Der Schlaf-Nullifizierungsapparat: Eine hocheffiziente Methode zur Schlafentzugs-Drosophila

Zusammenfassung

Schlafentzug ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Schlaffunktion und -regulierung zu untersuchen. Wir beschreiben ein Protokoll, um Drosophila mit dem Schlafnullierungsapparat zu schlafen und das Ausmaß des durch Entzug induzierten Rebound-Schlafes zu bestimmen.

Zusammenfassung

Die Schlaföostase, die Zunahme des Schlafes, die nach Schlafverlust beobachtet wird, ist eines der definierenden Kriterien, um den Schlaf im gesamten Tierreich zu identifizieren. Infolgedessen sind Schlafentzug und Schlafeinschränkung leistungsstarke Werkzeuge, die häufig verwendet werden, um Einblicke in die Schlaffunktion zu geben. Nichtsdestotrotz sind Schlafentzugsexperimente von Natur aus problematisch, da der Entzugsreiz selbst die Ursache für beobachtete Veränderungen in Physiologie und Verhalten sein kann. Dementsprechend sollten erfolgreiche Schlafentzugstechniken die Tiere wach halten und im Idealfall zu einem robusten Schlafrebound führen, ohne auch eine Vielzahl unbeabsichtigter Folgen zu verursachen. Hier beschreiben wir eine Schlafentzugstechnik für Drosophila melanogaster. Der Sleep Nullifying Apparatus (SNAP) verabreicht alle 10er Jahre einen Stimulus, um negative Geotaxis zu induzieren. Obwohl der Reiz vorhersehbar ist, verhindert der SNAP effektiv >95% des Nachtschlafs auch bei Fliegen mit hohem Schlafantrieb. Wichtig ist, dass die nachfolgende homöostatische Reaktion der durch Handentzug erreichten sehr ähnlich ist. Das Timing und der Abstand der Reize können modifiziert werden, um den Schlafverlust zu minimieren und somit unspezifische Auswirkungen des Reizes auf Physiologie und Verhalten zu untersuchen. Der SNAP kann auch zur Schlafeinschränkung und zur Beurteilung von Erregungsschwellen eingesetzt werden. Der SNAP ist eine leistungsstarke Schlafunterbrechungstechnik, mit der die Schlaffunktion besser verstanden werden kann.

Einleitung

Schlaf ist bei Tieren nahezu universell, aber seine Funktion bleibt unklar. Schlaföostase, die kompensatorische Zunahme des Schlafes nach Schlafentzug, ist eine definierende Eigenschaft des Schlafes, die verwendet wurde, um Schlafzustände bei einer Reihe von Tieren^1,2,3,4,5zu charakterisieren .

Schlaf in der Fliege hat viele Ähnlichkeiten mit dem menschlichen Schlaf, einschließlich einer robusten homöostatischen Reaktion auf Schlafverlust^4,5. Zahlreiche Studien über schlaf in der Fliege haben Schlafentzug verwendet, um sowohl die Schlaffunktion abzuleiten, indem die nachteiligen Folgen eines längeren Aufwachens untersucht werden, als auch um die Schlafregulation zu verstehen, indem die neurobiologischen Mechanismen bestimmt werden, die die homöostatische Regulierung des Schlafes steuern. So wurde gezeigt, dass schlaflose Fliegen Beeinträchtigungen im Lern- und Gedächtnis aufweisen^{6,7,8,9,10,11,12}, strukturelle Plastizität^13,14,15, visuelle Aufmerksamkeit¹⁶, Erholung von neuronalen Verletzungen^17,18, Paarung und aggressives Verhalten^{19, 20}, Zellproliferation²¹und Reaktionen auf oxidativen Stress^22,23, um nur einige zu nennen. Darüber hinaus haben Untersuchungen der neurobiologischen Mechanismen, die den Rebound-Schlaf steuern, kritische Einblicke in die neuronale Maschinerie geliefert, die den Schlaf-Homöostaten^{8,9,23,24,25,26,27,28},^{29 bildet.} . Schließlich haben Studien zur Schlafentzug nicht nur grundlegende Einblicke in die Schlaffunktion bei gesunden Tieren, sondern auch Erkenntnisse über die Schlaffunktion in erkrankten Zuständen^30,31.

