Citometria a flusso ad alta dimensionalità per l'analisi della funzione immunitaria di tessuti implantari sezionati

Riepilogo

L'isolamento di cellule da impianti sezionati e la loro caratterizzazione mediante citometria a flusso possono contribuire in modo significativo alla comprensione del modello di risposta immunitaria contro gli impianti. Questo articolo descrive un metodo preciso per l'isolamento di cellule da impianti sezionati e la loro colorazione per l'analisi citofluorimetrica.

Abstract

Il successo dell'impianto di un tessuto coltivato in laboratorio o di un dispositivo medico in un individuo è soggetto alla risposta immunitaria dell'ospite ricevente. Considerando un impianto come un corpo estraneo, una risposta immunitaria ostile e disregolata può portare al rigetto dell'impianto, mentre una risposta regolata e il recupero dell'omeostasi possono portare alla sua accettazione. L'analisi dei microambienti degli impianti sezionati in ambienti in vivo o ex vivo può aiutare a comprendere il modello di risposta immunitaria, che può in ultima analisi aiutare nello sviluppo di nuove generazioni di biomateriali. La citometria a flusso è una tecnica ben nota per caratterizzare le cellule immunitarie e i loro sottogruppi in base ai loro marcatori di superficie cellulare. Questa revisione descrive un protocollo basato sul taglio manuale a cubetti, la digestione enzimatica e la filtrazione attraverso un filtro cellulare per l'isolamento di sospensioni cellulari uniformi dal tessuto implantare sezionato. Inoltre, è stato spiegato un protocollo di colorazione della citometria a flusso multicolore, insieme ai passaggi per le impostazioni iniziali del citometro per caratterizzare e quantificare queste cellule isolate mediante citometria a flusso.

Introduzione

I progressi nel campo della medicina hanno portato all'uso frequente di materiali impiantati per sostenere la funzione o la ricrescita del tessuto danneggiato ^1,2. Questi includono dispositivi come pacemaker, impianti cosmetici ricostruttivi e placche ortopediche utilizzate per la fissazione delle fratture ossee ^3,4. Tuttavia, i materiali utilizzati per realizzare questi impianti e le posizioni in cui vengono impiantati giocano un ruolo importante nel determinare il successo di questi impianti ^5,6,7. Come corpi estranei, questi impianti possono generare una risposta immunitaria da parte dell'ospite che può portare al rigetto o alla tolleranza⁸. Questo fattore ha spinto la ricerca sui biomateriali a generare materiali in grado di attrarre la risposta immunitaria desiderata dopo l'impianto 9,10,11,12.

La risposta immunitaria è un requisito essenziale nel campo della medicina rigenerativa, dove un tessuto o un organo viene coltivato attorno a uno scheletro biomateriale (scaffold) in laboratorio per la sostituzione di un tessuto o di un organo danneggiato^13,14,15,16. Nella medicina rigenerativa, l'obiettivo è quello di sostituire il tessuto mancante o danneggiato attraverso l'uso di cellule, segnali e scaffold, ognuno dei quali può essere notevolmente modulato dalle risposte immunitarie¹⁷. Inoltre, anche quando si desidera una mancanza di risposta immunitaria, molto raramente si tratta di un'assenza di attività immunitaria piuttosto che della presenza di un profilo regolatorio che è auspicabile¹⁸. Tecniche come la citometria a flusso possono svolgere un ruolo significativo nella caratterizzazione del modello di risposta immunitaria a vari biomateriali utilizzati per il rivestimento di dispositivi implantari o per lo sviluppo di scaffold per l'ingegneria tissutale¹⁹.

Queste informazioni, a loro volta, aiuteranno in ultima analisi nello sviluppo di biomateriali per impianti che possono essere ben tollerati dal sistema immunitario o nello sviluppo di scaffold che possono svolgere un ruolo costruttivo nell'ingegneria tissutale. La corretta preparazione dei campioni per l'analisi mediante citometria a flusso è un passo importante per evitare risultati imprecisi nella caratterizzazione immunitaria tramite lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza^20,21. Pertanto, questa revisione presenta una metodologia dettagliata che può essere utilizzata per l'isolamento di cellule dal tessuto dell'impalcatura, la colorazione della sospensione cellulare e l'analisi mediante citometria a flusso.

