カルシウム蛍光色素標識とナノ粒子追跡解析を用いたヒトの尿中ナノ結晶の推定

要約

本研究の目的は、ナノ粒子追跡解析(NTA)が健康な成人からのナノ結晶を含む尿中カルシウムを検出し、定量化できるかどうかを決定することであった。現在の研究結果は、NTAが腎臓結石疾患中の尿ナノ結晶を推定する潜在的なツールである可能性を示唆している。

要約

腎臓結石は、大人と子供の世界的に一般的になってきています。最も一般的なタイプの腎臓結石は、シュウ酸カルシウム(CaOx)結晶で構成されています。結晶尿は、尿がミネラル(例えば、カルシウム、シュウ酸塩、リン酸塩)で過飽和になると発生し、腎臓結石形成の前に起こる。石のフォーマーの結晶を評価する標準的な方法には、顕微鏡、ろ過、遠心分離が含まれます。しかし、これらの方法は、主にナノ結晶ではなく微小結晶を検出する。ナノ結晶は、インビトロの微結晶よりも腎臓上皮細胞に有害であることが示唆されている。ここでは、ナノ粒子追跡解析(NTA)がヒトの尿中ナノ結晶を検出する能力について述べる。健康な成人は、尿中ナノ結晶を刺激するためにシュウ酸塩負荷を飲む前に、制御されたシュウ酸食を与えられた。尿はシュウ酸負荷の前後に24時間採取した。試料を処理し、エタノールで洗浄し、試料を精製した。尿中ナノ結晶をカルシウム結合蛍光色素で染色し、フルオ-4 AM.染色後、ナノ結晶のサイズと数はNTAを用いて決定した。この研究結果から、NTAは健康な成人のナノ結晶を効率的に検出できることを示している。これらの知見は、NTAが腎臓結石症患者におけるナノ結晶の貴重な早期発見方法である可能性を示唆している。

概要

尿結晶は、尿がミネラルで過飽和になると形成されます。これは健康な個体で起こり得るが、^腎臓結石1を有する個人でより一般的である。尿結晶の存在と蓄積は、腎臓結石を発症するリスクを高めることができます。具体的には、これは、結晶がランドールのプラークに結合し、核を持ち、蓄積し^{、時間2、3、4}の間に成長するときに起こる。結晶は、腎臓結石の形成と結晶の評価に先行して、腎臓結石形成体^3,5に予測値を有する可能性がある。具体的には、結晶が石^6,7を含むシュウ酸カルシウムの既往歴を有する患者において石の再発のリスクを予測するのに有用であることが示唆されている。

結晶は、腎上皮および循環免疫細胞機能^{8、9、10、11、12、13}に悪影響を及ぼすと報告されている。シュウ酸カルシウム(CaOx)腎臓結石のフォーマーからの循環単球が、健康な個体¹⁴と比較して細胞バイオエネルギーを抑制していることが以前に報告されている。さらに、CaOx結晶は、細胞の生体エネルギーを減少させ、単球⁸におけるレドックス恒常性を破壊する。シュウ酸塩が豊富な食事の摂取は、腎尿細管損傷を引き起こし、腎臓結石形成に対して保護されている尿中高分子の産生および機能を変える可能性のある結晶尿素を引き起こす可能性がある^15,16。いくつかの研究は尿の結晶が尿のpHおよび温度に応じて形および大きさを変えることができることを実証した^17,18,19.また、尿タンパク質は結晶挙動²⁰を調節することが示されている。Daudon et al.¹⁹は、結晶管内分析が腎臓結石疾患患者の管理および治療に対する応答の評価に役立つ可能性があることを提案した。結晶の存在を評価するために現在利用可能ないくつかの従来の方法は、偏光顕微鏡^21、22、電子顕微鏡^23、粒子カウンター^3、尿濾過^24、蒸発^3、5または遠心分離²¹を含む。これらの研究は、結晶に関する腎臓結石分野に貴重な洞察を提供してきました。しかし、これらの方法の限界は、1μm未満の結晶のサイズを視覚化して定量できないことでした。このサイズの結晶は、ランドールのプラークに付着することにより、CaOx石の成長に影響を与える可能性があります。