Während Schlafentzug unbestreitbar ein mächtiges Werkzeug ist, ist es bei jedem Schlafentzugsexperiment wichtig, Phänotypen, die aus längerem Aufwachen resultieren, von denen zu unterscheiden, die durch den Reiz induziert werden, der verwendet wird, um das Tier wach zu halten. Schlafentzug durch Händeentzug oder sanfte Handhabung gilt allgemein als Standard für minimal störenden Schlafentzug. Hier beschreiben wir ein Protokoll für schlafentziehende Fliegen mit dem Sleep Nullifying Apparatus (SNAP). Das SNAP ist ein Gerät, das alle 10Er Jahre einen mechanischen Reiz an Fliegen liefert und Fliegen wach hält, indem es negative Geotaxis induziert (Abbildung 1). Der SNAP entzieht Fliegen effizient >98% des Nachtschlafs, auch bei Fliegen mit hohem Schlafantrieb^8,32. Der SNAP wurde auf knallempfindliche Fliegen kalibriert, das Rühren von Fliegen im SNAP schadet den Fliegen nicht; Schlafentzug mit dem SNAP induziert einen Rebound, der mit dem durch Handentzug⁷vergleichbar ist. Der SNAP ist somit eine robuste Methode, um Fliegen zu schlafentziehen und gleichzeitig die Wirkung des erregenden Reizes zu kontrollieren.

Protokoll

1. Experimentelle Vorbereitung

1. Sammeln Sie Fliegen, während sie sich in Fläschchen verwandeln und männliche und weibliche Fliegen trennen.
   HINWEIS: Schlafexperimente werden häufig mit weiblichen Fliegen durchgeführt. Es ist wichtig, jungfräuliche Weibchen zu sammeln. Gepaarte Weibchen legen Eier, die zu Larven schlüpfen, was die Analyse der Daten erschwert.
2. Hausfliegen eines geschlechts geschlechts in Gruppen von <20.
   HINWEIS: Die Unterbringung von Fliegen in einer sozial angereicherten Umgebung (Gruppen von >50) moduliert den Schlafantrieb^6,13 potenziell verwirrende Messungen des Rebound-Schlafes. Darüber hinaus wird der Schlaf nach sozialer Bereicherung über einige Tage abnehmen⁶. Daher ist der Ausgangsschlaf nicht stabil, was die Analyse des Rebound-Schlafes erschwert. Das Halten von Fliegen in Gruppen von <20 vermeidet dieses potenzielle Verwechslung.
3. Halten Sie Fliegen in Fläschchen für 3-5 Tage in einer licht- und feuchtigkeitskontrollierten Umgebung.
   HINWEIS: Alter und Reife von Fliegen beeinflussen den Schlaf stark. Der Schlaf ist bei einem Tag alten Fliegen hoch und stabilisiert sich um 3-5 Tage im Alter von^{4 Jahren.} Fliegen werden typischerweise auf einem 12 h hellen: 12 h dunklen Zeitplan bei 50% Luftfeuchtigkeit gehalten.

2. Vorbereitung von Schläuchen für die Schlafaufzeichnung

HINWEIS: Der Schlaf wird mit Bewegungsaktivitätsmonitoren überwacht. Ein Monitor kann 32 Fliegen aufnehmen, die einzeln in Rohren mit einem Durchmesser von 5 mm untergebracht sind. Typischerweise werden Genotypen in Gruppen von 16 oder 32 Fliegen analysiert.