Protocollo

NOTA: La Figura 1 fornisce una panoramica del protocollo di citometria a flusso.

1) Preparazione dei reagenti

1. Preparare i terreni per la diluizione degli enzimi e per la coltura dei tessuti.
   1. Aggiungere 5 mL di soluzione tampone di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES) in 500 mL di terreno RPMI e agitare bene. Conservare il terreno a 4 °C fino al successivo utilizzo.
2. Calcolare il volume della soluzione enzimatica.
   NOTA: Il volume della soluzione enzimatica è il volume del terreno contenente gli enzimi (collagenasi e DNasi I) che saranno necessari per digerire il tessuto tagliato a cubetti in piastre a 6 pozzetti; Dipende dal numero di campioni.
   1. Utilizzare la seguente equazione per calcolare il volume richiesto:
      (Numero di campioni da digerire) × 5 mL di RPMI senza siero con tampone HEPES da 10 mM
      NOTA: Ad esempio, per 0,1-0,3 g di milza sezionata, utilizzare 5 mL di terreno per preparare la soluzione enzimatica. Il protocollo di digestione enzimatica descritto in questo manoscritto riguarda principalmente i tessuti molli (che vanno da 0,1 a 1 g) sezionati dai topi che includono il cervello, i reni, la pelle, il fegato, i polmoni, la milza, i muscoli, nonché le capsule intorno a impianti sottocutanei fatti di materiali sintetici o proteine della matrice extracellulare. La digestione dei tessuti cartilaginei duri potrebbe richiedere diverse condizioni e volumi di enzimi digestivi, che possono essere accertati solo mediante ottimizzazione.
   2. Calcola la quantità di collagenasi e DNasi di cui ho bisogno per la soluzione enzimatica.
      NOTA: In questo protocollo sono stati utilizzati 0,25 mg/mL di collagenasi e 0,2 mg/mL di DNasi I. Le concentrazioni di lavoro richieste per la collagenasi e la DNasi possono variare per diversi tipi di tessuti¹⁹.
3. Preparare una soluzione di colorante di vitalità 1:1000 aggiungendo 1 μL del colorante di vitalità (vedere Tabella dei materiali) a 999 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e vorticare la soluzione. Conservare la soluzione al buio a 4 °C fino al successivo utilizzo.
4. Preparare il tampone colorante aggiungendo 1 g di albumina sierica bovina (BSA) a 100 mL di PBS e agitare la soluzione fino a completa dissoluzione della BSA. Conservare la soluzione a 4 °C fino al nuovo utilizzo.

2) Impostazione delle piastre di digestione enzimatica

1. Preparare una piastra a 6 pozzetti con filtri per celle da 70 μm in ciascun pozzetto. Aggiungere 3 mL del terreno preparato dal punto 1.1.1 in ciascun pozzetto e incubare su ghiaccio.
2. Conservare il terreno rimanente (2 mL/pozzetto) in un incubatore o a bagnomaria a 37 °C per sospendere la quantità calcolata di collagenasi e DNasi I (passaggio 1.2.2).

