capillaire dans la glissière inférieure et désespèrez la pince inférieure. Retirer le tube capillaire inférieur et le mettre de côté.
  10. Utilisez un biseau microélecrode avec une plaque de broyage abrasive d’alumine de 0,05 μm pour biseauter le tube capillaire tiré pour créer les aiguilles d’injection.
  11. Pipette assez d’eau sur la plaque de broyage pour couvrir la surface( Figure 1D).
  12. Allumez le biseauté de sorte qu’il commence à tourner à 60 rpm. Placez le tube capillaire tiré dans la pince pipette dans la rainure « V ». Serrer la pince et ajuster l’angle de la pince pipette à 30°.
  13. Ajustez la pointe du bord pointu du tube capillaire à environ deux tiers de la distance du centre de rotation de la plaque de broyage.
  14. Abaissez le tube capillaire serré en ajustant le bouton de commande grossier au sommet du manipulateur. Continuer à abaisser le tube capillaire jusqu’à ce que la pointe du tube capillaire s’étende sous la surface de l’eau et entre en contact avec la surface abrasive de la plaque de broyage.
  15. Surveillez la progression du biseau à l’aide du microscope fixé au biseauté. Après 5 min, ajuster le contrôle fin pour soulever l’aiguille en verre de la plaque de broyage.
  16. Retirez l’aiguille de verre et placez-la sous le grossissement de 10x pour vérifier la pointe du tube capillaire(figure 1E,F).
  17. Pour s’assurer qu’il n’y a pas de blocages, insérez l’aiguille en verre dans un porte-pipette sur une seringue et poussez l’air dans un tube de 1 mL de 99 % d’éthanol. Si des bulles d’air se forment à l’extrémité de l’aiguille, l’aiguille n’a pas de blocages et peut être utilisée pour la microinjection. Ce processus assure également la stérilité des aiguilles en verre.
  18. Un tube capillaire peut contenir jusqu’à 5 μL de liquide. Marquer le tube capillaire en 10 sections pour calculer les distances sur l’aiguille à marquer pour 0,5 volume de μL. Marquez une échelle avec cette distance qui détient 0,5 μL pour la préparation future. Pour une aiguille de 5 μL, les distances de 0,7 mm de distance équivalent à 0,5 μL(figure 1G).

2. Bacillus cereus culture

  1. Effectuez toutes les procédures dans cette section dans des conditions de biosécurité de niveau 2.
  2. Stock de congélateur strié de B. cereus ATCC 14579 pour l’isolement d’une seule colonie sur une plaque d’agar de sang de mouton de 5 % et d’incubation pendant la nuit à 37 °C (figure 2A).
  3. Pipette 5 mL de bouillon stérile d’infusion de coeur de cerveau (BHI) dans un tube stérile de 10 mL de snap-cap(figure 2B). À l’aide d’une boucle stérile ou d’une aiguille, choisissez une seule colonie de B. cereus ATCC 14579 dans la plaque d’agar et inoculez le liquide BHI.
  4. Vortex l’échantillon brièvement. Placez le tube à capuchon dans un incubateur rotatif. Réglez la température à 37 °C et la vitesse à 200 rpm. Après 18 h, retirer la culture de l’incubateur (Figure 2B).

3. Dilution bactérienne pour injection intravitreal

  1. Effectuez toutes les procédures dans cette section dans des conditions de biosécurité de niveau 2.
  2. Calculer le volume de la culture B. cereus pendant la nuit pour ajouter à 10 mL de BHI frais pour atteindre 200 unités de formation de colonies par microlitre (CFU/μL). Par exemple, une culture nocturne de B. cereus dans BHI se reproduit à environ 2 x 108 CFU/mL, qui peut ensuite être diluée à 200 CFU/μL en pipetant 10 μL de culture du jour au lendemain en 10 mL de BHI frais.
  3. Pipette 1 mL de la culture fraîchement diluée dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Maintenir ce tube sur la glace jusqu’à l’injection intravitreal. Effectuer l’injection intravitreal dans les 60 minutes de diluer la culture bactérienne.