1. Bereiten Sie eine angemessene Anzahl von Röhrchen mit Fliegenfutter an einem Ende vor.
   HINWEIS: Es ist bekannt, dass Ernährung und Stoffwechsel den Schlaf beeinflussen^33,34, daher ist es besonders wichtig, Fliegen auf die gleiche Nahrung zu legen, auf der sie aufgezogen wurden.
2. Versiegeln Sie das Ende der Röhrchen mit Wachs.
   HINWEIS: Schlafentzug und Rebound ist ein fünftägiges Experiment, und Lebensmittel können austrocknen, wenn sie nicht richtig versiegelt sind. In ordnungsgemäß verschlossenen Röhrchen können Lebensmittel 10 Tage oder mehr gehalten werden. Daher ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Enden der Rohre gut abgedichtet sind. Fliegen können jedoch auch an Nassfutter hängen bleiben. So hilft es, Röhren 1-2 Tage vor Beginn des Experiments herzustellen.
3. Wake, Behaving Fliegen einzeln in 65 mm lange Glasröhren zur Schlafaufzeichnung mit einem Absauger legen und das Ende der Schläuche mit einem Schaumstoffstopper verstopfen.
   HINWEIS: Fliegen werden niemals wieder einer CO_{2-Anästhesie} ausgesetzt, wenn Fliegen zur Schlafaufzeichnung in Schläuche gelegt werden. Der Absauger besteht aus Gummischläuchen, wobei ein Ende mit einem Käsetuch bedeckt und in eine 1 mL Pipettenspitze eingeführt wird.

3. Schlaf aufzeichnen

1. Load fliegt in Röhren in Aktivitätsmonitore, um den Schlaf zu überwachen.
   HINWEIS: Die SNAP-Felsen überwachen alle ~10 s von -60° bis +60° hin und her. Die Monitore werden bei -60° für ~5,9s gehalten; Es dauert ~2,9 s, bis sich das Fach, in dem die Monitore gehalten werden, von -60° auf +60° bewegt und ~1 s, um sich von +60° auf -60° zurückzubewegen. Die Zykluslänge kann nach Bedarf durch Anpassung der dem Motor zugeführten Spannung geändert werden.
   1. Achten Sie darauf, dass die Röhren in der richtigen Ausrichtung in Aktivitätsmonitoren platziert werden. In der richtigen Ausrichtung befindet sich das Ende der Röhre mit Nahrung an der Oberseite des SNAP, um sicherzustellen, dass Fliegen nicht in die Nahrung gedrückt werden. Darüber hinaus befindet sich das Ende mit Essen an der Seite des Monitors mit der Schlafaufzeichnungsbuchse. Auf diese Weise können Aktivitätsmonitore im SNAP für einen effizienten Schlafentzug richtig ausgerichtet werden und gleichzeitig die Aktivität überwacht werden.
2. Platzieren Sie Aktivitätsmonitore in der Aufzeichnungskammer, um den Schlaf zu überwachen.
3. Überwachen Sie den Schlaf für mindestens zwei volle Tage, um den Ausgangsschlaf abzuschätzen.
   HINWEIS: Der Tag, an dem Fliegen in Aktivitätsmonitore geladen werden, ist in der Regel als Anpassungstag ausgeschlossen, damit sich die Fliegen an die Unterbringung in Röhren anpassen können. Der Ausgangsschlaf wird für mindestens zwei volle Tage (48 Stunden) aufgezeichnet, beginnend mit dem Morgen nach dem Tag, an dem fliegen geladen werden.
4. Speichern Sie die Anzahl der Bewegungsaktivität von Fliegen in 1-Minuten-Behältern von der Zeit der Lichter an einem bestimmten Tag bis zur Beleuchtung am Vortag mit einer Aktivitätsaufzeichnungssoftware (z. B. von 8 Uhr morgens bis 8 Uhr morgens).
5. Schätzen Sie den Schlaf aus den Bewegungsaktivitätsdaten mit benutzerdefinierten Makros unter Verwendung von 5 Minuten Inaktivität als Schwellenwert für einen Schlafanfall³⁵.
   HINWEIS: Aus den Zählungen der Bewegungsaktivität werden eine Reihe von Schlafmetriken berechnet. Dazu gehören Schlaf in min / h über 24 h, Gesamtschlafzeit in 24 h, durchschnittliche und maximale Tages- und Nachtschlaflängen³⁶.

