末梢神経または脊髄損傷を伴うげっ歯類の機能回復を評価する自動歩行分析

要約

自動歩行分析は、末梢神経損傷および脊髄失調損傷のげっ歯類モデルにおける機能回復を評価するための実現可能なツールである。様々な実験モデルで運動機能を評価するために1つのセットアップしか必要としませんが、動物の細心の硬とソフトウェアの調整と訓練は非常に重要です。

要約

末梢神経および中枢神経損傷は、これらの動物モデルが費用対効果が高く、多くの比較データが文献に掲載されていることを考えると、主にげっ歯類、特にラットで研究されている。これには、神経損傷および修復後の機能回復を研究するための多数の評価方法が含まれる。組織学、電気生理学、生体内の他のインビボ評価技術およびインビトロ評価技術による神経再生の評価に加えて、機能回復は神経再生の程度を決定するための最も重要な基準である。自動歩行解析により、足のプリントエリアや足のスイングスピードなどの膨大な量の歩行関連パラメータと、四肢間の調整の測定を記録できます。さらに、この方法は、神経損傷後および神経再生中にラットの足のデジタルデータを提供し、末梢および中枢神経損傷が運動行動にどのような影響を与えるかを理解する。主に使用される坐骨神経損傷モデルに加えて、大腿神経のような末梢神経損傷の他のモデルは、この方法によって研究することができる。末梢神経系の損傷に加えて、中枢神経系の病変、例えば、脊髄挫傷を評価することができる。有効かつ再現性のあるデータ評価は、データ取得前のハードおよびソフトウェア設定の細かい調整に大きく依存します。さらに、実験動物の適切な訓練は非常に重要です。この研究は、コンピュータ化された自動歩行分析を用いて、末梢神経損傷の異なる動物モデルおよび脊髄失禁損傷の機能回復を評価することを目的としている。また、この方法の限界、例えば、機能回復が限られていることによる坐骨神経神経障害を有するラットにおける神経再生の評価も強調する。したがって、このプロトコルは、げっ歯類モデルの機能的回復を評価するために末梢および中枢神経損傷に興味を持つ研究者を助けると考えられている。

概要

末梢および中枢神経系の傷害はげっ歯類でしばしば研究され、神経損傷、修復、または神経保護の経過に関する多量の比較データをもたらし、さらに二次的傷害および再生^1、2、3に対抗する。げっ歯類モデルにおける実験的治療戦略の結果は、X線マイクロトモグラフィー(μCT)スキャンなどの組織学、免疫組織化学、電気生理学、イメージング技術などの様々な技術によって評価することができるが、治療の成功を決定する最も重要な基準は、ヒト患者と同様に、機能的回復の程度^4、5である。げっ歯類のlocomotorの性能を調査する最初の研究は、1940年代^6、7、8にさかのぼ^ります。ラットとマウスは、次の数十年^9、10、11で彼らの運動行動を調査する多量の研究^を受^けた。今日では、インクと紙12、13、足首と歩行運動学^15、16、17の歩行トラック分析から機械学習の強化された方法に至るまで、末梢神経および中央神経損傷のげっ歯類モデルの評価技術の広い範囲が存在し、歩行、四肢、関節軌道の複雑な推定を可能にする機械学習の強化された方法まで^18、19。

コンピュータ化された自動歩行分析(AGA)は、周辺および中枢神経損傷およびそのような傷害の潜在的な実験的治療に続く運動機能を評価するために使用される。装置は主にガラスの歩道およびそれらによって超過された圧力と相関してげっ歯類の足の版を照らす光源から成っている。このデータは、静的および動的パラメータの広範な配列を計算するためにコンピュータ化されます。Deumensによれば、これらのパラメータは、一般的なパラメータのカテゴリにさらに細分化することができ、疼痛関連パラメータならびに歩行²⁰の配位関連パラメータ(表1))。歩行挙動の変化を検出するAGAの実現可能性は、周縁神経損傷(PNI)21の様々な動物モデルにおいて証明されているが、例えば坐骨神経^20、大腿神経^22、および中央神経^23、24。また、中枢神経損傷を有するラットの運動機能を評価するために日常的に使用される、例えば、脳卒中²⁵または脊髄失調^26。このメソッドの進歩は、膨大な量の比較可能なデータと、gait²⁷に関連する多数のパラメータを記録する可能性にあります。本論文はPNIおよび脊髄損傷(SCI)の動物モデルに関心を持つ研究者に、そのようなモデルにおける運動機能を評価するための詳細かつ実践的なガイドラインを提供することを目的としている。

カテゴリ	パラメーター	説明
歩行の一般的なパラメータ	印刷範囲 (距離単位)	足のプリントの領域
	印刷長さ(距離単位)	足のプリントの長さ
	支える基地 (BoS) (距離単位)	2 つの後ろ足または前足の間の距離
	ストライド長さ(距離単位)	足の2つの連続した配置間の距離
足の痛み関連パラメータ	スイングタイム(複数可)	スイングフェーズの持続時間
	スタンドタイム(複数可)	スタンスフェーズの期間
	平均足の印刷強度(任意単位)	スタンスフェーズ中の足の印刷物の平均iIntensity
歩行の調整関連パラメータ	通常のステップ シーケンス パターン(NSSP)	ステップサイクル中の足の配置の特定のシーケンス
	位相分散 (%)	2つの特定の足のステップサイクル間の時間的な違い
	規則性指数 (RI) (%)	完璧なNSSP時間4を1ステップサイクル中の足の配置の総数で割って、四肢間の協調を定量化

