睡眠の無効化装置:ショウジョウバエを奪う睡眠の非常に効率的な方法

要約

睡眠不足は、睡眠機能と調節を調査するための強力なツールです。我々は、睡眠排便装置を使用して ショウジョウバエ を奪い、剥奪によって誘発されるリバウンド睡眠の程度を決定するプロトコルを記述する。

要約

睡眠恒常性は、睡眠喪失後に観察される睡眠の増加であり、動物界全体の睡眠を識別するために使用される定義基準の1つである。その結果、睡眠不足と睡眠制限は、睡眠機能に関する洞察を提供するために一般的に使用される強力なツールです。しかし、睡眠不足の実験は、剥奪刺激自体が生理学と行動の観察された変化の原因である可能性があるという点で本質的に問題です。したがって、成功した睡眠不足技術は、動物を目覚めさせ、理想的には、意図しない結果を多数誘発することなく、堅牢な睡眠リバウンドをもたらすべきである。ここでは、ショ ウジョウバエのメラノガスターの睡眠剥奪技術について説明します。睡眠の無効化装置(SNAP)は否定的なジオタキシスを誘発するために10年代ごとに刺激を与える。刺激は予測可能であるが、SNAPは効果的に高い睡眠駆動を持つハエでも夜間睡眠の>95%を防ぐ。重要なことに、その後の恒恒動応答は、手による剥奪を用いて達成された応答と非常によく似ている。刺激のタイミングと間隔は睡眠喪失を最小限に抑え、刺激が生理学や行動に及ぼす非特異的な影響を調べるために変更することができる。また、睡眠制限や覚醒閾値の評価にも使用できます。SNAPは、睡眠機能をよりよく理解するために使用できる強力な睡眠破壊技術です。

概要

睡眠は動物では普遍的に近いが、その機能は不明のままである。睡眠恒常性は、睡眠不足後の睡眠の代償的増加、睡眠の定義性の特性であり、多くの動物^{1、2、3、4、5}の睡眠状態を特徴付けるために使用されてきた。

ハエの睡眠は、睡眠喪失^4、5に対する堅牢な恒育応答を含む、人間の睡眠と多くの類似点を有する。ハエの睡眠に関する数多くの研究は、睡眠不足を使用して、延長覚覚から生じる有害な結果を調べることによって睡眠機能を推測し、睡眠の恒食調節を制御する神経生物学的メカニズムを決定することによって睡眠調節を理解してきた。したがって、睡眠不足のハエは、学習と記憶^{6、7、8、9、10、11、12、}構造可塑性^{13、14、15、}視覚注意^16、神経損傷^17、18、交配および攻撃的な行動^19、交配および攻撃的な行動の障害を示すことが示された^。20、細胞増殖^21、及び酸化ストレス²²に対する応答を^、23に挙げ、いくつか挙げる。さらに、リバウンド睡眠を制御する神経生物学的メカニズムの調査は、睡眠ホメオスタット^{8、9、23、24、25、26、27、28、29}を構成する神経機構に関する重要な洞察^を生み出した^。 .最後に、健康な動物の睡眠機能に関する基本的な洞察を明らかにすることに加えて、睡眠不足の研究はまた、病気の状態で睡眠機能に関する洞察を知らせた^30、31。

睡眠不足は間違いなく強力なツールですが、睡眠不足実験では、動物を目覚めさせるために使用される刺激によって誘発されるものと、拡張覚醒から生じる表記型を区別することが重要です。手の剥奪または穏やかな取り扱いによる睡眠不足は、一般的に、最小限の破壊的な睡眠剥奪のための標準を設定すると考えられている。ここでは、睡眠無効装置(SNAP)を使用してハエを奪う睡眠プロトコルについて説明します。SNAPは、10年代ごとにハエに機械的刺激を与え、負のジオタキシスを誘発してハエを目覚めさせる装置です(図1)。SNAPは、高い睡眠駆動^8、32を持つハエであっても、夜間の睡眠の>98%のハエを効率的に奪う。SNAPは強打敏感なハエで較正されており、SNAP内のハエの攪拌はハエに害を与えません。SNAPによる睡眠不足は、手の剥奪によって得られたものと同等のリバウンドを誘発^する7.SNAPは、したがって、覚醒刺激の影響を制御しながら、ハエを奪う睡眠を取る堅牢な方法です。

プロトコル

1. 実験準備

1. 彼らは男性と女性のハエを分離し、バイアルに閉じるようにハエを収集します。
   注:睡眠実験は、一般的に雌のハエで行われます。処女女性を収集することが重要です。嵌合雌は、データの分析を複雑にする幼虫に孵化する卵を産む。
2. <20のグループで単一のセックスの家のハエ。
   注:社会的に豊かな環境(>50のグループ)での住宅ハエは、睡眠ドライブ^6、13リバウンド睡眠の潜在的に交わる測定値を調節します。さらに、社会的な豊かさに続いて、睡眠は数日で減少^{します 6}.したがって、ベースライン睡眠は、リバウンド睡眠の分析を複雑にする安定ではない。<20のグループでハエを維持することは、この潜在的な混乱を回避します。
3. 光と湿度制御された環境で3〜5日間バイアルにハエを入れておいてください。
   注意:ハエの年齢と成熟度は睡眠に強く影響を与えます。睡眠は1日齢のハエで高く^、4歳の3〜5日で安定します。ハエは通常12時間の光で維持されます:湿度50%で12時間の暗いスケジュール。

