解剖されたインプラント組織の免疫機能解析のための高次元フローサイトメトリー

要約

解剖されたインプラントからの細胞の単離とフローサイトメトリーによる特性評価は、インプラントに対する免疫応答のパターンの理解に大きく貢献します。この論文では、解剖したインプラントから細胞を単離し、フローサイトメトリー解析のために染色するための正確な方法について説明します。

要約

実験室で培養した組織または医療機器を個人に埋め込むことの成功は、レシピエント宿主の免疫応答の影響を受けます。インプラントを異物と見なすと、敵対的で調節不全の免疫応答はインプラントの拒絶反応につながる可能性がありますが、調節された反応とホメオスタシスの回復はインプラントの受容につながる可能性があります。 in vivo または ex vivo 環境で解剖されたインプラントの微小環境を分析することは、免疫応答のパターンを理解するのに役立ち、最終的には新世代の生体材料の開発に役立ちます。フローサイトメトリーは、細胞表面マーカーに基づいて免疫細胞とそのサブセットを特徴付けるためのよく知られた手法です。このレビューでは、解剖されたインプラント組織から均一な細胞懸濁液を単離するための、手動ダイシング、酵素消化、およびセルストレーナーによるろ過に基づくプロトコルについて説明します。さらに、マルチカラーフローサイトメトリー染色プロトコルと、フローサイトメトリーによってこれらの単離細胞を特徴付けおよび定量するためのサイトメーターの初期設定の手順について説明しました。

概要

医学分野の進歩により、損傷した組織の機能や再成長をサポートするために、埋め込まれた材料が頻繁に使用されるようになりました^1,2。これらには、ペースメーカー、再建美容インプラント、骨折固定に使用される整形外科用プレートなどのデバイスが含まれます^3,4。しかし、これらのインプラントを製造するために使用される材料とそれらが埋め込まれる場所は、これらのインプラントの成功を決定する上で重要な^{役割を果たします5,6,7}。異物として、これらのインプラントは宿主から免疫応答を引き起こし、拒絶反応または耐性^{につながる可能性があります8。}この要因により、生体材料研究は、移植後に望ましい免疫応答を引き付けることができる材料を生成するように推進されています9,10,11,12。

免疫応答は、損傷した組織または臓器を交換するために実験室で生体材料骨格(足場)の周りに組織または臓器を成長させる再生医療の分野で不可欠な要件です13,14,15,16。再生医療では、細胞、シグナル、足場を使用して欠損または損傷した組織を補うことが目標であり、それぞれが免疫応答によって大きく調節される可能性がある¹⁷。さらに、免疫応答の欠如が望まれる場合でも、望まれるのは、調節プロファイルの存在ではなく、免疫活性の欠如であることは非常にまれである¹⁸。フローサイトメトリーなどの技術は、インプラントデバイスのコーティングや組織工学のための足場の開発に使用されるさまざまな生体材料に対する免疫応答のパターンを特徴付ける上で重要な役割を果たすことができる¹⁹。

この情報は、最終的に、免疫系に十分に耐えられるインプラント用の生体材料の開発や、組織工学において建設的な役割を果たすことができる足場の開発に役立ちます。フローサイトメトリーによる分析用のサンプルを適切に調製することは、蛍光活性化細胞選別による免疫特性評価の不正確な結果を回避するための重要なステップです^20,21。したがって、このレビューでは、足場組織からの細胞の単離、細胞懸濁液の染色、およびフローサイトメトリーによる分析に利用できる詳細な方法論を提示します。

