JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Лишение сна является мощным инструментом для исследования функции сна и регуляции. Мы описываем протокол лишения сна дрозофилы с помощью аппарата Sleep Nullifying и определения степени отскока сна, вызванного лишением.

Аннотация

Гомеостаз сна, увеличение сна, наблюдаемое после потери сна, является одним из определяющих критериев, используемых для идентификации сна во всем животном мире. Как следствие, лишение сна и ограничение сна являются мощными инструментами, которые обычно используются для понимания функции сна. Тем не менее, эксперименты с лишением сна по своей сути проблематичны в том, что сам стимул депривации может быть причиной наблюдаемых изменений в физиологии и поведении. Соответственно, успешные методы лишения сна должны держать животных в сознании и, в идеале, приводить к надежному восстановлению сна, не вызывая также большого количества непреднамеренных последствий. Здесь мы описываем технику лишения сна для Drosophila melanogaster. Аппарат аннулирования сна (SNAP) вводит стимул каждые 10 с, чтобы вызвать отрицательный геотаксис. Хотя стимул предсказуем, SNAP эффективно предотвращает >95% ночного сна даже у мух с высоким драйвом сна. Важно отметить, что последующая гомеостатическая реакция очень похожа на ту, которая достигается с помощью депривации рук. Время и интервал стимулов могут быть изменены, чтобы свести к минимуму потерю сна и, таким образом, изучить неспецифическое влияние стимула на физиологию и поведение. SNAP также может использоваться для ограничения сна и оценки порогов возбуждения. SNAP - это мощная техника нарушения сна, которая может быть использована для лучшего понимания функции сна.

Введение

Сон почти универсален у животных, но его функция остается неясной. Гомеостаз сна, компенсаторное увеличение сна после лишения сна, является определяющим свойством сна, которое было использовано для характеристики состояний сна у ряда животных1,2,3,4,5.

Сон у мухи имеет много общего со сном человека, в том числе сильную гомеостатическую реакцию на потерю сна4,5. Многочисленные исследования сна у мухи использовали лишение сна как для определения функции сна, изучая неблагоприятные последствия, возникающие при длительном пробуждении, так и для понимания регуляции сна путем определения нейробиологических механизмов, контролирующих гомеостатическую регуляцию сна. Таким образом, было показано, что лишенные сна мухи демонстрируют нарушения в обучении и памяти6,7,8,9,10,11,12,структурную пластичность13,14,15,зрительное внимание16,восстановление после повреждения нейронов17,18,брачное и агрессивное поведение19, 20,пролиферация клеток21и реакции на окислительный стресс22,23, чтобы назвать несколько. Кроме того, исследования нейробиологических механизмов, контролирующих отскок сна, дали критическое представление о нейронном механизме, который составляет гомеостат сна8,9,23,24,25,26,27,28,29 . Наконец, в дополнение к выявлению фундаментального понимания функции сна у здоровых животных, исследования депривации сна также дали представление о функции сна в больных состояниях30,31.

Хотя лишение сна, несомненно, является мощным инструментом, при любом эксперименте по лишению сна важно различать фенотипы, которые являются результатом длительного бодрствования, от тех, которые вызваны стимулом, используемым для бодрствования животного. Лишение сна путем лишения рук или мягкого обращения, как правило, рассматривается как установление стандарта для минимально разрушительного лишения сна. Здесь мы описываем протокол для мух, лишающих сна, с помощью аппарата sleep Nullifying Apparatus (SNAP). SNAP - это устройство, которое обеспечивает механический стимул для мух каждые 10 с, удерживая мух в сознании, вызывая отрицательный геотаксис(рисунок 1). SNAP эффективно лишает мух >98% ночного сна, даже у мух с высоким драйвом сна8,32. SNAP был откалиброван на чувствительных к удару мух, перемешивание мух в SNAP не вредит мухам; лишение сна с помощью SNAP вызывает отскок, сравнимый с полученным при лишении рук7. Таким образом, SNAP является надежным методом лишения сна мух, контролируя при этом эффекты возбуждающего стимула.