表1:自動歩行解析で評価可能な歩行のパラメータ。 パラメータが分類されるカテゴリは、Deumensら²⁰に従って選択されます。

プロトコル

すべての実験のための実験議定書は、ウィーン市政府の動物議定書審査委員会によって事前に承認されました。すべての手順は、動物の権利に関するヘルシンキ宣言と国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドに完全に従って行われました。

1. 動物住宅

1. ハウス雄ラット(ルイスまたはスプレイグ・ドーリー)は、食料と水へのアドリビタムアクセスで12時間の明暗サイクルの下で250〜300 gの重量を量る。
2. 室温(20~22 °Cに維持)と湿度(45%~65%)の両方を制御する十分な動物のハウジングのために。この研究のために、オスのルイス(PNI)およびスプレイグ・ドーリー(SCI)ラットが使用された。
3. 週に2回、新しい、クリーニングされたケージを提供します。2つまたは3つのグループでラットを収容し、密接に彼らの社会的行動や相互作用を監視します。ラットは、外科的処置または機能検査の前に少なくとも1週間の順応期間を許可する。
   注:ラットは手術前に歩行分析装置で少なくとも5日間の毎日の訓練を必要とするので、施設でのラットの到着と実験手術²⁸の予定データの間に少なくとも2週間を計算する。

2. 神経損傷の誘導

注意:外科用ガウン、手袋、マスクなどの個人用保護具を着用してください。無菌の外科用ガウンが利用できない場合には、清潔で洗濯されたラボコートも十分です。それが汚染されない限り、ガウンやコートは動物間で、手術セッションの間に変更する必要はありません。滅菌外科用手袋の使用をお勧めします。そのような手袋が利用できない場合、検査用手袋も使用できますが、手術用消毒剤を使用して手術前に洗浄する必要があります。手袋は動物間で交換する必要があります。

1. 手術当日、麻酔を妨げる可能性があるため、動物へのストレスを最小限に抑えるようにしてください。
2. 手術当日、手術前および手術前の鎮痛を提供するために、手術前に25 Gカヌラ1時間を使用して100-200 μL 0.9%NaClを皮下に使用して、サスペンションに0.05mgのブプレノルフィン/kg体重を注入します。そうでない場合、ラットの脇腹は注射の好ましい部位である。
3. ラットを麻酔誘導室に入れて、セボフルラン気化器と活性チョーク容器に接続して_CO2を吸収する。麻酔ボックスに4%~5%のセボフルラン-酸素混合物を約5分間浸水させ、酸素流量1.5L/min(開始期)で麻酔を行い、ラットを麻酔します。パルスオキシメトリークリップを足の1つに接続して、げっ歯類の血中酸素飽和度を監視します。2.5%~4.5%のセボフルラン-酸素混合物で全身麻酔の状態を維持します。
   メモ:実験手術の場合、全身麻酔は義務付けられています。尾や足のピンチ刺激に対する応答の欠如を確認することによって全身麻酔を確認します。
4. ラットが全身麻酔に入ったら、操作されるそれぞれのアリアルを剃り、アルコールと皮膚消毒剤で交互にスワイプして領域を消毒する。最後のスワイプは、皮膚消毒剤で行う必要があります。
5. 必要な位置に調節可能な加熱パッドの上に置きます(大腿神経モデルの場合は、坐骨神経およびSCIモデルの場合に起こりやすい)。ラットの直腸に柔軟な温度計プローブを挿入して、動物の温度を監視し、手術中に約37°Cで維持します。麻酔中、眼軟膏を用いてラットの目を乾燥から守る