3) Isolamento delle cellule

1. Posizionare gli impianti/tessuti sezionati in piastre e tagliare finemente con le forbici. In alternativa, utilizzare un metodo di interruzione meccanica utilizzando un dissociatore tissutale o un omogeneizzatore portatile. A causa dell'elevato numero di leucociti, sezionare la milza da utilizzare come controllo della colorazione in ogni corsa.
   NOTA: Poiché alcuni materiali inducono livelli più elevati di fibrosi, questo protocollo è applicabile sia per i materiali altamente fibrotici che per quelli minimamente fibrotici. Tuttavia, ogni metodo di lavorazione deve essere valutato sia per la resa cellulare che per la vitalità dopo la digestione prima della colorazione. Evitare la contaminazione del sangue periferico durante la dissezione.
2. Aggiungere collagenasi e DNasi I (volume calcolato al punto 1.2.2) all'RPMI rimanente (2 mL) che è stato riscaldato a 37 °C. Aggiungere 2 mL della soluzione enzimatica completa in ciascun pozzetto.
3. Porre le piastre in un agitatore incubato per 45 minuti a 37 °C e 100 giri/min.
   NOTA: Prestare attenzione quando si impilano le piastre in quanto ciò può inibire il corretto trasferimento di calore.
4. Nel frattempo, preparare un puntale per l'erogazione della sospensione tagliando a 3-4 mm dall'estremità di un puntale da 1000 μL con le forbici. Dopo l'incubazione, pipettare la sospensione nei pozzetti su e giù per mescolarla accuratamente utilizzando la punta tritata. Posizionare il colino cellulare sulla parte superiore di una provetta conica da 50 mL e far passare la soluzione digerita attraverso il colino cellulare.
   NOTA: Il filtro cellulare da 70 μm è sufficiente per separare le cellule dal biomateriale impiantato, come l'alginato. Se è richiesta una maggiore purezza, utilizzare processi come la separazione del gradiente di densità per ottenere una popolazione arricchita di leucociti.
5. Sciacquare i pozzetti con 1x soluzione PBS e trasferire il volume di risciacquo attraverso il filtro, quindi aggiungere i lavaggi del filtro con 1x soluzione PBS fino a quando il volume nel tubo raggiunge i 50 ml.
   NOTA: Il PBS 1x deve essere a temperatura ambiente per evitare qualsiasi aumento della viscosità del digestato e per consentire la pellettizzazione cellulare durante la centrifugazione.
6. Centrifugare la provetta a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, aspirare con cautela il surnatante utilizzando una pipetta sierologica senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 1000 μL di 1x PBS e trasferire la sospensione in una provetta per microcentrifuga.
7. Miscelare 10 μL di sospensione cellulare con 10 μL di blu di tripano e caricare la sospensione su vetrini della camera di conteggio per il conteggio delle cellule utilizzando un contatore automatico di cellule o su un emocitometro per contare con il metodo convenzionale al microscopio. In alternativa, utilizzare le microsfere per il conteggio delle cellule con citometria a flusso.

4) Colorazione per citometria a flusso