протокол

1. Экспериментальная подготовка

  1. Собирайте мух, когда они совмещиваются во флаконы, разделяя самцов и самок мух.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты во сне обычно проводятся с самками мух. Важно собирать девственных самок. Спаренные самки будут откладывать яйца, которые вылупляются в личинок, что усложняет анализ данных.
  2. Домашние мухи одного пола группами <20.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жилищные мухи в социально обогащенной среде (группы >50) модулируют сондрайва 6,13 потенциально путают измерения отскока сна. Далее, после социального обогащения, сон будет снижаться в течение несколькихдней 6. Таким образом, базовый сон не является стабильным, что усложняет анализ отскока сна. Содержание мух в группах <20 позволяет избежать этой потенциальной путаницы.
  3. Храните мух во флаконах в течение 3-5 дней в легкой и влажностной среде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возраст и зрелость мух сильно влияют на сон. Сон высок у однодневных мух и стабилизируется к 3-5 дням в возрасте4лет. Мухи обычно поддерживаются на 12-часовом свете: 12-часовой темный график при влажности 50%.

2. Подготовка трубок для записи сна

ПРИМЕЧАНИЕ: Сон контролируется с помощью мониторов двигательной активности. Монитор может вместить 32 мухи, размещенные индивидуально в трубках диаметром 5 мм. Обычно генотипы анализируются в группах по 16 или 32 мухи.

  1. Приготовьте соответствующее количество тюбиков с кормом для мух на одном конце.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Диета и метаболизм, как известно, влияют на сон33,34,поэтому особенно важно размещать мух на той же пище, на которой они были выращены.
  2. Запечатайте конец тюбиков воском.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лишение сна и отскок - это пятидневный эксперимент, и пища может высохнуть, если ее не правильно запечатать. В правильно запечатанные трубки пища может храниться в течение 10 дней и более. Таким образом, очень важно убедиться, что концы труб хорошо герметизированы. Однако мухи также могут прилипнуть к влажному корму. Таким образом, помогает сделать тюбики за 1-2 дня до начала эксперимента.
  3. Индивидуально поместите след, ведя себя мухами, в стеклянные трубки длиной 65 мм для записи сна с помощью аспиратора и заткните конец трубки пенной пробкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мухи никогда не подвергаются повторному воздействию анестезии CO2 при помещении мух в трубки для записи сна. Аспиратор изготовлен из резиновой трубки с одним концом, покрытым марлой и вставленным в наконечник пипетки 1 мл.

3. Запись сна

  1. Загрузка летит в трубках в мониторы активности для мониторинга сна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SNAP rocks контролирует взад и вперед от -60 ° до +60 ° каждые ~ 10 с. Мониторы удерживаются на -60° в течение ~5,9 с; требуется ~2,9 с, чтобы лоток, вмещающей мониторы, перешел от -60 ° к +60 ° и ~ 1 с, чтобы вернуться от +60 ° до -60 °. Продолжительность цикла может быть изменена по мере необходимости путем регулировки напряжения, подаваемого на двигатель.
    1. Позаботьтесь о том, чтобы трубки были размещены в мониторах активности в правильной ориентации. При правильной ориентации конец трубки с едой находится в верхней части SNAP, чтобы мухи не вдавливались в пищу. Кроме того, конец с едой находится сбоку от монитора с гнездом для записи сна. Это позволяет мониторам активности правильно ориентироваться в SNAP для эффективного лишения сна при одновременном мониторинге активности.
  2. Поместите мониторы активности в камеру записи для мониторинга сна.
  3. Контролируйте сон в течение как минимум двух полных дней, чтобы оценить базовый сон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: День, когда мухи загружаются в мониторы активности, обычно исключается как день адаптации, чтобы позволить мухам адаптироваться к размещению в трубах. Базовый сон регистрируется в течение как минимум двух полных дней (48 часов), начиная с утра, следующего за днем загрузки мух.
  4. Сохраняйте количество локомоторной активности мух в бункерах за 1 мин с момента освещения в данный день до огней в предыдущий день с помощью программного обеспечения для записи активности (например, с 8 утра до 8 утра).
  5. Оцените сон по данным о двигательной активности с помощью пользовательских макросов, используя 5 минут бездействия в качестве порога для приступа сна35.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ряд показателей сна вычисляется на очных счетах активности опорно-двигательного аппарата. К ним относятся сон в мин/ч в течение 24 ч, общее время сна в 24 ч, среднее и максимальное дневное и ночное время сна продолжительностью36.

