Hochdimensionale Durchflusszytometrie zur Immunfunktionsanalyse von präpariertem Implantatgewebe

Zusammenfassung

Die Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie kann wesentlich zum Verständnis des Musters der Immunantwort gegen Implantate beitragen. In dieser Arbeit wird eine präzise Methode zur Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Färbung für die durchflusszytometrische Analyse beschrieben.

Zusammenfassung

Der Erfolg der Implantation von im Labor gezüchtetem Gewebe oder eines medizinischen Geräts in eine Person hängt von der Immunantwort des Empfängerwirts ab. Betrachtet man ein Implantat als Fremdkörper, kann eine feindliche und dysregulierte Immunantwort zur Abstoßung des Implantats führen, während eine regulierte Reaktion und Wiedererlangung der Homöostase zu seiner Akzeptanz führen kann. Die Analyse der Mikroumgebungen von Implantaten, die unter In-vivo- oder Ex-vivo-Bedingungen präpariert werden, kann dazu beitragen, das Muster der Immunantwort zu verstehen, was letztendlich zur Entwicklung neuer Generationen von Biomaterialien beitragen kann. Die Durchflusszytometrie ist eine bekannte Technik zur Charakterisierung von Immunzellen und ihren Untergruppen anhand ihrer Zelloberflächenmarker. Diese Übersichtsarbeit beschreibt ein Protokoll, das auf manuellem Würfeln, enzymatischem Aufschluss und Filtration durch ein Zellsieb zur Isolierung einheitlicher Zellsuspensionen aus präpariertem Implantatgewebe basiert. Des Weiteren wurde ein mehrfarbiges Durchflusszytometrie-Färbeprotokoll erläutert, zusammen mit Schritten für anfängliche Zytometereinstellungen, um diese isolierten Zellen durch Durchflusszytometrie zu charakterisieren und zu quantifizieren.

Einleitung

Fortschritte auf dem Gebiet der Medizin haben dazu geführt, dass häufig implantierte Materialien zur Unterstützung der Funktion oder des Nachwachsens von geschädigtem Gewebe verwendet werden ^1,2. Dazu gehören Geräte wie Herzschrittmacher, rekonstruktive kosmetische Implantate und orthopädische Platten, die zur Fixierung von Knochenbrüchen verwendet werden ^3,4. Die Materialien, die zur Herstellung dieser Implantate verwendet werden, und die Stellen, an denen sie implantiert werden, spielen jedoch eine wichtige Rolle für den Erfolg dieser Implantate ^5,6,7. Als Fremdkörper können diese Implantate eine Immunantwort des Wirts hervorrufen, die entweder zu einer Abstoßung oder zu einer Toleranz führen kann⁸. Dieser Faktor hat die Biomaterialforschung vorangetrieben, um Materialien zu entwickeln, die nach der Implantation die gewünschte Immunantwort hervorrufen^können 9,10,11,12.

Die Immunantwort ist eine wesentliche Voraussetzung im Bereich der regenerativen Medizin, bei der ein Gewebe oder ein Organ in einem Labor um ein Biomaterialskelett (Gerüst) herum gezüchtet wird, um ein beschädigtes Gewebe oder Organ zu ersetzen^13,14,15,16. In der regenerativen Medizin besteht das Ziel darin, fehlendes oder beschädigtes Gewebe durch den Einsatz von Zellen, Signalen und Gerüsten zu ersetzen, von denen jedes durch Immunantworten stark moduliert werden kann¹⁷. Selbst wenn eine fehlende Immunantwort erwünscht ist, ist es sehr selten eine Abwesenheit von Immunaktivität und nicht das Vorhandensein eines regulatorischen Profils, das erwünscht ist¹⁸. Techniken wie die Durchflusszytometrie können eine wichtige Rolle bei der Charakterisierung des Musters der Immunantwort auf verschiedene Biomaterialien spielen, die für die Beschichtung von Implantaten oder für die Entwicklung von Gerüsten für das Tissue Engineering verwendet werden¹⁹.

Diese Informationen wiederum werden letztendlich dazu beitragen, Biomaterialien für Implantate zu entwickeln, die vom Immunsystem gut vertragen werden können, oder Gerüste zu entwickeln, die eine konstruktive Rolle beim Tissue Engineering spielen können. Die richtige Vorbereitung der Proben für die Analyse mittels Durchflusszytometrie ist ein wichtiger Schritt, um ungenaue Ergebnisse bei der Immuncharakterisierung durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung zu vermeiden^20,21. Daher wird in dieser Übersichtsarbeit eine detaillierte Methodik vorgestellt, die für die Isolierung von Zellen aus Gerüstgewebe, die Färbung der Zellsuspension und die Analyse mittels Durchflusszytometrie verwendet werden kann.