3. 神経損傷の外科的誘導

1. 外科的処置を行う場合は、次のようにハルステッド²⁹ の7原則に厳密に従ってください。
   1. 彼らと一緒に作業するときは、常に穏やかに組織を処理します。組織を引き裂いたり破ったりすることは避けてください。
      注意:自作³⁰ または市販のリトラクタシステムは、筋肉や血管を操作場から締め出すために役立ちます。
   2. 慎重に止止めを保証するために容器や合字を焼灼するために電気止結体を使用して止止めを慎重に維持します。
   3. 常に慎重にそれらを解剖し、繊細にそれらを処理することによって、組織への血液供給を維持します。
   4. マスク、ガウン、無菌手袋を着用して厳格な敗血症を維持します。
   5. ティッシュの緊張を避けるには、きつすぎず緩みすぎない縫合糸を適用します。
   6. 重なり合うことなくそれぞれのエッジを一緒に持って来ることによって、細心の注意を払って組織をアポシング。
      注:これは、上皮性または過敏性神経刺激症の場合に特に重要です。手術顕微鏡を使用して、6x-16倍の拡大の下ですべての微小手術手順を実行します。理想的には、顕微鏡は助手による操作の観察を可能にするために2つの対の眼を提供する。
   7. 異なる組織層を慎重に縫合することにより、死んだ空間の作成を避けてください。
2. 右後肢神経神経症の誘導
   1. #3のメスハンドルに接続された#10メスの刃で後肢の後部に5cmの長い切開を行い、上にある筋肉と軟部組織を解剖することによって、中腿レベルで右坐骨神経を露出させる。解剖された筋肉と皮膚を座り込まないように、傷口の中にレトラクターを置きます。湾曲したマイクロサージカルハサミを使用して周囲の組織を取り除くことによって、神経を穏やかに露出させる。
   2. 坐骨神経の長さ8 mm の神経セグメントを取り除き、その支軸に近い 1 ~ 2 mm の間にまっすぐなマイクロ外科用はさみで。
   3. 神経セグメントを180°回転させ、経外科神経の近位および遠位の切り株の間に置き、2つの中断された10-0縫合糸とマイクロ外科針ホルダーを備えた各部位で上聴神経神経刺激を行います。
3. 右後肢における大腿神経障害の誘導
   1. 右の大腿神経血管束を露出させるために、#3メスハンドルに接続された#10のメスブレードで縦方向の3〜4cmの鼠径部切開を行います。大腿神経の分岐が露出するまで、鈍い解剖のために外科用はさみを使用する。解剖された筋肉と皮膚を座り込まないように、傷口の中にレトラクターを置きます。
   2. 露出した運動および感覚分岐を分岐に遠位し、各枝の6mm長い神経セグメントをそれぞれ切除し、まっすぐな微小手術ハサミを使用する。
   3. 両神経セグメントを180°回転させ、経部大腿神経枝の近位および遠位の切り株の間に置き、2つの中断された11-0縫合糸とマイクロ外科針ホルダーを備えた各部位で上聴神経神経学を行います。
      注:元の運動枝に運動移植片を移植し、感覚移植片を元の感覚枝に移植することによって、同様体の自己神経移植を行います。あるいは、運動移植片を元の感覚枝に移植し、その逆にして異所性自立神経移植片を行う。
4. 胸部脊髄損傷の誘発
   1. #3メスハンドルに接続された#10メスの刃で胸部脊柱全体の皮膚切開を行い、その後、2つの筋肉切開を棘プロセスと並行して行い、筋肉の引き込みを容易にする。解剖された筋肉と皮膚を座り込まないように、傷口の中にレトラクターを置きます。
   2. 11番目の胸椎(Th)を特定し、上にある組織と、ロンゲルを使用してスピナスプロセスを除去することによって、椎骨アーチの層を露出させます。
   3. マイクロドリルと適切なバリを使用してラミネクトミーを行い、インサータの先端よりわずかに大きい薄層に小さな穴を開けます。脊髄の損傷を防ぐために、ロンガを使用して穴を開けて大きくしながら、薄層のみを薄くします。骨膜がまだ無傷の場合は、硬膜を損傷することなく、鋭利な尖ったプローブを使用して慎重に取り外します。
   4. ラミナを不安定にすることなく十分な大きさの穴が作られるようにした後、動物の脊柱をロストレクラリーにクランプし、インコプタの安定化鉗子でTh11に詰め込みます。フロントとサイドのハンドホイールを使用して、鋼ロッドをラミニング孔の上に3〜5mm配置します。最後に、すべての動物に150キロダインの定義された力で衝撃を与え、軽度から中程度の脊髄失禁傷害^を誘発する。
   5. ポリグラクチン4-0または5-0中断縫合糸と手術用針ホルダーを使用して、解剖学的層で創傷閉鎖を行います。滅菌0.9%NaClに浸したガーゼパッドで軽く拭いて傷を十分にきれいにします。
   6. 手術後、動物を自宅のケージに戻し、光と音の露出から保護します。術後日(DPO)7まで動物の行動を注意深く監視し、十分な食料と水の摂取を保証する。必要に応じて、皮下注射(例えば、10 ml NaCl 0.9%)によって追加の液体を提供する。
   7. 術後鎮痛を最低2日間提供し、例えば、オピオイド(0.05mg/kg体重ブプレノルフィン皮下(.c))および/または解熱剤(4mg/kg体重カルプロフェン.c)必要に応じて、SCIモデルの場合、術後抗生物質療法(7.5mg/kg体重1os(p.o.))を提供する。
   8. 脊髄損傷の場合は、自発的な排尿が戻るまでラットの膀胱を手動で空にする。

4. 歩行分析前の外科的介入からの回復

注意:坐骨神経損傷を有するラットは、神経損傷後の痛みを伴う神経障害の発症のために後足をかじる傾向を示す。この形式の自動切断は、それぞれの後足のつま先または部分の自動切断をもたらす可能性があります。坐骨神経損傷モデルを使用する場合に備えて他のラット株よりもルイスラットを好む、このラット株は、自家突然変異³¹の小さい傾向を示すように。坐骨神経損傷を有するラットはまた、操作された四肢の拘縮を発症する傾向を示し、データ取得の干渉による研究からの排除をもたらす可能性がある。このような有害事象は、大腿骨損傷を有するラットではあまり一般的に起こらない。

1. 手術後の手術後、毎日、手足と足の状態に特に注意を払って手術動物を検査する。
   注意:SCIを有するラットでは、Th11の高さで、陰茎または直腸脱は、動物の排尿および排便能力の障害のために起こり得る。これらの事象は、一般的に研究のヒトエンドポイントとして定義され、研究から影響を受けた動物を即時に排除していることを暗示する。
2. ラットが痛み関連の症状を表示しなくなるまで術後の鎮痛を続ける。
3. 持続的な痛みの場合, ガバペンチンを投与 (30-120 mg/kg体重) p.o. 神経因性疼痛を治療します。