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プロトコル

注: 図1 に、フローサイトメトリープロトコルの概要を示します。

1)試薬調製

1. 酵素を希釈し、組織培養用の培地を調製します。
   1. 5 mLの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)緩衝液を500 mLのRPMI培地に添加し、よく振とうします。さらに使用するまで、培地を4°Cで保管してください。
2. 酵素溶液の体積を計算します。
   注:酵素溶液の容量は、6ウェルプレートでさいの目に切った組織を消化するために必要な酵素(コラゲナーゼおよびDNase I)を含む培地の容量です。サンプル数によります。
   1. 次の式を使用して、必要な体積を計算します。
      (消化するサンプル数) × 5 mL の無血清 RPMI と 10 mM HEPES バッファー
      注:例えば、0.1〜0.3gの解剖された脾臓の場合、5 mLの培地を使用して酵素溶液を調製します。この原稿に記載されている酵素消化プロトコルは、主に脳、腎臓、皮膚、肝臓、肺、脾臓、筋肉、および合成材料または細胞外マトリックスタンパク質で作られた皮下インプラントの周りのカプセルを含むマウスから解剖された軟組織(0.1〜1 gの範囲)用です。硬い軟骨組織を消化するには、さまざまな条件と消化酵素の量が必要になる場合がありますが、これは最適化によってのみ確認できます。
   2. 酵素溶液に必要なコラゲナーゼとDNaseの量を計算します。
      注:このプロトコルでは、0.25 mg/mL のコラゲナーゼと 0.2 mg/mL の DNase I を使用しました。コラゲナーゼとDNaseに必要な使用濃度は、組織の種類によって異なる可能性があります¹⁹。
3. 999 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に1 μLの生存率色素( 材料表を参照)を加え、溶液をボルテックスして、1:1000の生存率の色素溶液を調製します。さらに使用するまで、溶液を4°Cの暗所で保管してください。
4. 100 mLのPBSに1gのウシ血清アルブミン(BSA)を加えて染色バッファーを調製し、BSAが完全に溶解するまで溶液をボルテックスします。さらに使用するまで、溶液を4°Cで保存してください。

2)酵素消化プレートのセットアップ

1. 各ウェルに 70 μm のセルストレーナーを備えた 6 ウェルプレートをセットします。ステップ1.1.1で調製した培地3 mLを各ウェルに加え、氷上でインキュベートします。
2. 残りの培地(2 mL/ウェル)を37°Cのインキュベーターまたはウォーターバスに保存し、計算された量のコラゲナーゼとDNase Iを懸濁します(ステップ1.2.2)。

3)細胞の単離

1. 解剖したインプラント/組織をプレートに入れ、ハサミを使用して細かくさいの目に切ります。あるいは、組織解離装置またはハンドヘルドホモジナイザーを使用した機械的破壊法を利用します。白血球の数が多いため、脾臓を解剖して、各ランで染色コントロールとして利用します。
   注:一部の材料はより高いレベルの線維化を誘発するため、このプロトコルは、線維化度の高い材料と線維化の少ない材料の両方に適用できます。ただし、各処理方法は、染色前に消化後の細胞収量と生存率の両方について評価する必要があります。解剖中の末梢血汚染を避けてください。
2. コラゲナーゼとDNase I(ステップ1.2.2で計算した容量)を、37°Cに加温した残りのRPMI(2 mL)に加えます。 各ウェルに2 mLの完全酵素溶液を加えます。
3. プレートをインキュベートシェーカーに入れ、37°C、100rpmで45分間加熱します。
   注意: プレートを積み重ねるときは、適切な熱伝達を妨げる可能性があるため、注意してください。
4. その間、1000μLのチップの端から3〜4mmをハサミで切り刻んで、懸濁液分注チップを準備します。インキュベーション後、ウェル内の懸濁液を上下にピペットで移し、みじん切りチップを使用して完全に混合します。セルストレーナーを50 mLのコニカルチューブの上部に置き、消化した溶液をセルストレーナーに通します。
   注:70 μmのセルストレーナーは、アルギン酸塩などの移植された生体材料から細胞を分離するのに十分です。より高い純度が必要な場合は、密度勾配分離などのプロセスを使用して、濃縮された白血球集団を取得します。
5. ウェルを1x PBS溶液で洗浄し、すすぎ量をストレーナーに移し、続いてチューブ内の容量が50 mLに達するまで1x PBS溶液でストレーナーの洗浄液を追加します。
   注:1x PBSは、消化物の粘度の上昇を防ぎ、遠心分離中に細胞をペレット化できるように、室温で使用する必要があります。
6. チューブを室温で300× g で5分間遠心分離します。遠心分離後、ペレットを乱さずに血清ピペットを用いて上清を注意深く吸引します。ペレットを1000 μLの1x PBSに再懸濁し、懸濁液を微量遠心チューブに移します。
7. 細胞懸濁液10μLとトリパンブルー10μLを混合し、自動セルカウンターで細胞を計数する計数チャンバースライド、または顕微鏡下で従来の方法で計数する血球計算盤に懸濁液をセットします。あるいは、フローサイトメトリー細胞計数ビーズを使用します。