1. Vedere la Figura 2 per un esempio di layout della piastra per un esperimento a 14 colori con 45 campioni, controlli di fluorescenza meno uno (FMO), controlli di compensazione e un controllo del campione di milza completamente colorato. Dopo aver stimato il numero totale di cellule, calcolare il volume della sospensione cellulare necessaria per la colorazione 1 × 10 6 cellule per ciascun campione e 0,5 × 10⁶ cellule per ogni compensazione e controllo FMO. Erogare il volume richiesto della sospensione cellulare nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con fondo a V e portare il volume a 100 μL con 1x PBS.
   NOTA: Ad esempio, se 1000 μL di sospensione cellulare ottenuti al punto 3.6 contengono 40 × 10 6 cellule, per 1 × 10 6 cellule, saranno necessari 1000/40 × 10⁶ = 25 μL di sospensione cellulare.
2. Centrifugare la piastra a 300 × g per 5 minuti a 4 °C, aspirare il surnatante e quindi risospendere le cellule nei pozzetti del campione e in un pozzetto di controllo di compensazione per determinare la vitalità, con 100 μL di una soluzione 1:1000 del colorante di vitalità (vedere Tabella dei materiali).
3. Per le cellule negli altri pozzetti di compensazione, nonché per i pozzetti FMO e non colorati, risospenderli con 100 μL di PBS 1x.
4. Incubare le cellule al buio per 30 minuti a 4 °C.
5. Nel frattempo, preparare un cocktail di anticorpi di superficie per la colorazione del campione e i controlli FMO: 50 μL per campione o FMO. Vedere la Tabella 1 per un esempio del cocktail di anticorpi.
6. Dopo l'incubazione, aggiungere 100 μl di PBS 1x a ciascun pozzetto, centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
7. Aspirare il surnatante e risospendere in 200 μL di tampone colorante (1x PBS + 1% BSA); centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
8. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule nei pozzetti di compensazione, FMO e non colorati con 50 μL di PBS 1x. Aggiungere 50 μL del cocktail di anticorpi ai rispettivi pozzetti del campione e ai pozzetti FMO. Aggiungere i rispettivi anticorpi ai diversi pozzetti di compensazione.
9. Incubare la piastra per 45 minuti al buio a 4 °C. Dopo l'incubazione, aggiungere 150 μL di tampone colorante in ciascun pozzetto e centrifugare la sospensione cellulare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
10. Aspirare il surnatante, risospendere le cellule con 200 μL di tampone colorante e centrifugare la sospensione cellulare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
11. Se si analizzano campioni senza fissazione, risospenderli in 200 μL di tampone colorante e procedere alla sezione 6 sull'impostazione del citometro e l'analisi del campione. Se si fissano le cellule, aspirare il surnatante dopo il lavaggio e aggiungere 100 μL di un fissativo come la paraformaldeide al 4%. In caso di colorazione per marcatori intracellulari, passare al paragrafo 5 sulla colorazione intracellulare e fissare e permeabilizzare le cellule (vedere Tabella dei materiali). Incubare le cellule per 20 minuti al buio a 4 °C.
    NOTA: Poiché la fissazione può influenzare l'intensità della fluorescenza di alcuni fluorofori, valutare ciascun pannello sia con che senza fissazione.
12. Dopo l'incubazione, aggiungere 100 μL di 1x PBS, seguito da centrifugazione a 300 × g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante, risospendere in 1x PBS e centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
13. Risospendere le cellule in 200 μL di tampone colorante e conservarle a 4 °C prima dell'analisi citofluorimetrica.