ナノ結晶は、より大きな微結晶²⁵と比較して腎細胞に広範な傷害を引き起こすことが示されている。ナノ結晶の存在は、ナノ粒子分析装置^26,27を用いて尿中に報告されている。最近の研究では、蛍光標識ビスリン酸プローブ(アレンドロネート-フルオレセイン/アレンドロネート-Cy5)を用いてナノスケールフローサイトメトリー²⁸を用いてナノ結晶を調べる。この染料の制限は、それが特異的ではなく、システインを除く石のほとんどすべてのタイプに結合することです。したがって、個人におけるナノ結晶の存在を正確に評価することは、結晶を診断したり、石のリスクを予測したりするのに有効なツールとなり得る。本研究の目的は、ナノ粒子追跡解析(NTA)を用いて、ナノ結晶を含むカルシウム(<1μmの大きさ)を検出し、定量化することであった。これを達成するために、NTA技術をカルシウム結合フルオロフォア、Fluo-4 AMと組み合わせて使用し、健康な成人の尿中のナノ結晶を含むカルシウムを検出し定量しました。

プロトコル

この研究で概説されたすべての実験は、アラバマ大学バーミンガム校(UAB)制度審査委員会によって承認されました。健康な成人(33.6±3.3歳;n=10)は、正常な血液包括代謝パネル、非タバコユーザー、非妊娠者、20〜30kg/m²のBMI、および慢性病状または急性疾患がない場合、研究に登録された。健康な参加者は、研究開始前に書面によるインフォームド・コンセント・フォームに署名しました。

1. 臨床プロトコルと尿の収集

1. 参加者は、尿を採取する前に、UAB臨床・トランスレーショナルサイエンスバイオニュートリションコアが調製した低シュウ酸塩食を3日間、一晩で速く摂取してから、尿を採取します(24時間サンプル)。
2. 翌日、参加者はシュウ酸塩の負荷(果物や野菜を含むスムージー、約8mMのシュウ酸塩)を消費する前に、24時間尿サンプル(シュウ酸塩前)を返してもらいます。参加者はその後、24時間尿を収集し(シュウ酸後サンプル)、翌日に尿を返します。
3. 以下に示すように、すべての尿サンプルを室温(RT)で処理する前に維持し 、図1に示す。

2. 尿処理

注: 使用される材料と機器はすべて、 一覧の一覧を参照してください。
注意:臨床サンプルおよび試薬を扱っている間、常に個人的な保護具を着用してください。具体的には、手袋、顔と目の盾、呼吸保護、および防護服。

1. 尿のpHと容積を測定し、記録する。50 mLの尿をラベル付きの無菌50 mL円錐管に加える前に十分に混合します。
2. ベンチトップ遠心分離機を使用してRTで10分間1200 x g で遠心分離機サンプル。
   注:より涼しい温度が結晶化を促進することができるので、さらなる結晶形成を防ぐためにRTでサンプルを保ちます。
3. 上清を捨てて、100%エタノールの5 mLで再度ペレットを洗浄し、再懸濁します。ベンチトップ遠心分離機を使用してRTで1200 x g で10分間サンプルを遠心分離します。
4. 上清を捨て、1mLの100%エタノールでペレットを再懸濁します。後で処理または後述のようにサンプルを染色するために-20°Cでサンプルを保管してください。
   注: 保存されたサンプルと新しく染色されたサンプルの間にデータポイント(粒子サイズ/濃度)に大きな差はありません。

3. ナノ粒子追跡解析(NTA)