4. Лишение сна и восстановление

  1. Поскольку мухи могут быть лишены сна в течение различных промежутков времени (например, 12 ч, 24 ч и 36 ч), а восстановительный сон также может быть оценен через различные промежутки времени (например, 6 ч, 12 ч, 24 ч и 48 ч), определить продолжительность восстановления по экспериментальной необходимости. Восстановление сна может быть визуализировано с помощью графика усиления/потери сна или путем изучения процента сна, восстановленного в течение заданного интервала (например, 6 ч).
  2. Если сон стабилен в течение двух базовых дней, на третий день поместите мониторы активности в SNAP для ночного лишения сна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мухи будут демонстрировать устойчивый отскок сна в диапазоне времени сна8,32,37,38,но сон должен быть стабильным, чтобы надежно оценить отскок сна. Сон стабилен, когда разница во сне между базовыми днями составляет ± 100 минут.
  3. Убедитесь, что мониторы активности закреплены на месте с помощью контактов держателя монитора, подключенных шнуров монитора и правильно ориентированных мониторов с концом с едой сзади и пластиковыми барьерами спереди(рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: SNAP спроектирован таким образом, что кулачок вращается один раз каждые 10 с(рисунок 1). Пластиковая вставка сбрасывает трубки, отталкивая трубки назад, когда аппарат находится в положении «вверх». Сброс трубок важен для обеспечения того, чтобы все трубки имели полный диапазон движения в начале каждого цикла.
  4. Отключите мониторы активности и выньте мониторы из SNAP сразу же после загорится света после ночного лишения сна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы лишение сна прекратилось, и мухи были помещены в восстановление сразу после включенного света после 12 ч ночного лишения сна. Даже 20-30-минутная задержка в помещении мух в восстановление может помешать степени отскока сна.
  5. Поместите мух в камеру записи, где они будут невозмутимы в течение двух дней (48 ч), чтобы контролировать восстановление сна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если записывающая камера используется для других экспериментов, необходимо проявлять особую осторожность, чтобы избежать стимуляции выздоравливающих мух.
  6. Рассчитайте количество потерянного сна. Для каждой отдельной мухи рассчитайте почасовую разницу между сном, полученным во время лишения сна, и соответствующим часом во время исходного уровня; суммируйте почасовые разницы, чтобы рассчитать общую потерю сна.
  7. Рассчитайте количество восстановленного сна. Для каждой отдельной мухи рассчитать почасовую разницу между сном, полученным во время восстановления, и соответствующим часом во время исходного уровня; суммируйте почасовые различия, чтобы рассчитать общее количество сна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вопрос о том, действительно ли муха лишена сна, является эмпирическим. Таким образом, экспериментатор должен изучить процент потери сна. Если муха не потеряла достаточное количество сна, ее можно исключить из анализа. Хотя это может потребоваться для других подходов к лишению сна, это редко, если вообще когда-либо требуется для SNAP. Чаще всего сон может быть неустойчивым у данной мухи до начала лишения сна. Если сон не стабилен, гомеостаз не может быть рассчитан. Мы принимаем максимальную разницу ± 100 минут сна, рассчитанную до начала лишения сна в качестве кандидатов на включение. Иногда сон отдельной мухи распределяется неравномерно в течение 24-часовых дней (например, некоторые люди могут получить 60-70% своей квоты сна в течение дня и, таким образом, потерять только небольшую часть своей 24-х ч квоты сна при лишении в течение 12 ч ночью). Этих мух можно оценить отдельно.
  8. Рассчитайте средний процент восстановленного сна (относительно исходного уровня) за 12 ч, 24 ч и 48 ч восстановительного периода для каждого генотипа.
  9. На основе данных о сне вычислите среднюю и максимальную продолжительность дневного сна на исходном уровне и дни восстановления для каждого генотипа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отскок сна у мух характеризуется увеличением количества сна и увеличением глубины сна в дни восстановления. Консолидация сна используется в качестве меры глубины сна. Пороги возбуждения также могут быть использованы в качестве меры глубины сна.

Результаты

Кантон S (Cs) использовался как штамм дикого типа. Мухи поддерживались на 12-часовом освещении: 12-часовой темный график, и лишенные сна в течение 12 часов ночью. Проверка профилей сна мух Cs в базовый день (bs), день лишения сна (sd) и два дня восстановления (rec1 и rec2)(рис...