5) Colorazione intracellulare

1. Continuando dal passaggio 4.11 per la fissazione e la permeabilizzazione per i marcatori intracellulari, aggiungere 100 μL del tampone appropriato. Centrifugare le cellule a 350 × g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante e risospendere i pellet in 200 μL della soluzione fissativo-permeabilizzante; centrifugare le cellule a 350 × g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante e risospendere i pellet con anticorpi intracellulari diluiti nell'apposito tampone.
   NOTA: I tipi di anticorpi e le diluizioni dipenderanno dalle cellule bersaglio. Ad esempio, un marcatore intracellulare comune è forkhead box P3 per le cellule T regolatorie, che viene spesso utilizzato a una diluizione 1:100.
2. Incubare la sospensione cellulare al buio per 45 minuti a 4 °C. Dopo l'incubazione, aggiungere 150 μL del tampone appropriato e centrifugare la sospensione a 350 × g per 5 minuti a 4 °C.
3. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 200 μL di tampone colorante, quindi centrifugazione a 300 × g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare e risospendere le cellule in 200 μL di tampone di colorazione per l'analisi citofluorimetrica.

6) Impostazione del citometro e della compensazione

1. Immediatamente prima di eseguire i campioni, preparare le perle di compensazione (vedere la Tabella dei materiali) se si utilizza la compensazione basata su microsfere anziché la compensazione basata su celle.
   1. Etichettare provette di microcentrifuga separate per ciascun anticorpo coniugato con fluorocromo e aggiungere 100 μL di PBS 1x seguito da una goccia completa di perline di compensazione del controllo negativo anti-topo e una goccia di perline di compensazione del controllo positivo a ciascuna provetta. Aggiungere 1 μL dell'anticorpo appropriato in ogni provetta separata. Vorticare e incubare per 5 minuti prima dell'acquisizione.
      NOTA: Poiché alcuni coloranti, come BUV737, non possono essere legati alle perle, utilizzare un controllo basato su cellule.
2. Calibrare il citometro a flusso prima di ogni esperimento eseguendo la configurazione del citometro con le perle di tracciamento e mantenere le impostazioni del citometro a flusso per ogni esperimento.
3. Prima di analizzare il campione, regolare il citometro a flusso eseguendo un campione non colorato per regolare la popolazione cellulare su un grafico a dispersione laterale (SSC) rispetto a un grafico a dispersione diretta (FSC) in modo che la popolazione cellulare cada al centro del grafico e non sia fuori scala.
4. Eseguire brevemente il campione colorato per regolare le tensioni per FSC e SSC e per ciascun canale per assicurarsi che nessun evento cada al di fuori della scala logaritmica di ciascun canale. Registra 5.000 eventi per ogni controllo di compensazione, seguito dal gating delle popolazioni positive e negative. Calcolare la matrice di compensazione e quindi eseguire i campioni, raccogliendo almeno 1.000 eventi per le popolazioni di interesse.
   NOTA: La compensazione su pannelli di colore più grande deve essere verificata, poiché la compensazione automatica può essere soggetta a sovra o sottocompensazione. Ogni parametro deve essere confrontato graficamente con ogni altro parametro per monitorare i segni di sovracompensazione o sottocompensazione e ogni controllo monocolore deve essere valutato. La compensazione complessa di esperimenti di colore più grande deve essere eseguita con l'assistenza di un collaboratore o di una struttura di base con una vasta esperienza di citometria a flusso. I tipi più recenti di citometri a flusso, come i citometri spettrali, utilizzano l'intero spettro di un fluoroforo attraverso un processo noto come unmixing spettrale, che può produrre una distinzione più netta della sovrapposizione fluorescente rispetto alla sola compensazione standard²².

Risultati

Il processo di sviluppo dei pannelli di citometria a flusso per l'analisi immunitaria si basa spesso sul confronto dei risultati con i dati esistenti e la letteratura in materia. La conoscenza di come le popolazioni possono presentarsi nella citometria a flusso è fondamentale per una corretta interpretazione dei dati. Indipendentemente da ciò, le popolazioni e i tipi di cellule possono apparire in modo diverso nei diversi tessuti, quindi è prevedibile una certa variabilità. Nel contes...

Discussione

Questa revisione descrive una metodologia dettagliata per isolare le cellule da impianti di biomateriali per ottenere una sospensione cellulare uniforme. Inoltre, è stato fornito un protocollo dettagliato per la colorazione della sospensione cellulare per la citometria a flusso multicolore, insieme ai passaggi per la configurazione di un citometro a flusso per ottenere risultati ottimali. I metodi di isolamento cellulare possono comportare più fasi, spesso utilizzando la dissezione manuale dei tessuti seguita dalla dig...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-432-22
6 Well Plate	Fisher Scientific	07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer Plus	BD Biosciences	566385
BD Cytofix	BD Biosciences	554655	For only fixing cells
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A7906	For preparing FACS staining buffer
CD11b AF700	Biolegend	101222	Clone: M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5	Biolegend	117325	Clone: N418
CD197 PE/Dazzle594	Biolegend	120121	Clone: 4B12
CD200R3 APC	Biolegend	142207	Clone: Ba13
CD206 PE	Biolegend	141705	Clone: C068C2
CD45 BUV737	BD Biosciences	612778	Clone: 104/A20
CD86 BUV395	BD Biosciences	564199	Clone: GL1
CD8a BV421	Biolegend	100737	Clone: 53-6.7
Comp Bead anti-mouse	BD Biosciences	552843	For compensation control
DNase I	Millipore Sigma	11284932001	Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I)
F4/80 PE/Cy7	Biolegend	123113	Clone: BM8
Fc Block	Biolegend	101301	Clone: 93
Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD Biosciences	554714	For fixing and permeabilization of cells.
HEPES buffer	Thermo Fisher	15630080	Buffer to supplement cell media
Liberase	Millipore Sigma	5401127001	Blend of purified Collagenase I and Collagenase II
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L23105	Viability dye
Ly6c AF488	Biolegend	128015	Clone: HK1.4
Ly6g BV510	Biolegend	127633	Clone: 1A8
MHCII BV786	BD Biosciences	742894	Clone: M5/114.15.2
Phosphate buffer saline	Thermo Fisher	D8537
RPMI	Thermo Fisher	11875176	Cell culture media
Siglec F BV605	BD Biosciences	740388	Clone: E50-2440
V-bottom 96-well plate