4) フローサイトメトリーのための染色

1. 図 2 に、45 サンプル、蛍光マイナス 1(FMO)コントロール、補正コントロール、および完全に染色された脾臓サンプルコントロールを使用した 14 色実験のプレートレイアウトの例を参照してください。細胞の総数を推定した後、各サンプルについて×1〜10⁶細胞、および各補償およびFMOコントロールについて0.5×10⁶細胞の染色に必要な細胞懸濁液の量を計算します。必要な容量の細胞懸濁液を V 底 96 ウェルプレートのウェルに分注し、1x PBS で容量を 100 μL にします。
   注:例として、ステップ3.6で得られた1000μLの細胞懸濁液が40×10 6細胞を含む場合、1×10 6細胞の場合、1000/40 × 10⁶ = 25μLの細胞懸濁液が必要になります。
2. プレートを300 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引した後、細胞をサンプルウェルおよびコンペンセーションコントロールウェルに再懸濁し、100 μLの1:1000の生存率色素溶液で生存率を測定します( 材料表を参照)。
3. 他のコンペンセーションウェル、FMO、未染色ウェルの細胞については、100 μLの1x PBSで再懸濁します。
4. 細胞を暗所で4°Cで30分間インキュベートします。
5. その間に、サンプルとFMOコントロールを染色するための表面抗体カクテル(サンプルあたり50 μLまたはFMO)を調製します。抗体カクテルの一例については、 表1 を参照してください。
6. インキュベーション後、1x PBS100 μLを各ウェルに加え、300 × g で4°Cで5分間スピンダウンします。
7. 上清を吸引し、200 μLの染色バッファー(1x PBS + 1% BSA)に再懸濁します。300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
8. 上清を吸引し、50 μL の 1x PBS でコンペンセーションウェル、FMO、および未染色ウェルに細胞を再懸濁します。50 μLの抗体カクテルをそれぞれのサンプルウェルとFMOウェルに加えます。それぞれの抗体を異なる補正ウェルに添加します。
9. プレートを暗所で4°Cで45分間インキュベートします。 インキュベーション後、各ウェルに150μLの染色バッファーを加え、細胞懸濁液を300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
10. 上清を吸引し、200 μLの染色緩衝液で細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
11. 固定せずにサンプルを分析する場合は、200 μLの染色バッファーに再懸濁し、サイトメーターのセットアップとサンプル分析のセクション6に進みます。細胞を固定する場合は、洗浄後に上清を吸引し、4%パラホルムアルデヒドなどの固定液を100μL添加します。細胞内マーカーを染色する場合は、細胞内染色に関するセクション5に進み、細胞を固定して透過処理します( 材料表参照)。細胞を暗所で4°Cで20分間インキュベートします。
    注:固定は一部の蛍光色素の蛍光強度に影響を与える可能性があるため、固定の有無にかかわらず各パネルを評価してください。
12. インキュベーション後、1x PBSを100 μL添加し、300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、1x PBSに再懸濁し、300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
13. 細胞を200 μLの染色バッファーに再懸濁し、フローサイトメトリー解析の前に4°Cで保存します。

5)細胞内染色

1. 細胞内マーカーの固定および透過処理のステップ 4.11 に引き続き、適切なバッファーを 100 μL 添加します。細胞を350 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上澄みを吸引し、ペレットを200μLの固定浸透剤溶液に再懸濁する。細胞を350 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、適切なバッファーで希釈した細胞内抗体でペレットを再懸濁します。
   注:抗体の種類と希釈率は、標的細胞によって異なります。例えば、一般的な細胞内マーカーの1つは、制御性T細胞用のフォークヘッドボックスP3であり、これは希釈倍率1:100で頻繁に使用されます。
2. 細胞懸濁液を暗所で4°Cで45分間インキュベートします。 インキュベーション後、150 μLの適切な緩衝液を添加し、懸濁液を350 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
3. 上清を吸引し、細胞を200 μLの染色バッファーに再懸濁した後、300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 細胞を200 μLの染色バッファーに吸引し、再懸濁してフローサイトメトリー解析を行います。