4. Injection intravitreal de souris

  1. Effectuez toutes les procédures dans cette section dans des conditions de biosécurité de niveau 2.
  2. Préparez le site de l’intervention en plaçant des sous-claviers médicaux sur la table d’opération.
  3. Allumez le microinjecteur et ouvrez la vanne de gaz sur le réservoir d’air comprimé fixé au microinjecteur. Réglez le régulateur de réservoir jusqu’à ce que la livraison de gaz soit d’environ 60 psi.
  4. Sur le microinjecteur, appuyez sur Mode jusqu’à ce que l’écran affiche Balance. Appuyez sur Balance et placez la souris d’ordinateur sur la table d’opération. Connectez le support de pipette en acier inoxydable au tube attaché au « remplissage/sortie » de l’injecteur. Ce tube est toujours connecté à l’injecteur.
  5. Insérez l’aiguille capillaire à l’autre extrémité du porte-pipette en vissant le connecteur du porte-pipette autour de l’aiguille.
  6. Allumez le microscope ophtalmique et allumez sa lumière à une intensité de 50%. Ajustez le microscope sur le site de la procédure sur la table d’opération et ajustez le microscope à la mise au point désirée.
  7. Avant le début de la procédure, confirmez que la souris est adéquatement anesthésiée en testant le réflexe de retrait de la pédale. Assurez-vous de suivre votre protocole approuvé par l’IACUC pour l’anesthésie.
  8. Placez la souris anesthésiée sur les dessous médicaux avec son nez pointé vers la droite et appuyé sur son côté gauche.
  9. Regardez l’œil droit de la souris à travers le microscope ophtalmique et ouvrez les couvercles en ouvrant les pinces d’une force d’action inverse de chaque côté de l’œil pour exposer le site d’injection (Figure 3C).
  10. Remplissez l’aiguille capillaire de la dilution de 200 CFU/μL en cliquant à gauche sur le tapis de souris connecté au microinjecteur (Figure 3D).
  11. Fixez la tête de l’animal avec la main gauche et placez le bout de l’aiguille dans les limbes de l’œil. Avec l’aiguille en position biseauté et à angle de 45°, perforez l’œil de la souris, mais assurez-vous que seule la pointe pointue de l’aiguille (~0,5 mm) est insérée lors de l’injection.
  12. Une fois que la pointe de l’aiguille est insérée, déplacez la main gauche de la tête de la souris vers le tapis de souris et cliquez à droite sur le tapis de souris pour injecter 0,5 μL de la dilution B. cereus. Pour éviter les fuites, laissez la pointe de l’aiguille à l’intérieur de l’œil de la souris pendant 2-3 secondes avantd’enlever(Figure 3E) 1,19,26,27,32,34,36,37,38.
  13. Relâchez les forceps et placez la souris dans une cage qui est assise sur un coussin chauffant. Surveillez ces souris jusqu’à ce qu’elles se soient remises del’anesthésie ( Figure 3F).
  14. Une fois que les souris sont récupérées de l’anesthésie, retourner la cage à son rack approprié. Si les souris sont soumises à l’analyse de la fonction rétinienne par électrorétinographie, les cages doivent être retournées dans une pièce sombre pour une bonne adaptation sombre.

5. Préparation du tube de récolte

  1. Placer des perles de verre stériles de 1 mm dans des tubes de bouchon à vis de 1,5 mL.
  2. Stériliser ces tubes dans un autoclave sur un réglage sec. Laisser refroidir les tubes à température ambiante avant de les utiliser.
  3. Ajouter 10 mL de saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à un tube stérile de centrifugeuse de 15 mL.
  4. Ajouter 1 comprimé de comprimé de cocktail inhibiteur de la protéase dans le tube. Mélanger en vortexant19,27,29,34,35.
  5. Pipette 400 μL de saline 1x tamponnée de phosphate (PBS) contenant l’inhibiteur de protéase dans chaque tube de récolte autoclavé. Étiqueter les tubes et les placer sur la glace. (Figure 4A).

6. Récolter les yeux

  1. Effectuez toutes les procédures dans cette section dans des conditions de biosécurité de niveau 2.
  2. Euthanasier la souris par inhalation de CO2. Utilisez une méthode secondaire pour confirmer l’euthanasie.
  3. Tenez la tête de souris euthanasiée en sécurité et ouvrez les forceps fines de pointe de chaque côté de l’œil infecté. Poussez vers le bas vers la tête pour proptose l’oeil. Une fois que les pinces sont derrière le globe de l’œil, presser les pinces ensemble. Tirez les forceps loin de la tête pour détacher le globe oculaire (Figure 4B).
  4. Placez immédiatement le globe oculaire dans un tube de récolte étiqueté. Placez les tubes sur la glace pendant au plus 60 min(figure 4C).