5. 自動歩行分析を行う前の準備

注:歩行分析システムの方法論は、緑色のLEDライトで照らされたガラス板を横切りながら、下から動物を記録することにあります。動物の足が床に接触すると、足のプリントの領域が照らされ、高速ビデオカメラによって記録されます。このデータは、イーサネットケーブルを介して、歩行解析ソフトウェアを実行しているコンピュータに送信されます。個々のフットプリントは実験者によって手動で分類できますが、最新のソフトウェアバージョンには自動フットプリント分類も含まれています。

1. 暗闇の中で、不穏な騒音がない場合は、すべてのテスト手順を実行します。ラットは超音速周波数を知覚することができるので、そのような音を発するソースがないことを確認します。
   注:毎週または隔週で歩行分析を行いますが、特にルイスラットがあまりにも頻繁に特定の運動にさらされると、時間の経過とともに手順に参加することに興味を失う傾向があるため、ラットを頻繁にテストしないでください。しかし、手術前に5日間毎日ラットをトレーニングし、検査環境と手順に順応させる必要があります。
2. トレーニングセッション中やテスト当日に、すべての光源をオフにして行動テストルームを準備します。カメラから離れた場所にデータ取得に必要なコンピュータ画面を配置して、カメラに光が干渉しないようにします。
3. デバイスが安定した位置に設置され、データ取得手順に重大な影響を与えるため、あらゆる形態の振動を防ぐ方法で設置されていることを確認してください。
4. ラットを行動検査室に持ち込み、テストの前に少なくとも30分間、自分の家のケージに入れます。
   注意:動物を扱う際は、手術用ガウンやラボコート、手袋、マスクなどの個人用保護具を着用してください。

6. 自動歩行解析の実行

1. トレーニングセッション
   注:トレーニング中は、動物は学習曲線を受け取るので、トレーニングスケジュールを徐々に調整することをお勧めします。各トレーニングセッションが正常に完了した後、動物に報酬を与えるために、食べ物の報酬(例えば、1〜2個の朝食シリアル)を使用してください。
   1. 訓練の初日に、動物を幹の下に持ってそっと持ち上げ、歩道の入り口にそっと運びます。
   2. 入り口エリアに動物を配置し、それはテスト手順を実行する人からの干渉なしに廊下の開口部を探索してみましょう。
      注:歩道を渡るためにそれを動機づけるために動物を叫んだり、笛を吹いたり、吹いたり、突いたりしないでください。このような行動はすべて、動物に深刻なストレスを与え、データ取得手順をさらに複雑にします。
   3. 動物が自発的にその家のケージに到達するために歩道を横切るまで待ちます。時には、特に訓練されていない動物では、これは数分かかることがあります。最初の訓練日には、動物は均一な歩行速度で途切れない走りをすることは期待されておらず、必要もありません。代わりに、それはテスト装置と手順で自分自身を順応する必要があります。
   4. 訓練の2日目には、動物はためらうことなく歩道に入り、またためらうことなく自宅のケージに戻ることを慣らします。一部の動物はおそらくすでに中断することなく歩道を横断することを学んでいるでしょうが、これはまだ2日目の終わりには必要ありません。
   5. 訓練の3日目に、動物がためらい、スニッフィング、またはその他の探索的な動きなしに歩道を横断することを学ぶことを確認してください。彼らは均一な速度で歩くことを確認してください。
   6. トレーニングの 4 日目と 5 日目に、前の演習を繰り返してテスト手順を統合します。
      注意:動物が5日間のトレーニング期間の終わりまでに歩道を適切に横断するために必要なスキルを習得していない場合は、トレーニングの2日(例えば、週末)を追加します。また、1日に3回までのトレーニングセッションを、個々のセッション間で少なくとも2時間の休息で区切って実施することを検討してください。症例の95%では、動物はこの延長訓練期間の終わりまでに必要な訓練経験を獲得しているであろう。まれに、動物が7日間の訓練の後にまだこのスキルを習得していない場合、計画された実験手術セッションを少なくとも1週間延期し、前述の訓練体制を繰り返すことを推奨する。

7. データ取得

注:歩行解析システムは、動物が歩いている間に各足のプリントを視覚化し、自動的に足のプリント領域、足の印刷強度、足のスイング時間、および足のスイング速度(表1)などの様々な歩行パラメータを分析します。歩行分析システムは、動物の足のプリントによって生成された強度に基づいてすべてのデータを記録するので、カメラの設定がラットの体重とサイズに応じて調整されていることを確認してください。さらに、データの取得に影響を与えないように、データ記録の前に歩道が乾燥して清潔であることを確認してください。