6) サイトメーターとコンペンセーションのセットアップ

1. サンプルを泳動する直前に、細胞ベースの補正ではなくビーズベースの補正を利用する場合は、補正ビーズ( 材料表を参照)を調製します。
   1. 蛍光色素標識抗体ごとに別々の微量遠心チューブを標識し、1x PBS 100 μLに続いて、抗マウスネガティブコントロール補正ビーズを1滴、ポジティブコントロール補償ビーズを1滴ずつ各チューブに加えます。適切な抗体1 μLを別々のチューブにそれぞれ添加します。ボルテックスし、5分間インキュベートしてから取得します。
      注:BUV737などの一部の色素はビーズに結合できないため、細胞ベースのコントロールを使用してください。
2. 各実験の前に、トラッキングビーズを使用してサイトメーターのセットアップを実行してフローサイトメーターをキャリブレーションし、各実験のフローサイトメーターの設定を維持します。
3. サンプルを分析する前に、未染色のサンプルを実行してフローサイトメーターを調整し、側方散乱(SSC)対前方散乱(FSC)プロットで細胞集団を調整し、細胞集団がプロットの中央に収まり、スケールがずれないようにします。
4. 染色したサンプルを短時間分析して、FSCとSSCの電圧を調整し、各チャンネルの対数スケールから外れたイベントがないことを確認します。各補正コントロールで 5,000 イベントを記録し、その後、陽性母集団と陰性母集団のゲートが続きます。補正行列を計算してからサンプルを実行し、対象母集団の少なくとも 1,000 個のイベントを収集します。
   注:自動補正は過大または過少の補正になりやすいため、大きなカラーパネルでの補正を確認する必要があります。各パラメータを他のすべてのパラメータに対してグラフ化して、過大または過小補正の兆候を監視し、各単色コントロールを評価する必要があります。カラーの大きい実験の複雑な補正は、フローサイトメトリーの経験が豊富な共同研究者またはコア施設の支援を受けて実施する必要があります。スペクトルサイトメーターなどの新しいタイプのフローサイトメーターは、スペクトルアンミキシングと呼ばれるプロセスを通じて蛍光色素のフルスペクトルを利用するため、標準的な補正のみの場合と比較して、蛍光オーバーラップをより明確に区別することができます²²。

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結果

免疫解析用のフローサイトメトリーパネルの開発プロセスでは、多くの場合、既存のデータやその分野の文献との結果との比較に依存しています。フローサイトメトリーで集団がどのように現れるかに関する知識は、データを適切に解釈するために重要です。いずれにせよ、集団や細胞の種類は組織によって異なるように見えるため、ある程度のばらつきが予想され?...

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ディスカッション

このレビューでは、生体材料インプラントから細胞を単離し、均一な細胞懸濁液を得るための詳細な方法論について述べる。さらに、マルチカラーフローサイトメトリー用の細胞懸濁液を染色するための詳細なプロトコルと、最適な結果を得るためにフローサイトメーターを構成するための手順が提供されています。細胞単離法には複数のステップがあり、多くの場合、手動の組織解剖とそ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-432-22
6 Well Plate	Fisher Scientific	07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer Plus	BD Biosciences	566385
BD Cytofix	BD Biosciences	554655	For only fixing cells
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A7906	For preparing FACS staining buffer
CD11b AF700	Biolegend	101222	Clone: M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5	Biolegend	117325	Clone: N418
CD197 PE/Dazzle594	Biolegend	120121	Clone: 4B12
CD200R3 APC	Biolegend	142207	Clone: Ba13
CD206 PE	Biolegend	141705	Clone: C068C2
CD45 BUV737	BD Biosciences	612778	Clone: 104/A20
CD86 BUV395	BD Biosciences	564199	Clone: GL1
CD8a BV421	Biolegend	100737	Clone: 53-6.7
Comp Bead anti-mouse	BD Biosciences	552843	For compensation control
DNase I	Millipore Sigma	11284932001	Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I)
F4/80 PE/Cy7	Biolegend	123113	Clone: BM8
Fc Block	Biolegend	101301	Clone: 93
Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD Biosciences	554714	For fixing and permeabilization of cells.
HEPES buffer	Thermo Fisher	15630080	Buffer to supplement cell media
Liberase	Millipore Sigma	5401127001	Blend of purified Collagenase I and Collagenase II
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L23105	Viability dye
Ly6c AF488	Biolegend	128015	Clone: HK1.4
Ly6g BV510	Biolegend	127633	Clone: 1A8
MHCII BV786	BD Biosciences	742894	Clone: M5/114.15.2
Phosphate buffer saline	Thermo Fisher	D8537
RPMI	Thermo Fisher	11875176	Cell culture media
Siglec F BV605	BD Biosciences	740388	Clone: E50-2440
V-bottom 96-well plate