7. Nombre bactérien intraoculaire

  1. Effectuez toutes les procédures dans cette section dans des conditions de biosécurité de niveau 2.
  2. Confirmez que tous les tubes de récolte sont étroitement fermés et équilibrés dans l’homogénéiseur tissulaire (figure 5A). Allumez l’homogénéiseur tissulaire pendant 1 min pour homogénéiser les échantillons. Attendez 30 s, puis allumez une minute de plus. Placer les tubes sur laglace ( figure 5B,C).
  3. Diluer périodiquement chaque échantillon 10 fois en transférant séquentiellement 20 μL de l’homogénéité en 180 μL de 1x PBS stérile. Diluer jusqu’à ce qu’un facteurde 10 -7 soit atteint( Figure 5D).
  4. Étiquetez chaque rangée d’une plaque BHI chaude et carrée avec les facteurs de dilution appropriés. Transférer 10 μL de chaque dilution d’affilée vers la plaque BHI supérieure inclinée d’environ 45°. Laissez l’échantillon courir jusqu’à ce qu’il atteigne presque le fond de la plaque, puis mentez la plaque à plat (Figure 5E)39.
  5. Lorsque l’échantillon est absorbé dans l’agar BHI, transférer la plaque dans un incubateur de 37 °C. Les colonies doivent commencer à être visibles à 8 h après avoir été placées dans l’incubateur.
  6. Retirer la plaque de l’incubateur avant que la croissance des colonies de B. cereus n’interfère avec l’identification des colonies individuelles (figure 5F).
  7. Pour une représentation précise de la concentration dans l’échantillon, comptez la ligne qui a entre 10-100 colonies. Par exemple, une rangée avec la fraction de dilution de10-4 qui a 45 colonies aura une concentration de 4,5 x 105 CFU/mL.
  8. Pour calculer le nombre total de bactéries par œil, multipliez la concentration par 0,4, ce qui représente le volume millilitre de 1x PBS utilisé pour homogénéiser l’œil. Par exemple, la concentration de 4,5 x 105 CFU/mL se traduirait par 1,8 x 105 CFU B. cereus par œil.

8. Conservation des échantillons

  1. Placer les échantillons d’homogénéité dans une boîte de congélation étiquetée et placer cette boîte dans un congélateur de -80 °C. Ces échantillons peuvent être utilisés plus tard pour l’analyse inflammatoire du médiateur par ELISA.

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Résultats

La génération d’un inoculum reproductible et l’exactitude de la procédure d’injection intravitreal sont des étapes clés dans le développement de modèles d’endophtalmite microbienne. Ici, nous avons démontré la procédure d’injection intravitreal utilisant Gram-positive Bacillus cereus. Nous avons injecté 100 CFU/0,5 μL de B. cereus dans le milieu vitreux de cinq souris C57BL6. Après 10 h postinfection, nous avons observé la croissance intraoculaire de B. cereus à approxi...

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Discussion

Même avec la disponibilité d’antibiotiques puissants, de médicaments anti-inflammatoires et de chirurgie vitrectomie, l’endophtalmite bactérienne peut aveugler un patient. Les études cliniques ont été utiles dans l’étude de l’endophtalmite; cependant, les modèles expérimentaux de l’endophtalmite fournissent des résultats rapides et reproductibles qui peuvent être traduits au progrès dans la norme de soin, ayant pour résultat de meilleurs résultats visuels pour des patients.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit financier à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient le Dr Feng Li et Mark Dittmar (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, États-Unis) pour leur aide. Nos recherches ont été soutenues par les subventions des National Institutes of Health R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 et R01EY024140. Nos recherches ont également été appuyées par P30EY21725 (subvention NIH CORE pour l’imagerie et l’analyse des animaux vivants, la biologie moléculaire et l’imagerie cellulaire). Notre recherche a également été appuyée par le programme de stages prédoctoraux NEI Vision Science 5T32EY023202, une subvention de soutien à la recherche de la Fondation presbytérienne de la santé et une subvention sans restriction au Dean A. McGee Eye Institute de Research to Prevent Blindness.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2-20 µL pipetteRANINL0696003GNA
37oC IncubatorFisher Scientific11-690-625DNA
Bacto Brain Heart InfusionBD90003-032NA
Cell MicroinjectorMicroData Instrument, Inc.PM2000NA
Fine tip forcepsThermo Fisher Scientific12-000-122NA
Glass beads 1.0 mmBioSpec11079110NA
Incubator ShakerNew Brunswick ScientificNB-I2400NA
Microcapillary Pipets 5 MicrolitersKimble71900-5NA
Micro-Pipette BevelerSutter Instrument Co.BV-10NA
Microscope Axiostar PlusZeissNA
Microscope OPMI LumeraZeissNA
Mini-Beadbeater-16BioSpecModel 607NA
Multichannel pipette 30-300 µLBiohit15626090NA
Multichannel pipette 5-100 µLBiohit9143724NA
Needle/Pipette PullerKopf730NA
PBSGIBCO1897315Molecular grade
Protease Inhibitor CocktailRoche4693159001Molecular grade
Reverse action forcepsKatenaK5-8228NA

Références

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