1. データを取得する前に、市販のガラスクリーナーとスキージを使用して歩道を清掃してください。ガラス板を数回スプレーし、スキージで拭き取り、表面から粒子を取り除きます。また、下を清掃してください。動物が歩き、記録されたデータに影響を与える可能性があるため、歩道の端から流体を取り除いてください。
2. 必要に応じて、例えば、歩道の汚染と別のケージからのラットのデータの記録前に、洗浄手順を繰り返します。これは、動物が彼らの特異性の香りに気を取られるのを防ぐと考えられています。
3. 最初のデータ取得の前に、動物の体重に合わせてカメラの設定を調整してください。最も軽くて重い動物を歩道に置いて確認し、どちらの場合も良好なデータ品質を可能にするカメラ設定を選択します。最適な足のプリント検出を確実にするために、カメラゲイン、赤天井ライト、緑の歩道ライト、およびグリーン強度しきい値(GIT)を調整します。
   注意: 取得したデータの比較が妨げられるため、データ取得の開始後に選択した設定を変更しないでください。例外として、データ分類中に GIT を変更できますが、これはすべての試行に対して一様に行う必要があります。
4. 用意されているキャリブレーションシートを使用して、歩道を定義し、較正します。
5. [ 設定 ]タブに表示されている登録済みのカメラを選択します。
6. [取得]タブにある[取得を開く] ボタンをクリックします。
7. 次のデータ取得手順を通じて参照として使用される、空のクリーニングされた歩道のスナップショットを作成します。
8. 状態が [スナップショットの待機中] から [取得準備完了]に変わります。
9. [取得の 開始 ] ボタンをクリックし、ステータスが [取得の準備完了] から [ 実行開始を待っている] に変わったことに注目します。
10. 歩道にネズミを置き、コンピュータ画面上の動物の動きに従ってください。状態が [ 実行の待機中] から [記録の開始] から [記録実行] に変わります。
    注: ソフトウェアは、緑色のシンボルでプリセット実行特性に従って準拠とみなす実行を自動的に分類し、非準拠の実行には赤い記号が付きます。ソフトウェアは、3 つの準拠した実行が記録されたときに自動的にデータの取得を停止しますが、データの取得を続行するには、もう一度 取得 開始ボタンをクリックします。

8. データ分類

注: AGA 結果パラメータのリストについては、 表 1 を参照してください。動物が²⁷をためらうことなく着実に歩道を横断しなければならない少なくとも3つの準拠した実行が必要です。さらに、走行速度は、文献³⁰で定義されているのと同じカテゴリ内で一致する必要があります。

1. 分類する各試験の「実験エクスプローラー 」タブの「分類」ボタンをクリックします。
2. データが前に記載されている要件に準拠しているかどうか印象を得るために通常の速度で取得した実行を再生します。
3. 左上隅で、ソフトウェアによる足のプリントの自動分類を行う 自動分類 ボタンをクリックします。
   注:ソフトウェアは正しい足の分類の高い率を持っていますが、時にはプリントに足を割り当てることに失敗したり、間違った足を割り当てます。したがって、自動分類された足のプリントは、その後必ず再確認してください。
4. 通常ステップシーケンスパターン(NSSP)の正しい計算を行うために、分類アルゴリズムが見えない足のプリントと混同され、NSSPに欠陥が生じないようにしてください(図1A)。したがって、NSSP計算のために対側足も見える間に検出可能な足のプリントのみを含む、例えば、左前足(LF)および右後足(RH)(図1B)。

図1:例示的なAGAデータは、正しいデータ分類の手動による二重検査の必要性を示す。前足の検出された配置が別の前足の検出された配置によって成功した場合(A)、後足が検出されていないので、AGAソフトウェアはこれを調整されていない歩行パターンと混同する可能性があります。したがって、常にダブルチェックし、反対の足も見えるときに検出される最初の足のプリントを選択することをお勧めします(B)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

9. 統計の計算

注: 時間の経過に伴う体重増加に関する変化の実行データを調整するには、実験用足の比を非実験的(コントロール)足で計算することを強くお勧めします。さらに、足の使用における個人差を考慮するために、この足と足の比較の術前値に対する比率を計算する。

1. [ 実行統計の表示 ] ボタンをクリックすると、実行統計の概要が表示されます。
2. 実行統計または試用版の統計をスプレッドシート ソフトウェアにエクスポートするには、[ ファイル と エクスポート ] を選択します。

結果

12匹のラットが実験的末梢神経手術を受けた。坐骨神経切除術(図2A)は7ラットで行い、一方で大腿神経神経緊張症(図2B)は5ラットで誘発した。すべての動物において、神経欠損は自家神経移植によって再構築された。脊髄失調傷害(図2C)レベル_Th11 では6匹のラットで誘発され、合計18匹のラットを生じた。

図2:神経再建後の手術部位坐骨神経(A)および大腿神経(B)、ならびに脊髄失禁傷害後の自己移植片による神経再建(C) この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

すべての動物は手術から順調に回復し、自己突然変異の症例は起こらなかった。坐骨神経損傷群の1匹の動物は、術後観察期間中に右後足の強い拘縮を発症し、さらなるデータ分析から除外されなければならなかった。

坐骨神経障害症
坐骨神経は、大部分の後肢に筋肉および感覚的な内挿を提供するので、その切除は、運動機能の重篤な障害をもたらす。外傷後、ラットは足のかかとを体重サポートのみに使用し(図3B–E)、四肢は外転運動で移動する。したがって、AGAを介して評価された運動運動の変化は、著しく縮小されたプリント領域(図4A)によって明らかになり、スイングタイムを有意に増加させた(図4B)。両方のパラメータは、観測期間の終わりのように、プレOP測定と比較して依然として有意に変化した。注目に、1匹の動物が術後週(WPO)10から始まる右後足の強い拘縮を発症した。その結果、WPO12の左足と比較して、右後足のプリント領域が150%以上に増加しました(図5)。これは、この研究で評価された他のすべての動物と比較して極値であったため、印刷面積に関するデータ分析からこの動物を除外しました。