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Protokoll

HINWEIS: Abbildung 1 gibt einen Überblick über das Durchflusszytometrieprotokoll.

1) Vorbereitung der Reagenzien

1. Bereiten Sie Medien für die Verdünnung von Enzymen und für die Gewebekultur vor.
   1. 5 ml 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES)-Pufferlösung in 500 ml RPMI-Medium geben und gut schütteln. Lagern Sie das Medium bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.
2. Berechnen Sie das Volumen der Enzymlösung.
   ANMERKUNG: Das Volumen der Enzymlösung ist das Volumen des Mediums, das die Enzyme (Kollagenase und DNase I) enthält, die benötigt werden, um gewürfeltes Gewebe in 6-Well-Platten zu verdauen; Das hängt von der Anzahl der Proben ab.
   1. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um das erforderliche Volumen zu berechnen:
      (Anzahl der zu verdauenden Proben) × 5 ml serumfreies RPMI mit 10 mM HEPES-Puffer
      HINWEIS: Verwenden Sie beispielsweise für 0,1 bis 0,3 g präparierte Milz 5 ml Medium, um die Enzymlösung herzustellen. Das in diesem Manuskript beschriebene enzymatische Verdauungsprotokoll ist in erster Linie für Weichgewebe (im Bereich von 0,1 bis 1 g) von Mäusen bestimmt, die das Gehirn, die Niere, die Haut, die Leber, die Lunge, die Milz, die Muskeln sowie Kapseln um subkutane Implantate aus synthetischen Materialien oder extrazellulären Matrixproteinen umfassen. Die Verdauung von hartem Knorpelgewebe kann unterschiedliche Bedingungen und Volumina von Verdauungsenzymen erfordern, die nur durch Optimierung festgestellt werden können.
   2. Berechnen Sie die Menge an Kollagenase und DNase, die ich für die Enzymlösung benötigte.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wurden 0,25 mg/ml Kollagenase und 0,2 mg/ml DNase I verwendet. Die für Kollagenase und DNase erforderlichen Arbeitskonzentrationen können für verschiedene Gewebetypen variieren¹⁹.
3. Bereiten Sie eine Viabilitätsfarbstofflösung im Verhältnis 1:1000 vor, indem Sie 1 μl des Viabilitätsfarbstoffs (siehe Materialtabelle) zu 999 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) geben und die Lösung vortexen. Lagern Sie die Lösung bis zur weiteren Verwendung im Dunkeln bei 4 °C.
4. Bereiten Sie den Färbepuffer vor, indem Sie 1 g Rinderserumalbumin (BSA) zu 100 ml PBS geben und die Lösung aufwirbeln, bis BSA vollständig aufgelöst ist. Lagern Sie die Lösung bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.

2) Aufstellen von enzymatischen Aufschlussplatten

1. Richten Sie eine 6-Well-Platte mit 70-μm-Zellfiltern in jeder Vertiefung ein. In jede Vertiefung werden 3 ml des vorbereiteten Mediums aus Schritt 1.1.1 gegeben und auf Eis inkubiert.
2. Das verbleibende Medium (2 ml/Well) wird in einem Inkubator oder Wasserbad bei 37 °C gelagert, um die berechnete Menge an Kollagenase und DNase I zu suspendieren (Schritt 1.2.2).