2. 睡眠記録用チューブの準備

メモ:睡眠は運動活動モニターを使用して監視されます。モニターは5つのmmの直径の管の個々に収容される32のハエを収容できる。典型的には、遺伝子型は16または32ハエのグループで分析される。

1. 一方の端にフライフードでチューブの適切な数を準備します。
   注意:食事と代謝は睡眠^33、34に影響することが知られているので^、彼らが飼育されたのと同じ食べ物にハエを置くことを特に重要です。
2. チューブの端をワックスで密封します。
   注:睡眠不足とリバウンドは5日間の実験であり、適切に密封しないと食べ物が乾燥する可能性があります。適切に密閉されたチューブでは、食品を10日以上維持することができる。したがって、チューブの端部がうまく密閉されていることを確認することが重要です。しかし、ハエは濡れた食べ物にこだわることもあります。したがって、実験開始の1〜2日前にチューブを作るのに役立ちます。
3. 個別にウェイクを配置し、アスピレーターを使用して睡眠記録のための65ミリメートルの長いガラス管にハエを振る舞い、泡ストッパーでチューブの端を差し込みます。
   注:ハエを睡眠記録のためにチューブに入れると、ハエは_CO2 麻酔に再び曝されることはありません。吸引器は、一端をチーズクロスで覆ったゴムチューブから作られ、1 mLピペットチップに挿入されます。

3. 睡眠の記録

1. 睡眠を監視するために活動モニターにチューブでハエをロードします。
   注意:スナップ岩は-60°から+60°から~10 sごとに前後に監視します。モニターは~5.9sの-60°で保持されています。モニターを保持しているトレイが-60°から+60°に移動し、〜1 sが+60°から-60°に戻るには〜2.9 sかかります。サイクル長は、モータに供給される電圧を調整することで、必要に応じて変更できます。
   1. チューブが正しい向きのアクティビティモニタに配置されていることを確認するように注意してください。正しい向きで、食べ物とチューブの端は、ハエが食品に押し込まないようにスナップの上部にあります。また、食べ物との終わりは睡眠記録のジャッキとモニターの側にある。これにより、アクティビティモニタをSNAPで正しく向け、同時に活動を監視しながら効率的な睡眠不足を実現できます。
2. 活動モニターを記録室に設置し、睡眠を監視します。
3. ベースラインスリープを推定するために、少なくとも2日間の睡眠を監視します。
   注:ハエがアクティビティモニターにロードされる日は、通常、ハエがチューブに収容されることに適応できるように適応日として除外されます。ベースライン睡眠は、ハエがロードされた日の翌朝から始まる少なくとも2日間(48時間)記録されます。
4. アクティビティ記録ソフトウェア(例えば、午前8時から午前8時まで)を使用して、特定の日のライトの時間から前日のライトまでの1分のビンのハエの運動活動数を保存します。
5. 睡眠の発作のしきい値として5分の非活動を使用してカスタムマクロを使用して運動活動データから睡眠を推定する³⁵.
   注: 睡眠メトリックの数は、運動活動カウントから計算されます。これらは、24時間以上のmin /hで睡眠、24時間の合計睡眠時間、平均および最大昼時間と夜間睡眠の長さ³⁶が含まれます。