図3:右坐骨神経および自己移植片修復の重要なサイズ切除の前および後の代表的な足のプリント。術前と比較して、神経損傷後のプリント領域の印刷領域の強い減少(B)に注意してください(A)。観察期間(C–E)の間にプリント領域のわずかな増分にもかかわらず、右後肢の足のプリントはベースライン記録から顕著に変化したままでした。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:坐骨神経の重篤なサイズ切除および自己移植片修復後の機能的回復の過程。印字領域比(A)とスイング時間比(B)は、坐骨神経切除直後に、術前の値から統計的に有意に変化した。印刷領域は、WPO10までベースラインと比較して大幅に減少したままでしたが、スイング時間はWPO12のプレOP値に大幅に増加しました。*: p < 0.05 プレ OP と比較して、 **: p < 0.01 プレ OP と比較して。誤差範囲は、平均値±平均値(SEM)の標準誤差を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:坐骨神経損傷後のプリント領域の経過の箱ひげ図。1匹の動物がWPO10から始まる右後足の強い拘縮を発症したという事実によって説明されるWPO12の極値(赤い楕円)に注意してください。したがって、動物は 図4に示す統計分析から除外された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

大腿神経神経障害
大腿神経切除は、大腿^33,34の四頭筋の神経変性をもたらす。その結果、膝の延長が損なわれ、足首関節の過反射と足のかかとの連続した持ち上げが生じる。したがって、それぞれの足のプリント領域(図6B)は、手術後に大幅に減少する。左後足のプリント領域は、重量の左への補正により増加する。この現象は「実験的」と「制御」足の間の計算された比率に直接影響を与えるので、これは心に留めておいてください。再生大腿神経による四頭筋のWPO4再インナーブから始まり、これらの変化の逆転をもたらし、右後足の足のプリント領域が増加する(図7A)。大腿部の四頭筋もそれぞれの足のスイング段階で役割を果たすため、大腿部の神経損傷を有するラットではスイングタイム(図7B)が大きく延長される。プリント領域のリターンを反映して、再生大腿神経が大腿の四頭筋に達するとスイングタイムが減少する。WPO10では、歩行の両方のパラメータがベースラインに戻り、完全な機能回復を示す。

図6:代表的な足のプリント。代表的な足のプリントは、前に(A)と続く(B-E)右大腿神経切除と自己移植片の修復。WPO2(B)ではRHのプリント面積が強く減少し、重量負荷の増加による左後足(LH)のプリント領域の増加が見えるようになった。RH印刷領域は、LHの印刷領域の減少を伴うWPO6(C)から増加し始めました。WPO8 (D) および WPO10 (E) RH の印刷領域は、術前レベルに近い回復しました。(ハインツェルら²²の許可を得て、CC BY 4.0 でライセンスを取得)この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図7:大腿神経の7mm切除術および自己移植片修復後の機能的回復の過程。印刷領域比(A)とスイング時間比(B)のコースは、大腿神経切除直後に強い変化を明らかにしたが、値はWPO8で術前値に回復した。#: p < 0.05.誤差範囲は、SEM±平均値を示します(Heinzelら²²の許可を得て、CC BY 4.0でライセンスされています)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

脊髄損傷
歩行分析は、胸部脊髄失調損傷後に著しく変化した足のプリントを明らかにした(図8)、最も注目すべきプリント領域の減少とWPO2の後足の著しい内部回転(図8B)。注目に、足の回転はBBBの評価可能な機能としても実装され、コンピュータ化された歩行分析の適用性を強調し、もともとオープンフィールドテストで評価された歩行の変化を評価する。個々の歩行パラメータの経過に関しては、Th₁₁ レベルでの脊髄失調は、印刷面積比(図9A)の減少とスイング時間比の増加をもたらした(図9B)。両方のパラメータは、観測期間のさらなる経過の間にベースラインレベルに向かって傾向がありましたが、観察可能な統計的に有意な変化はありませんでした。WPO2では、コーディネーション関連パラメータの規則性指数(図9C)も減少しましたが、動物間での度合いは大きく異なっていました。また、WPO16まで術前の値に向かう傾向があります。後足の支持基盤(図9D)は、デューメンによる歩行の一般的なパラメータであり、WPO10からWPO14まで統計的に有意であった顕著な増加を示した。これは、WPO16のベースラインレベルに向かって傾向があり、この時点でPre-OP値から大幅に変更されなくなりました。

図8:2つの後足の代表的な足のプリント。足は術前にプリントする(A)、胸部脊髄失調損傷(B-F)に続く。WPO2(B)から始まる印刷領域の減少は、足の顕著な内部回転を伴う。観測期間(C–F)の間に、プリント領域の増分は、内部回転のクリアランスと同様に観察可能である。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図9:第11レベルにおける脊髄損傷。Th 11における脊髄欠転は、印刷領域比(A)とスイングタイム(B)および規則性指数(C)の観察可能な変化をもたらしたが、これらの変化は統計的に有意ではなかった。傷害の後、後足の支持基盤はベースラインと比較して顕著な増加を示し、WPO10ではWPO14まで統計的に有意であった。*: P < 0.05 プレ OP と比較して。エラー バーは SEM ±平均 値を示します。

補足ファイル 1: トラブルシューティングの詳細。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

PNIおよびSCIの動物モデルにおける機能回復の評価は、個々の長所と短所を持つ多種多様な評価方法のために依然として困難である。周辺および中枢神経損傷の複数のモデルでテストされ、検証されたアプローチはごくわずかですが、モーショントラッキングと機械学習を組み合わせた有望な新しい技術は、神経行動研究を次のレベルの機能テストに推進する可能性があります。私たちは、多種多様な動物や傷害モデルに広く適用される最先端の方法がすぐに出現すると確信しています。これらの考慮事項に照らして、AGAの利点の1つは、1つのデバイスのみを使用して神経損傷の複数のモデルにおける機能的回復を評価する可能性である。このアプローチは2000年代初頭から、坐骨^神経37、腹膜^38、大腿神経損傷モデル^22、ならびに腰椎³⁹および腕神経叢⁴⁰の両方の根型の外因後のPNIの実験モデルにおいて使用されてきた。脊髄損傷を含む様々な中枢神経損傷も、方法^41,42で研究されている。本稿では、一般的に研究されている3つの神経損傷を誘発する方法と、その後の機能回復を評価する方法に関する詳細なプロトコルを発表した。私たちの意見では、この方法の有利な機能を最適に利用する方法について、実験的な神経損傷、修復、再生の分野に興味を持つ研究者のための実践的なガイドラインが大きな助けになるでしょう。

いくつかの著者は、げっ歯類の機能的回復を評価するAGAの可能性に対処し、同時に運動と感覚リナーブ^27、28に関連する歩行パラメータを評価する方法の利点を強調している。さらに、実験足からのデータの比較、例えば、提示された両方のモデルで示されたように、未操作の足に神経損傷を再構築し、動物内陽性対照を含めることを可能にする。逆に、外科的再建または追加の治療を伴わない手術足は、動物内陰性対照として機能する可能性がある。また、機械学習アプローチ⁴³とAGAを組み合わせることが可能であることを示した。この方法の利点にもかかわらず、それはまた、取得手順^28、44に動物を慣れさせる必須である時間のかかる訓練努力などのいくつかの制限と欠点^を有する。AGAのもう一つの制限は、装置の限られた寸法による試験対象動物の最大サイズである。したがって、AGAの使用は現在、げっ歯類およびフェレット⁴⁵の大きさの動物に限定されている。さらに、最近、機械学習が可能なモーショントラッキングの分野における新たな神経行動評価アプローチは、包括的性と可能なアプリケーション^18、19、46の両方でAGA^を上回る可能性がある。特筆すべきはありますが、他の評価方法に従って、AGAによって評価される機能回復は、坐骨神経症^47,48のモデルにおいて、たとえ起こっているとしても、強く制限されているようです。一方、AGAは、我々のデータに示されるように、大腿神経神経緊張症に続く機能回復の経過の包括的な評価を可能にする。この研究により、Pawプリントエリアは、AGAを介して評価可能な代表的な歩行パラメータであり、前述の2つの末梢神経損傷モデルにおける機能的回復の過程で例示的であることを実証した。機能的回復性の高い部分は、大腿神経の自己移植片修復後に観察可能であったが、AGAパラメータは、坐骨神経の自己移植片修復後の観察期間の終わりにベースラインから依然として有意に変化した。この文脈では、四肢拘縮は坐骨神経損傷を有するラットでは一般的な現象であり、筋肉の不均衡および麻痺の兆候を進行機能回復³²と混同しないように注意が必要であるということは注目に値する。これは一方では、このモデルにおける神経障害後の有意な機能的回復を検出できないことをAGA法に強調する。一方、神経損傷がアキソノトメシス⁴⁸よりも重篤な場合に一般に歩行解析を行うことによって、最も一般的に使用されている実験神経修復モデルであるラットの坐骨神経損傷モデルを評価することが可能かどうかという疑問が生じた。トラブルシューティングの詳細については、補足ファイル 1 を参照してください。

また、脊髄損傷を有するラットにおける運動機能を評価する方法の使用に関する例示的なデータを提供した。同じ原理は、中枢神経損傷(CNI)26、49、50および根の外傷の他のげっ歯類モデルに適用されます。孤立したPNIとは対照的に、脊髄の傷害は、コルチコ脊髄およびルーブロ脊柱などのエフェレント経路および後部柱およびスピノタラン血道³⁵のような発泡性経路を含む、非常に重要な構造の多数が損傷を受けるため、病態生理学的結果においてはるかに複雑である。これらの病理学的変化を適切に評価する課題は、バッソ、ビーティ、ブレスナハン(BBB)スコア³⁶などの行動検査の包括的な軍備に反映される。歩行パラメータのベースオブサポートは、中枢神経損傷後に増加することが報告されています, おそらく結果として安定した歩行を説明します.サポートの基盤は、我々のモデルのWPO10からWPO14までのベースラインから大幅に変更され、このパラメータは胸部脊髄損傷後のAGAによる機能的回復の経過の評価を可能にするという我々の仮定を支持した。

我々は、AGAが神経系の損傷を伴うげっ歯類の機能的回復を評価するための実行可能なツールであると確信している。それにもかかわらず、それぞれの実験セットアップにおいて、歩行の変化が注意深く、徹底的に反映することを勧める。歩行パラメータの変化、例えば、即時術後の減少に続く印刷領域の増加、またはこのパラメータの即時術後上昇を進めるスイング時間の減少は、観察期間の過程で必然的に機能的回復に関連しない。代わりに、これらの変化は、ラットが獲物種であることを考えると、目立たない足取りを維持するために可能な機能的適応に関連し、潜在的な捕食者⁵¹に痛みや障害を示すことを避けようとする。したがって、末梢神経損傷および再生²¹の他の結果尺度に歩行の変化を関連付ける補完的なツールとして、自動歩行分析を使用することが推奨される。前述のように、我々の発見は、この場合の機能的回復が著しく制限されていることを強く示しているので、坐骨神経神経障害を有するげっ歯類をAGAによって調査する必要がある場合は、慎重に反映されるべきであると考えています。