3) Isolierung von Zellen

1. Legen Sie die präparierten Implantate/Gewebe in Platten und würfeln Sie sie mit einer Schere fein. Alternativ können Sie auch eine mechanische Aufschlussmethode mit einem Gewebedissoziator oder einem tragbaren Homogenisator anwenden. Aufgrund der hohen Anzahl von Leukozyten sollte die Milz präpariert werden, um sie bei jedem Durchlauf als Färbekontrolle zu verwenden.
   HINWEIS: Da einige Materialien ein höheres Maß an Fibrose induzieren, ist dieses Protokoll sowohl für hochfibrotische als auch für minimal fibrotische Materialien anwendbar. Jede Verarbeitungsmethode sollte jedoch vor der Färbung sowohl auf die Zellausbeute als auch auf die Lebensfähigkeit nach dem Verdau geprüft werden. Vermeiden Sie eine Kontamination des peripheren Blutes während der Dissektion.
2. Kollagenase und DNase I (Volumen berechnet in Schritt 1.2.2) werden zu dem verbleibenden RPMI (2 ml) gegeben, das auf 37 °C erwärmt wurde. Geben Sie 2 ml der vollständigen Enzymlösung in jede Vertiefung.
3. Die Platten für 45 min bei 37 °C und 100 U/min in einen inkubierten Shaker legen.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig beim Stapeln von Platten, da dies die ordnungsgemäße Wärmeübertragung behindern kann.
4. Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine Suspensionsdosierspitze vor, indem Sie mit einer Schere 3-4 mm vom Ende einer 1000-μl-Spitze abschneiden. Nach der Inkubation pipettieren Sie die Suspension in den Vertiefungen auf und ab, um sie mit der gehackten Spitze gründlich zu mischen. Stellen Sie das Zellsieb auf ein konisches 50-ml-Röhrchen und lassen Sie die aufgeschlossene Lösung durch das Zellsieb laufen.
   HINWEIS: Das 70-μm-Zellsieb reicht aus, um Zellen von implantiertem Biomaterial, wie z. B. Alginat, zu trennen. Wenn eine höhere Reinheit erforderlich ist, verwenden Sie Verfahren wie die Dichtegradiententrennung, um eine angereicherte Population von Leukozyten zu erhalten.
5. Spülen Sie die Vertiefungen mit 1x PBS-Lösung und übertragen Sie das Spülvolumen durch das Sieb, gefolgt von der Zugabe der Waschmittel des Siebs mit 1x PBS-Lösung, bis das Volumen im Röhrchen 50 ml erreicht.
   HINWEIS: Das 1x PBS muss Raumtemperatur haben, um eine Erhöhung der Viskosität des Aufschlusses zu verhindern und die Zellpelletierung während der Zentrifugation zu ermöglichen.
6. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation wird der Überstand vorsichtig mit einer serologischen Pipette abgesaugt, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in 1000 μl 1x PBS und überführen Sie die Suspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
7. Mischen Sie 10 μl der Zellsuspension mit 10 μl Trypanblau und laden Sie die Suspension auf Objektträger der Zählkammer, um Zellen mit einem automatischen Zellzähler zu zählen, oder auf ein Hämozytometer, um sie mit der herkömmlichen Methode unter einem Mikroskop zu zählen. Alternativ können Sie Durchflusszytometrie-Zellzählkügelchen verwenden.

4) Färbung für die Durchflusszytometrie

1. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für ein Plattenlayout für ein 14-Farben-Experiment mit 45 Proben, Fluoreszenz-min-eins (FMO)-Kontrollen, Kompensationskontrollen und einer vollständig gefärbten Milzprobenkontrolle. Nach der Schätzung der Gesamtzahl der Zellen ist das Volumen der Zellsuspension zu berechnen, das für die Färbung von 1 ×¹⁰ 6 Zellen für jede Probe und 0,5 × 10⁶ Zellen für jede Kompensations- und FMO-Kontrolle erforderlich ist. Geben Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit V-Boden und füllen Sie das Volumen mit 1x PBS auf 100 μl auf.