4. 睡眠不足と回復

1. ハエは可変長の時間(例えば、12時間、24時間および36時間)のために睡眠を奪われ得、回復睡眠はまた、様々な間隔(例えば、6時間、12時間、24時間および48時間)で評価することができ、実験的必要性によって回復の持続時間を決定する。睡眠回復は、睡眠の利得/損失プロットを使用して、または所定の間隔(例えば、6時間)にわたって回復した睡眠率を調べることによって視覚化することができます。
2. 2つのベースライン日にわたって睡眠が安定している場合は、3日目に、活動モニターをSNAPに入れ、一晩の睡眠不足を引き起こします。
   注:ハエは^{睡眠時間8、32、37、38}の範囲にわたって堅牢な睡眠リバウンドを示しますが^、睡眠は確実にリバウンド睡眠を評価するために安定している必要があります。ベースライン日数間の睡眠の差が100分±場合、睡眠は安定している。
3. モニタホルダーピン、モニタコードを接続し、背面にフードを付けて最後に正しく向き、前面にプラスチックバリアを配置して、アクティビティモニタが所定の位置に固定されていることを確認します(図1)。
   注:スナップは、カムが10 s(図1)に1回回転するように設計されています。プラスチック製のインサートは、装置が「上」の位置にあるときにチューブを押し戻すことによってチューブをリセットします。チューブをリセットすることは、すべてのチューブが各サイクルの開始時に全範囲の運動を持つことを保証するために重要です。
4. アクティビティモニタを抜き、一晩の睡眠不足の後のライトの上にすぐにSNAPからモニターを取り出します。
   注:睡眠不足を終了し、ハエは一晩の睡眠不足の12時間後のライトの直後に回復に置かれることが重要です。ハエを回復に入れるのに20〜30分の遅延でさえ、リバウンド睡眠の範囲を妨げる可能性があります。
5. ハエを記録室に置き、回復睡眠を監視するために2日間(48時間)邪魔されません。
   注:記録室が他の実験に使用されている場合は、ハエの回復を刺激しないように細心の注意を払う必要があります。
6. 睡眠不足の量を計算します。個々のフライごとに、睡眠不足時に得られた睡眠とベースライン中の対応する時間の間の毎時差を計算します。時間ごとの差を合計して、失われた合計睡眠を計算します。
7. 回復した睡眠の量を計算します。個々のフライごとに、回復中に得られた睡眠とベースライン中の対応する時間の時間ごとの差を計算します。得られた合計睡眠を計算するために、毎時の差を合計します。
   注:ハエが実際に睡眠不足であるかどうかは経験的です。したがって、実験者は睡眠不足率を調べる必要があります。フライが十分な睡眠量を失っていない場合は、分析から除外することができます。これは他の睡眠不足のアプローチに必要な場合がありますが、SNAPに必要なことはほとんどありません。より一般的には、睡眠不足が開始される前に、所定のハエで睡眠が安定しない場合があります。睡眠が安定していない場合、恒常性は計算できません。睡眠不足の開始前 ±に計算された睡眠の最大100分の最大差を包含の候補として受け入れます。時折、個々のハエの睡眠は24時間の日に不均一に分配されます(例えば、一部の個人は日中に睡眠クォータの60〜70%を得ることができ、夜間に12時間奪われたときに24時間の睡眠クォータのごく一部しか失わないかもしれません)。これらのハエは別々に評価することができます。
8. 各遺伝子型の回復期間の12時間、24時間、48時間にわたって(ベースラインに対して)回復された睡眠の平均割合を計算します。
9. 睡眠データから、ベースラインの平均および最大の昼間の睡眠の長さと、各遺伝子型の回復日数を計算します。
   注:ハエのリバウンド睡眠は、睡眠量の増加と回復日の睡眠深さの増加によって特徴付けられる。睡眠の深さの尺度として睡眠の統合が使用されます。覚醒閾値は、睡眠深さの尺度としても使用できます。

結果

広州S(Cs)は野生型株として使用した。ハエは12時間の光で維持された:12時間暗いスケジュール、そして睡眠は一晩で12時間奪われた。ベースライン日(bs)、睡眠剥奪日(sd)、および2つの回復日(rec1およびrec2)の睡眠プロファイルの検査は、ハエがSNAPで効果的に睡眠を奪われ、文献^4、5で観察された報告と一致して日中に睡眠?...

ディスカッション

ショウジョウバエの睡眠は、2000年に独立して特徴づけられ、2つのグループ^4、5によって^{特徴付けられていた}。これらの先駆的な研究では、ハエは穏やかな取り扱い(すなわち、手の剥奪)によって睡眠を奪われ、一晩の睡眠不足に対する堅牢なホメオスタティック応答を示すことが示された。重要なことに、睡眠不足の実験では、動物を目覚?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Locomotor activity tubes
Fisher Tissue Prep Wax	Thermo Fisher	13404-122	Wax used for sealing tubes
Glass tubes	Wale Apparatus	244050	We cut 5mm diameter Pyrex glass tubes into 65mm long tubes to record sleep. Pre-cut tubes can also be purchased.
Nutri Fly Bloomington Formulation fly food	Genesee Scientific	66-113	Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in.
Rotary glass cutting tool	Dremel Multi Pro	395	Used to cut 65mm long glass tubes
Monitoring Sleep
DAM System and DAMFileScan software	Trikinetics		Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format
Data acquisition computer	Lenovo	Idea Centre AIO3	A equivalent computer from any manufacturer can substitute
Drosophila Activity Monitors	Trikinetics	DAM2	These monitors are used to record flies' locomotor activity
Environment Monitor	Trikinetics	DEnM	Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded
Light Controller	Trikinetics	LC4	A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off
Power Supply Interface Unit for DAM	Trikinetics	PSIU-9	Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data
RJ11 connector	7001-64PC	Multicomp	DAM monitors accept RJ11 jacks
Splitters	Trikinetics	SPLT5	Used to connect upto 5 DAM monitors
Telephone cable wire	Radioshack	278-367	Phone cables to acquire data from DAM monitors
Sleep Deprivation
Power supply	Gw INSTEK	GPS-30300	Power supply for the SNAP
Sleep Nullifying Apparatus	Washington University School of Medicine machine shop