私たちの仕事に示すように、AGAの主な資産は、1つのセットアップを必要としながら、実験的なPNIモデルだけでなく、CNIの多数のモータと感覚の再インナーブの両方を研究する可能性です。したがって、この方法は、我々の意見では、包括的な神経行動検査のための非常に貴重なツールである。AGAの資産の1つは、PNIとCNIの様々な動物モデルで運動と感覚の再インナーブを研究する可能性があり、1つのセットアップしか必要としないが、歩行トラック分析^52、フォン・フレイ試験^53、または歩行運動学¹⁶のような機能的回復を研究する他の評価方法と比較して、この方法の主な利点である。再インナートマッスル²² の電気生理学的調査の結果または官能機能⁵⁴ の評価方法と相関する歩行の変化を同時に評価する可能性は、この方法の将来の応用に関して有望である。したがって、AGAを使用して、尺骨、放射状、中枢神経、または実験的神経移動モデル⁵⁵などの前肢PNIのげっ歯類モデルの機能的回復を調査することをお勧めします。

ここでは、神経損傷の3つのげっ歯類モデルの機能回復を研究するために、自動歩行分析を使用する方法に関する詳細なプロトコルを提供します。この方法では、十分なトレーニングや細心の注意を払ったハードおよびソフトウェアのキャリブレーションなど、さまざまな重要な側面を慎重に検討する必要がありますが、中枢神経損傷および末梢神経損傷のげっ歯類モデルにおける神経再生を評価することは、実現可能で貴重な補完的なツールです。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	B. Braun Austria	3570410	Vehicle for drug delivery
1 ml syringe	B. Braun Austria	9161708V	Injecting device
10 ml syringe	B. Braun Austria	4606728 V	Injecting device
1-Propanol, 2-Propanol, Hexetidin	Gebro Pharma	N/A	Alcoholic skin disinfection
23-gauge (G) canula	B. Braun Austria	4657667	Canula for s.c. injection
26-gauge (G) canula	B. Braun Austria	4657683	Canula for s.c. injection
5 ml syringe	B. Braun Austria	4606710 V	Injecting device
Buprenorphine hydrochloride	Sigma	B9275	Analgetic agent
Burrs for Micro Drill	F.S.T	19007-29	Drilling of a hole inside the lamina
Caprofen	Zoetis Austria	N/A	Analgetic agent
Catwalk Automated gait analysis system	Noldus	N/A	Automatic analysis software of animal gait
Cauterizer Kit	F.S.T	18010-00	Cauterization of vessels during surgery
Enrofloxacin	Bayer Austria	N/A	Antibiotic
Ethilon (10-0)	ETHICON	2810G	Suture material for neurrorhaphy
Ethilon (11-0)	ETHICON	EH7465G	Suture material for neurrorhaphy
Eye ointment	Fresenius Kabi Austria	4302436	Eye protection during anesthesia
Friedman-Pearson Rongeurs	F.S.T	16221-14	Surgical instrument
Gabapentin	Wedgewood Pharmacy	N/A	Analgetic agent
Goldstein retractor	F.S.T	17003-03	Retraction of tissues during surgery
Hair trimmer	Aescular	N/A	Hair trimmer for shaving of the operation site prior to surgery
Heating Pad for rodents	ALA Scientific Instruments	N/A	Regulation of body temperature
Impactor	Precision Systems and Instrumentation	N/A	Induction of spinal cord contusion
Lewis rat ()	Janvier	N/A	Experimental animal
Magnetic Fixator Retraction System	F.S.T	18200-50	Retraction of tissues during surgery
Metzenbaum Baby Scissors	F.S.T	14019-13	Surgical instrument
Micro Drill	Word Precision Instruments	503599	Instrument for bone drilling
Micro Needle holder	F.S.T	12076-12	Surgical instrument
Micro-scissors (curved)	F.S.T	15023-10	Surgical instrument
Micro-scissors (straight)	F.S.T	15007-08	Surgical instrument
Mirror Finish Forceps	F.S.T	11251-23	Surgical instrument
Needle holder	F.S.T	12002-12	Surgical instrument
Operating microscope	Leica	M651 MSD	Magnification of the operative site
Povidone Iod	B. Braun Melsungen	N/A	Non-alcoholic skin disinfectant
Pulse Oximeter	STARR Life Sciences	N/A	Surveillance of heart rate and oxygen saturation
Rodent thermometer	BIOSEB	BIO-TK8851	Surveillance of body temperature
Scalpel blade	F.S.T	10010-00 (#10)	Surgical instrument to make an incision
Scalpel handle	F.S.T	10003-12 (#3)	Surgical instrument to make an incision
Sevoflurane Inhalation Vapour, Liquid (100%)	Baxter	HDG9117A	Anesthetic
Spatula & Probe	F.S.T	10090-13	Surgical instrument
Sprague Dawley rat ()	Janvier	N/A	Experimental animal
Sterila gauze 5x5cm	EVAC MEDICAL	E010.03.00215	Sterile gauze compress
Tissue Forceps	F.S.T	11021-12	Surgical instrument
Vicryl (4-0)	ETHICON	V3040H	Suture material for subcutaneous sutures
Vicryl (5-0)	ETHICON	V303H	Suture material for subcutaneous sutures
Vicryl cutting needle (4-0)	ETHICON	V392ZH	Suture material for skin sutures
Vicryl cutting needle (5-0)	ETHICON	V391H	Suture material for skin sutures