Обсуждение

Сон у дрозофилы был независимо охарактеризован в 2000 году двумягруппами4,5. В этих новаторских исследованиях мухи были лишены сна из-за мягкого обращения (то есть лишения рук) и показали, что они демонстрируют надежную гомеостатическую реакцию на ночн...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами NIH 5R01NS051305-14 и 5R01NS076980-08 для PJS.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Locomotor activity tubes
Fisher Tissue Prep WaxThermo Fisher13404-122Wax used for sealing tubes
Glass tubesWale Apparatus244050We cut 5mm diameter Pyrex glass tubes into 65mm long tubes to record sleep. Pre-cut tubes can also be purchased.
Nutri Fly Bloomington Formulation fly foodGenesee Scientific66-113Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in.
Rotary glass cutting toolDremel Multi Pro395Used to cut 65mm long glass tubes 
Monitoring Sleep
DAM System and DAMFileScan softwareTrikineticsSoftware used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format
Data acquisition computerLenovoIdea Centre AIO3A equivalent computer from any manufacturer can substitute
Drosophila Activity MonitorsTrikineticsDAM2These monitors are used to record flies' locomotor activity
Environment MonitorTrikineticsDEnMNot essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded
Light ControllerTrikineticsLC4A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off
Power Supply Interface Unit for DAMTrikineticsPSIU-9Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data
RJ11 connector7001-64PCMulticompDAM monitors accept RJ11 jacks
SplittersTrikineticsSPLT5Used to connect upto 5 DAM monitors
Telephone cable wireRadioshack278-367Phone cables to acquire data from DAM monitors
Sleep Deprivation
Power supplyGw INSTEKGPS-30300Power supply for the SNAP
Sleep Nullifying ApparatusWashington University School of Medicine machine shop