   ANMERKUNG: Wenn beispielsweise 1000 μl Zellsuspension, die in Schritt 3.6 erhalten werden, 40 × 10 6 Zellen enthalten, dann sind für 1 × 10⁶ Zellen 1000/40 × 10⁶ = 25 μl Zellsuspension erforderlich.
2. Die Platte wird bei 300 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und dann die Zellen in den Probenvertiefungen und in einer Kompensationskontrollvertiefung resuspendiert, um die Viabilität mit 100 μl einer 1:1000-Lösung des Viabilitätsfarbstoffs zu bestimmen (siehe Materialtabelle).
3. Resuspendieren Sie Zellen in den anderen Kompensationsvertiefungen sowie FMO- und ungefärbten Vertiefungen mit 100 μl 1x PBS.
4. Inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln für 30 min bei 4 °C.
5. Bereiten Sie in der Zwischenzeit einen Oberflächen-Antikörper-Cocktail für die Färbung der Probe und der FMO-Kontrollen vor: 50 μl pro Probe oder FMO. In Tabelle 1 finden Sie ein Beispiel für den Antikörper-Cocktail.
6. Nach der Inkubation 100 μl 1x PBS in jede Vertiefung geben, bei 300 × g 5 min bei 4 °C herunterschleudern.
7. Den Überstand absaugen und in 200 μl Färbepuffer (1x PBS + 1% BSA) resuspendieren; bei 300 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
8. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen in den Kompensations-, FMO- und ungefärbten Vertiefungen mit 50 μl 1x PBS. Geben Sie 50 μl des Antikörpercocktails in die jeweiligen Probenvertiefungen und FMO-Vertiefungen. Geben Sie die jeweiligen Antikörper in die verschiedenen Kompensationsvertiefungen.
9. Die Platte 45 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren. Nach der Inkubation werden 150 μl Färbepuffer in jede Vertiefung gegeben und die Zellsuspension bei 300 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
10. Der Überstand wird abgesaugt, die Zellen mit 200 μl Färbepuffer resuspendiert und die Zellsuspension bei 300 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
11. Wenn Sie Proben ohne Fixierung analysieren, resuspendieren Sie sie in 200 μl Färbepuffer und fahren Sie mit Abschnitt 6 über die Einrichtung des Zytometers und die Probenanalyse fort. Wenn Sie die Zellen fixieren, saugen Sie den Überstand nach dem Waschen an und fügen Sie 100 μl eines Fixiermittels, z. B. 4 % Paraformaldehyd, hinzu. Wenn Sie intrazelluläre Marker färben, fahren Sie mit Abschnitt 5 über intrazelluläre Färbung fort und fixieren und permeabilisieren Sie die Zellen (siehe Materialtabelle). Die Zellen werden 20 Minuten lang im Dunkeln bei 4 °C inkubiert.
    HINWEIS: Da die Fixierung die Fluoreszenzintensität einiger Fluorophore beeinflussen kann, sollten Sie jedes Panel sowohl mit als auch ohne Fixierung bewerten.
12. Nach der Inkubation werden 100 μl 1x PBS zugegeben, gefolgt von einer Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei 4 °C. Den Überstand absaugen, in 1x PBS resuspendieren und bei 300 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
13. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl Färbepuffer und lagern Sie sie bei 4 °C vor der durchflusszytometrischen Analyse.

5) Intrazelluläre Färbung

1. Fahren Sie mit Schritt 4.11 zur Fixierung und Permeabilisierung für intrazelluläre Marker fort und fügen Sie 100 μl des entsprechenden Puffers hinzu. Die Zellen werden bei 350 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und die Pellets werden in 200 μl der Fixiermittelpermeabilisierungsmittellösung resuspendiert. Die Zellen werden bei 350 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Pellets mit intrazellulären Antikörpern, die im entsprechenden Puffer verdünnt sind.
   HINWEIS: Antikörpertypen und Verdünnungen hängen von den Zielzellen ab. Ein gängiger intrazellulärer Marker ist beispielsweise die Gabelkopfbox P3 für regulatorische T-Zellen, die häufig in einer Verdünnung von 1:100 verwendet wird.
2. Die Zellsuspension wird im Dunkeln für 45 min bei 4 °C inkubiert. Nach der Inkubation werden 150 μl des entsprechenden Puffers zugegeben und die Suspension bei 350 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
3. Der Überstand wird abgesaugt und die Zellen werden in 200 μl Färbepuffer resuspendiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Die Zellen werden in 200 μl Färbepuff für die durchflusszytometrische Analyse abgesaugt und resuspendiert.

6) Zytometer und Kompensationsaufbau

1. Unmittelbar vor dem Ausführen der Proben sind die Kompensationsperlen vorzubereiten (siehe Materialtabelle), wenn die perlenbasierte Kompensation im Gegensatz zur zellbasierten Kompensation verwendet wird.
   1. Beschriften Sie separate Mikrozentrifugenröhrchen für jeden fluorochrom-konjugierten Antikörper und geben Sie 100 μl 1x PBS, gefolgt von einem vollen Tropfen Anti-Maus-Negativkontroll-Kompensationsperlen und einem Tropfen Positivkontroll-Kompensationskügelchen in jedes Röhrchen. Geben Sie 1 μl des entsprechenden Antikörpers in jedes einzelne Röhrchen. Vortex und 5 Minuten vor der Akquisition inkubieren.
      HINWEIS: Da einige Farbstoffe, wie z. B. BUV737, nicht an Kügelchen gebunden werden können, verwenden Sie eine zellbasierte Kontrolle.
2. Kalibrieren Sie das Durchflusszytometer vor jedem Experiment, indem Sie den Zytometeraufbau mit den Tracking-Perlen ausführen, und behalten Sie die Durchflusszytometereinstellungen für jedes Experiment bei.
3. Bevor Sie die Probe analysieren, stellen Sie das Durchflusszytometer ein, indem Sie eine ungefärbte Probe ausführen, um die Zellpopulation in einem Diagramm der Seitenstreuung (SSC) im Vergleich zur Vorwärtsstreuung (FSC) so anzupassen, dass die Zellpopulation in die Mitte des Diagramms fällt und nicht außerhalb der Skala liegt.
4. Lassen Sie die gefärbte Probe kurz laufen, um die Spannungen für FSC und SSC anzupassen und für jeden Kanal, um sicherzustellen, dass keine Ereignisse außerhalb der logarithmischen Skala jedes Kanals liegen. Erfassen Sie 5.000 Ereignisse für jede Kompensationskontrolle, gefolgt von einem Gating positiver und negativer Populationen. Berechnen Sie die Kompensationsmatrix, und führen Sie dann die Stichproben aus, wobei mindestens 1.000 Ereignisse für die interessierenden Grundgesamtheiten erfasst werden.
   HINWEIS: Die Kompensation bei Panels mit größeren Farben sollte überprüft werden, da die automatische Kompensation zu Über- oder Unterkompensation führen kann. Jeder Parameter sollte mit jedem anderen Parameter verglichen werden, um Anzeichen einer Über- oder Unterkompensation zu überwachen, und jedes einfarbige Steuerelement sollte ausgewertet werden. Die komplexe Kompensation von Experimenten mit größeren Farben sollte mit Hilfe eines Mitarbeiters oder einer Core Facility mit umfassender Erfahrung in der Durchflusszytometrie durchgeführt werden. Neuere Arten von Durchflusszytometern, wie z. B. Spektralzytometer, nutzen das gesamte Spektrum eines Fluorophors durch einen Prozess, der als spektrale Entmischung bekannt ist, was zu einer saubereren Unterscheidung der Fluoreszenzüberlappung im Vergleich zur Standardkompensation allein führen kann²².

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Ergebnisse

Der Prozess der Entwicklung von Durchflusszytometrie-Panels für die Immunanalyse beruht häufig auf dem Vergleich der Ergebnisse mit vorhandenen Daten und der Literatur auf diesem Gebiet. Das Wissen darüber, wie sich Populationen in der Durchflusszytometrie präsentieren können, ist entscheidend für die richtige Interpretation von Daten. Unabhängig davon können Populationen und Zelltypen in verschiedenen Geweben unterschiedlich aussehen, so dass eine gewisse Variabilität zu erwarte...

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Diskussion

Diese Übersichtsarbeit beschreibt eine detaillierte Methodik zur Isolierung von Zellen aus Biomaterialimplantaten, um eine einheitliche Zellsuspension zu erhalten. Darüber hinaus wurde ein detailliertes Protokoll für die Färbung der Zellsuspension für die Mehrfarben-Durchflusszytometrie sowie die Schritte zur Konfiguration eines Durchflusszytometers für optimale Ergebnisse bereitgestellt. Zellisolierungsmethoden können mehrere Schritte umfassen, wobei häufig eine manuelle Gewebedissektion gefolgt von einem enzyma...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-432-22
6 Well Plate	Fisher Scientific	07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer Plus	BD Biosciences	566385
BD Cytofix	BD Biosciences	554655	For only fixing cells
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A7906	For preparing FACS staining buffer
CD11b AF700	Biolegend	101222	Clone: M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5	Biolegend	117325	Clone: N418
CD197 PE/Dazzle594	Biolegend	120121	Clone: 4B12
CD200R3 APC	Biolegend	142207	Clone: Ba13
CD206 PE	Biolegend	141705	Clone: C068C2
CD45 BUV737	BD Biosciences	612778	Clone: 104/A20
CD86 BUV395	BD Biosciences	564199	Clone: GL1
CD8a BV421	Biolegend	100737	Clone: 53-6.7
Comp Bead anti-mouse	BD Biosciences	552843	For compensation control
DNase I	Millipore Sigma	11284932001	Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I)
F4/80 PE/Cy7	Biolegend	123113	Clone: BM8
Fc Block	Biolegend	101301	Clone: 93
Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD Biosciences	554714	For fixing and permeabilization of cells.
HEPES buffer	Thermo Fisher	15630080	Buffer to supplement cell media
Liberase	Millipore Sigma	5401127001	Blend of purified Collagenase I and Collagenase II
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L23105	Viability dye
Ly6c AF488	Biolegend	128015	Clone: HK1.4
Ly6g BV510	Biolegend	127633	Clone: 1A8
MHCII BV786	BD Biosciences	742894	Clone: M5/114.15.2
Phosphate buffer saline	Thermo Fisher	D8537
RPMI	Thermo Fisher	11875176	Cell culture media
Siglec F BV605	BD Biosciences	740388	Clone: E50-2440
V-bottom 96-well plate