4. Schlafentzug und Erholung

1. Da Fliegen für variable Zeiträume (z. B. 12 h, 24 h und 36 h) schlaflos werden können und der Erholungsschlaf auch in verschiedenen Intervallen (z. B. 6 h, 12 h, 24 h und 48 h) bewertet werden kann, bestimmen Sie die Dauer der Genesung durch experimentellen Bedarf. Die Schlaferholung kann mit einem Schlafgewinn-/-verlust-Diagramm oder durch Untersuchung des prozentualen Schlafes, der über ein vorgegebenes Intervall (z. B. 6 Stunden) wiederhergestellt wurde, visualisiert werden.
2. Wenn der Schlaf an den beiden Basistagen stabil ist, platzieren Sie am dritten Tag Aktivitätsmonitore für Schlafentzug über Nacht im SNAP.
   HINWEIS: Fliegen zeigen einen robusten Schlaf-Rebound über einen Bereich von Schlafzeiten^8,32,37,38, aber der Schlaf muss stabil sein, um den Rebound-Schlaf zuverlässig zu bewerten. Der Schlaf ist stabil, wenn der Schlafunterschied zwischen den Basistagen ± 100 Minuten beträgt.
3. Stellen Sie sicher, dass Aktivitätsmonitore mit Monitorhalterstiften, eingesteckten Monitorkabeln und korrekt ausgerichteten Monitoren mit dem Ende mit Lebensmitteln auf der Rückseite und Kunststoffbarrieren vorne gesichert sind (Abbildung 1).
   HINWEIS: Der SNAP ist so konzipiert, dass sich der Nocken alle 10 s dreht (Abbildung 1). Der Kunststoffeinsatz setzt die Schläuche zurück, indem er die Schläuche zurückdrückt, wenn sich das Gerät in der Position "oben" befindet. Das Zurücksetzen der Rohre ist wichtig, um sicherzustellen, dass alle Rohre zu Beginn jedes Zyklus den vollen Bewegungsumfang haben.
4. Trennen Sie die Aktivitätsmonitore und nehmen Sie die Monitore sofort aus dem SNAP, sobald die Lichter nach schlafentzug über Nacht eingeschaltet sind.
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass der Schlafentzug beendet wird und die Fliegen sofort nach 12 Stunden Schlafentzug über Nacht in die Genesung versetzt werden. Selbst eine Verzögerung von 20-30 Minuten beim Einsetzen von Fliegen in die Genesung kann das Ausmaß des Rebound-Schlafes beeinträchtigen.
5. Legen Sie Fliegen in eine Aufnahmekammer, wo sie zwei Tage (48 h) ungestört sind, um den Erholungsschlaf zu überwachen.
   HINWEIS: Wenn die Aufnahmekammer für andere Experimente verwendet wird, muss besonders darauf geachtet werden, dass sich die Fliegen nicht stimulieren.
6. Berechnen Sie die Menge des verlorenen Schlafes. Berechnen Sie für jede einzelne Fliege die stündliche Differenz zwischen dem Schlaf, der während des Schlafentzugs erhalten wird, und der entsprechenden Stunde während des Ausgangswerts. Summieren Sie die stündlichen Differenzen, um den gesamten verlorenen Schlaf zu berechnen.
7. Berechnen Sie die Menge des wiederhergestellten Schlafes. Berechnen Sie für jede einzelne Fliege die stündliche Differenz zwischen dem Schlaf, der während der Erholung erhalten wird, und der entsprechenden Stunde während des Ausgangswerts. Summieren Sie die stündlich gewonnenen Differenzen, um den gesamten Schlaf zu berechnen.
   HINWEIS: Ob eine Fliege tatsächlich unter Schlafentzug liegt, ist empirisch. Daher sollte der Experimentator den prozentualen Schlafverlust untersuchen. Wenn die Fliege nicht genügend Schlaf verloren hat, kann sie von der Analyse ausgeschlossen werden. Obwohl dies für andere Schlafentzugsansätze erforderlich sein kann, ist es selten, wenn überhaupt, für den SNAP erforderlich. Häufiger kann der Schlaf in einer bestimmten Fliege vor Beginn des Schlafentzugs nicht stabil sein. Wenn der Schlaf nicht stabil ist, kann die Homöostase nicht berechnet werden. Wir akzeptieren eine maximale Differenz von ± 100 Minuten Schlaf, die vor Beginn des Schlafentzugs berechnet wurde, als Kandidaten für die Aufnahme. Gelegentlich ist der Schlaf einer einzelnen Fliege ungleichmäßig über den 24-Stunden-Tag verteilt (z. B. können einige Personen 60-70% ihrer Schlafquote während des Tages erhalten und somit nur einen kleinen Teil ihrer 24-Stunden-Schlafquote verlieren, wenn sie nachts 12 Stunden lang entzogen werden). Diese Fliegen können separat bewertet werden.
8. Berechnen Sie den durchschnittlichen Prozentsatz des Schlafes (relativ zum Ausgangswert) über 12 h, 24 h und 48 h der Erholungsphase für jeden Genotyp.
9. Berechnen Sie anhand von Schlafdaten die durchschnittliche und maximale Tagesschlafdauer auf der Basislinie und die Erholungstage für jeden Genotyp.
   HINWEIS: Rebound-Schlaf bei Fliegen ist durch erhöhte Schlafmenge und erhöhte Schlaftiefe in den Erholungstagen gekennzeichnet. Die Schlafkonsolidierung wird als Maß für die Schlaftiefe verwendet. Erregungsschwellen könnten auch als Maß für die Schlaftiefe verwendet werden.

Ergebnisse

Canton S (Cs) wurde als Wildtyp-Stamm verwendet. Fliegen wurden auf einem 12 h hellen: 12 h dunklen Zeitplan gehalten und Schlaf für 12 Stunden über Nacht entzogen. Die Untersuchung der Schlafprofile von Cs-Fliegen am Basistag (bs), am Schlafentzugstag (sd) und an zwei Erholungstagen (rec1 und rec2)(Abbildung 2A)legt nahe, dass Fliegen im SNAP effektiv Schlaf entzogen wurden und der Schlaf während des Tages im Einklang mit den beobachteten Berichten in der...

Diskussion

Schlaf in Drosophila wurde unabhängig voneinander im Jahr 2000 durch zwei Gruppen^4,5charakterisiert. In diesen bahnbrechenden Studien wurde Fliegen durch sanfte Handhabung (d.h. Händeentzug) des Schlafes beraubt und gezeigt, dass sie eine robuste homöostatische Reaktion auf Schlafentzug über Nacht zeigen. Wichtig ist, dass es bei jedem Schlafentzugsexperiment entscheidend ist, mögliche verwirrende Auswirkungen der Methode zu kontrollieren, mit der d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Locomotor activity tubes
Fisher Tissue Prep Wax	Thermo Fisher	13404-122	Wax used for sealing tubes
Glass tubes	Wale Apparatus	244050	We cut 5mm diameter Pyrex glass tubes into 65mm long tubes to record sleep. Pre-cut tubes can also be purchased.
Nutri Fly Bloomington Formulation fly food	Genesee Scientific	66-113	Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in.
Rotary glass cutting tool	Dremel Multi Pro	395	Used to cut 65mm long glass tubes
Monitoring Sleep
DAM System and DAMFileScan software	Trikinetics		Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format
Data acquisition computer	Lenovo	Idea Centre AIO3	A equivalent computer from any manufacturer can substitute
Drosophila Activity Monitors	Trikinetics	DAM2	These monitors are used to record flies' locomotor activity
Environment Monitor	Trikinetics	DEnM	Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded
Light Controller	Trikinetics	LC4	A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off
Power Supply Interface Unit for DAM	Trikinetics	PSIU-9	Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data
RJ11 connector	7001-64PC	Multicomp	DAM monitors accept RJ11 jacks
Splitters	Trikinetics	SPLT5	Used to connect upto 5 DAM monitors
Telephone cable wire	Radioshack	278-367	Phone cables to acquire data from DAM monitors
Sleep Deprivation
Power supply	Gw INSTEK	GPS-30300	Power supply for the SNAP
Sleep Nullifying Apparatus	Washington University School of Medicine machine shop