1. サンプル準備
   1. 金ナノ粒子: 金ナノ粒子を使用して、機器の設定を最適化します。100 nmサイズの金ナノ粒子を超純水で1:1000希釈。
   2. ヒト尿:水中で尿サンプルを20回希釈してから、5 mM Fluo-4 AM(カルシウム蛍光色素)を暗で30分間染色します。NTA を使用してサンプルを分析します。
   3. 前述の²⁹のように、カルシウムオキサレート(CaOx)結晶を調製する。水で10 mMストック溶液(水10mLで14.6mg)を50μMに希釈し、分析前に暗い状態で30分間5 mM Fluo-4 AMを使用して希釈サンプルを染色します。
   4. リン酸カルシウム(CaP)結晶:10mMストック溶液(水10mLで50.4mg)を水中で50μM希釈し、5 mM Fluo-4 AMを使用して希釈したサンプルを30分間暗い状態で染色してからNTA分析を行います。
2. 計器のセットアップ、カメラ設定、データ収集
   メモ: この方法で使用するコンピュータと計測器のセットアップは 、図 2に示されています。
   1. コンピュータの電源を入れ、次に機器の電源を入れます。ソフトウェアを開き、カメラの電源を入れます。
   2. ソフトウェアウィンドウが開いたら、ウィンドウの左上隅にあるキャプチャアイコンをクリックして、キャプチャモードを開始します。カメラの初期化には数秒かかります。
   3. プラットフォームがきれいに見えるまで、最初に1 mLのシリンジを使用して空気をポンプで送り込み、プラットフォームを清掃します。別の1 mLシリンジを使用して装置に水を2~3回静かに加え、気泡を取り除きます。
      注:プラットフォームとチューブ内の気泡を探してください。サンプルの実行前および実行中に装置全体に気泡を持たないようにすることが重要です。気泡が存在する場合は、空気と水でプラットフォームを再度清掃してください。
   4. プラットフォームがきれいになったら、水を加えることで、カメラを見て表面に汚染がないか確認します。次に、サンプルローディングポンプインジェクタにコントロールとして金ナノ粒子を追加し、機器をセットアップします。
   5. 画像が色付きピクセルを表示し始めるまで、画面上またはノブのカメラレベルをインストゥルメントの右側に調整し、カメラレベルを下げます。
   6. 次に、画面を調整して画像を最適化します。ビデオ画像上でマウスボタンを左クリックします。マウスの左ボタンを押したまま、画像を上下にドラッグして、ビュー全体を表示します。
      注: 通常のカメラレンズとフィルターは、金ナノ粒子と染色されていないサンプルを評価するために使用されます。
   7. 注入速度を設定し、カメラの画面に金ナノ粒子が表示されるようにカメラをフォーカスします。初期設定の場合、金ナノ粒子が検出されるように、注入速度を高(500 μL/min)に設定します。検出後、速度を50 μL/minに下げます。
   8. カメラレベルを調整してパーティクルを視覚化します。染色されていないサンプルの場合は、レベル 5 で画面のゲインを調整してカメラのフォーカスを得て、カメラレベルを 8 に設定します。フォーカスが設定されたら、サンプルを記録します(つまり、1回の測定を60秒間のみ)。
      注: フォーカスと連続流速は、カウント用のパーティクルの鮮明で鮮明な画像を得るために重要です。
   9. 最適化後、サンプルを評価する前に、再度水で洗浄してください。カメラを表示して、チューブがクリーンでパーティクルが存在しないことを確認します。
      メモ:カメラでパーティクルが検出されないまで、各サンプルの間のチャンバーを洗います。
   10. 染色サンプルを分析するには、カメラを適切な蛍光フィルターを含むフィルター位置に調整します。希釈したサンプルをサンプルローディングポンプインジェクタにロードし、サンプルの分析のために速度を20 μL/minに下げます。
   11. 次に、画面のゲインとカメラレベルを調整します。染色(蛍光)サンプルの場合は、画面ゲインを5に、カメラレベルをレベル13に設定します。
       注: これらのパラメータはサンプルタイプによって異なり、すべてのサンプルを最適化してフォーカスを得る必要があります。
   12. 標準測定を使用して、1つのキャプチャ期間が60秒間であるサンプルあたり5つのキャプチャのサンプルを測定します。
   13. 各測定後にデータを保存して保存します。ソフトウェアは、各測定のための画像とビデオファイルを保存します。ソフトウェアは、出力データ(例えば、結晶サイズ:10 nM - 1000 nMと濃度)をExcelとpdf形式の両方で提供します。
   14. 個々のサンプルの 5 つの測定値すべてについて、ナノ粒子の平均数を計算します。平均の標準偏差または標準偏差を使用してデータを分析し、ペア分析にt検定を使用します。

結果

この研究結果から、NTAはヒト尿中の尿中のナノ結晶を含むカルシウムの平均サイズと濃度を効率的に検出できることを示している。これは、フルオロフォア、フルオ4 AM、ナノ粒子追跡解析を用いて達成した。Fluo-4 AMはCaOxとCaPの両方の結晶に結合することができた。図3Aに示すように、CaOx結晶は50〜270nmの大きさであり、平均濃度は1.26 x 10^9粒子/mLであると判断し?...

ディスカッション

NTAは、カルシウム結合プローブFluo-4 AMを用いてヒト尿中のナノ結晶を評価するために本研究で使用されている。尿中のナノ結晶を検出するための標準的な方法はありません。いくつかの研究グループは尿中のナノ結晶を検出し、サンプル^27、28を定量化する能力に制限されている広範なプロトコルまたは方法の使用に依存している。この研究は、高?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benchtop Centrifuge	Jouan Centrifuge	CR3-12
Calcium Oxalate monohydrate	Synthesized in the lab as previously described29.		Store at RT; Stock 10 mM
Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder)	Sigma	677418	Store at RT; Stock 10 mM
Ethanol	Fischer Scientific	AC615095000	Store at RT; Stock 100%
Fluo-4 AM*	AAT Bioquest, Inc.	20550	Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM
Gold Nanoparticles	Sigma	742031	Store at 2-8°C
NanoSight Instrument	Malvern Instruments, UK	NS300
Syringe pump	Harvard Apparatus	98-4730
Virkon Disinfectant	LanXESS Energizing Company, Germany	LSP
*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C.