Ссылки

  1. Nath, R. D., et al. The Jellyfish Cassiopea Exhibits a Sleep-like State. Current Biology. 27 (19), 2984-2990 (2017).
  2. Vorster, A. P., Krishnan, H. C., Cirelli, C., Lyons, L. C. Characterization of sleep in Aplysia californica. Sleep. 37 (9), 1453-1463 (2014).
  3. Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
  4. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  5. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  6. Ganguly-Fitzgerald, I., Donlea, J., Shaw, P. J. Waking experience affects sleep need in Drosophila. Science. 313 (5794), 1775-1781 (2006).
  7. Seugnet, L., Suzuki, Y., Vine, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. D1 receptor activation in the mushroom bodies rescues sleep-loss-induced learning impairments in Drosophila. Current Biology. 18 (15), 1110-1117 (2008).
  8. Donlea, J. M., Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Inducing sleep by remote control facilitates memory consolidation in Drosophila. Science. 332 (6037), 1571-1576 (2011).
  9. Seidner, G., et al. Identification of Neurons with a Privileged Role in Sleep Homeostasis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 25 (22), 2928-2938 (2015).
  10. Li, X., Yu, F., Guo, A. Sleep deprivation specifically impairs short-term olfactory memory in Drosophila. Sleep. 32 (11), 1417-1424 (2009).
  11. Melnattur, K., et al. A conserved role for sleep in supporting Spatial Learning in Drosophila. Sleep. , 197 (2020).
  12. Seugnet, L., Suzuki, Y., Donlea, J. M., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Sleep deprivation during early-adult development results in long-lasting learning deficits in adult Drosophila. Sleep. 34 (2), 137-146 (2011).
  13. Donlea, J. M., Ramanan, N., Shaw, P. J. Use-dependent plasticity in clock neurons regulates sleep need in Drosophila. Science. 324 (5923), 105-108 (2009).
  14. Bushey, D., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep and synaptic homeostasis: structural evidence in Drosophila. Science. 332 (6037), 1576-1581 (2011).
  15. Huang, S., Piao, C., Beuschel, C. B., Götz, T., Sigrist, S. J. Presynaptic Active Zone Plasticity Encodes Sleep Need in Drosophila. Current Biology. 30 (6), 1077-1091 (2020).
  16. Kirszenblat, L., et al. Sleep regulates visual selective attention in Drosophila. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
  17. Singh, P., Donlea, J. M. Bidirectional Regulation of Sleep and Synapse Pruning after Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1063-1076 (2020).
  18. Stanhope, B. A., Jaggard, J. B., Gratton, M., Brown, E. B., Keene, A. C. Sleep Regulates Glial Plasticity and Expression of the Engulfment Receptor Draper Following Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1092-1101 (2020).
  19. Kayser, M. S., Yue, Z., Sehgal, A. A critical period of sleep for development of courtship circuitry and behavior in Drosophila. Science. 344 (6181), 269-274 (2014).
  20. Kayser, M. S., Mainwaring, B., Yue, Z., Sehgal, A. Sleep deprivation suppresses aggression in Drosophila. Elife. 4, 07643 (2015).
  21. Szuperak, M., et al. A sleep state in Drosophila larvae required for neural stem cell proliferation. Elife. 7, (2018).
  22. Vaccaro, A., et al. Sleep Loss Can Cause Death through Accumulation of Reactive Oxygen Species in the Gut. Cell. 181 (6), 1307-1328 (2020).
  23. Kempf, A., Song, S. M., Talbot, C. B., Miesenböck, G. A potassium channel β-subunit couples mitochondrial electron transport to sleep. Nature. 568 (7751), 230-234 (2019).
  24. Donlea, J. M., Pimentel, D., Miesenböck, G. Neuronal machinery of sleep homeostasis in Drosophila. Neuron. 81 (4), 860-872 (2014).
  25. Liu, S., Liu, Q., Tabuchi, M., Wu, M. N. Sleep Drive Is Encoded by Neural Plastic Changes in a Dedicated Circuit. Cell. 165 (6), 1347-1360 (2016).
  26. Pimentel, D., et al. Operation of a homeostatic sleep switch. Nature. 536 (7616), 333-337 (2016).
  27. Sitaraman, D., et al. Propagation of Homeostatic Sleep Signals by Segregated Synaptic Microcircuits of the Drosophila Mushroom Body. Current Biology. 25 (22), 2915-2927 (2015).
  28. Foltenyi, K., Greenspan, R. J., Newport, J. W. Activation of EGFR and ERK by rhomboid signaling regulates the consolidation and maintenance of sleep in Drosophila. Nature Neuroscience. 10 (9), 1160-1167 (2007).
  29. Seugnet, L., et al. Notch signaling modulates sleep homeostasis and learning after sleep deprivation in Drosophila. Current Biology. 21 (10), 835-840 (2011).
  30. Seugnet, L., Galvin, J. E., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Persistent short-term memory defects following sleep deprivation in a Drosophila model of Parkinson disease. Sleep. 32 (8), 984-992 (2009).
  31. Tabuchi, M., et al. Sleep interacts with aβ to modulate intrinsic neuronal excitability. Current Biology. 25 (6), 702-712 (2015).
  32. Melnattur, K., Zhang, B., Shaw, P. J. Disrupting flight increases sleep and identifies a novel sleep-promoting pathway in Drosophila. Science Advances. 6 (19), 2166 (2020).
  33. Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Seugnet, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. The perilipin homologue, lipid storage droplet 2, regulates sleep homeostasis and prevents learning impairments following sleep loss. PLOS Biology. 8 (8), (2010).
  34. Keene, A. C., et al. Clock and cycle limit starvation-induced sleep loss in Drosophila. Current Biology. 20 (13), 1209-1215 (2010).
  35. Shaw, P. J., Tononi, G., Greenspan, R. J., Robinson, D. F. Stress response genes protect against lethal effects of sleep deprivation in Drosophila. Nature. 417 (6886), 287-291 (2002).
  36. Andretic, R., Shaw, P. J. Essentials of sleep recordings in Drosophila: moving beyond sleep time. Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).
  37. Seugnet, L., et al. Identifying sleep regulatory genes using a Drosophila model of insomnia. Journal of Neuroscience. 29 (22), 7148-7157 (2009).
  38. Bushey, D., Huber, R., Tononi, G., Cirelli, C. Drosophila Hyperkinetic mutants have reduced sleep and impaired memory. Journal of Neuroscience. 27 (20), 5384-5393 (2007).
  39. Geissmann, Q., et al. Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics. PLOS Biology. 15 (10), 2003026 (2017).
  40. Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila. Scientific Reports. 5, 8454 (2015).
  41. Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27 (4), 628-639 (2004).
  42. Klose, M., Shaw, P. Sleep-drive reprograms clock neuronal identity through CREB-binding protein induced PDFR expression. bioRxiv. , (2019).
  43. Dissel, S., et al. Sleep restores behavioral plasticity to Drosophila mutants. Current Biology. 25 (10), 1270-1281 (2015).
  44. Gerstner, J. R., Vanderheyden, W. M., Shaw, P. J., Landry, C. F., Yin, J. C. Fatty-acid binding proteins modulate sleep and enhance long-term memory consolidation in Drosophila. PLoS One. 6 (1), 15890 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

166

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены