Estimativa de nanocristais urinários em humanos usando rotulagem fluorófora de cálcio e análise de rastreamento de nanopartículas

Resumo

O objetivo deste estudo foi determinar se a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) poderia detectar e quantificar o cálcio urinário contendo nanocristais de adultos saudáveis. Os achados do presente estudo sugerem que a NTA pode ser uma ferramenta potencial para estimar os nanocristais urinários durante a doença da pedra nos rins.

Resumo

As pedras nos rins estão se tornando mais prevalentes em todo o mundo em adultos e crianças. O tipo mais comum de pedra renal é composto por cristais de oxalato de cálcio (CaOx). A cristalúria ocorre quando a urina fica supersaturada com minerais (por exemplo, cálcio, oxalato, fosfato) e precede a formação de pedra nos rins. Os métodos padrão para avaliar cristais em pretos de pedra incluem microscopia, filtração e centrifugação. No entanto, esses métodos detectam principalmente microcristais e não nanocristais. Nanocristais têm sido sugeridos como mais prejudiciais às células epiteliais renais do que microcristais in vitro. Aqui, descrevemos a capacidade da análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) de detectar nanocristais urinários humanos. Adultos saudáveis foram alimentados com uma dieta oxala controlada antes de beber uma carga de oxalato para estimular os nanocristais urinários. A urina foi coletada por 24 horas antes e depois da carga de oxalato. As amostras foram processadas e lavadas com etanol para purificar amostras. Os nanocristais urinários foram manchados com o fluorophore de ligação de cálcio, Fluo-4 AM. Após a coloração, o tamanho e a contagem de nanocristais foram determinados por meio da NTA. Os achados deste estudo mostram que a NTA pode detectar de forma eficiente a nanocristaria em adultos saudáveis. Esses achados sugerem que a NTA pode ser um valioso método de detecção precoce de nanocristaria em pacientes com doença de pedra renal.

Introdução

Cristais urinários se formam quando a urina fica supersaturada com minerais. Isso pode ocorrer em indivíduos saudáveis, mas é mais comum em indivíduos com pedras nos rins¹. A presença e o acúmulo de cristais urinários podem aumentar o risco de desenvolver uma pedra nos rins. Especificamente, isso ocorre quando cristais se ligam à placa de Randall, nuclear, acumular e crescer ao longo do tempo^2,3,4. Cristais precedem a formação de pedra nos rins e a avaliação da cristalúria pode ter valor preditivo em ex-pedras renais^3,5. Especificamente, a cristalúria tem sido sugerida para ser útil para prever o risco de recidiva da pedra em pacientes com histórico de oxalato de cálcio contendo pedras^6,7.

Os cristais têm sido relatados para impactar negativamente a função epitelial renal e circulante das células imunes^{8,9,10,11,12,13}. Foi relatado anteriormente que monócitos circulantes de oxalato de cálcio (CaOx) ex-fércias de pedra renal suprimiram bioenergetics celulares em comparação com indivíduos saudáveis¹⁴. Além disso, os cristais CaOx reduzem a bioenergéstica celular e interrompem a homeostase redox em monócitos⁸. O consumo de refeições ricas em oxalato pode causar cristalidade que pode levar a danos nos túbulos renais e alterar a produção e função de macromoléculas urinárias que são protetoras contra a formação de pedra nos rins^15,16. Vários estudos demonstraram que os cristais urinários podem variar em forma e tamanho dependendo do pH e da temperatura da urina^17,18,19. Além disso, as proteínas urinárias têm sido demonstradas para modular o comportamento cristalino²⁰. Daudon et al.¹⁹, propuseram que a análise da cristalidade poderia ser útil no manejo de pacientes com doença de pedra renal e na avaliação de sua resposta às terapias. Alguns métodos convencionais atualmente disponíveis para avaliar a presença de cristais incluem microscopia polarizada^21,22, microscopia eletrônica^23,contadores de partículas^3,filtração de urina^24,evaporação^3,5 ou centrifugação²¹. Esses estudos forneceram informações valiosas para o campo de pedra nos rins em relação à cristalúria. No entanto, uma limitação desses métodos tem sido a incapacidade de visualizar e quantificar cristais com menos de 1 μm de tamanho. Cristais deste tamanho podem influenciar o crescimento das pedras de CaOx anexando-se à placa de Randall.

Os nanocristais têm sido mostrados para causar lesões extensas nas células renais em comparação com microcristais maiores²⁵. A presença de nanocristais foi relatada na urina usando um analisador de nanopartículas^26,27. Estudos recentes têm usado sondas de bisfosfato fluorescente (alendronate-fluoresceína/alendronate-Cy5) para examinar nanocristais usando citometria de fluxo nanoescala²⁸. A limitação deste corante é que ele não é específico e se ligará a quase todos os tipos de pedras, exceto a cisteína. Assim, avaliar com precisão a presença de nanocristais em indivíduos pode ser uma ferramenta eficaz para diagnosticar cristais e/ou prever o risco de pedra. O objetivo deste estudo foi detectar e quantificar o cálcio contendo nanocristais (< 1 μm de tamanho) utilizando análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). Para isso, a tecnologia NTA foi usada em combinação com um fluorohore de ligação de cálcio, Fluo-4 AM para detectar e quantificar cálcio contendo nanocristais na urina de adultos saudáveis.

Protocolo

Todos os experimentos descritos neste trabalho foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade do Alabama em Birmingham (UAB). Adultos saudáveis (33,6 ± 3,3 anos; n=10) foram inscritos no estudo se tivessem um painel metabólico normal e abrangente, usuários não-tabaco, não gestantes, um IMC entre 20-30 kg/m², e livres de condições médicas crônicas ou doenças agudas. Os participantes saudáveis assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido por escrito antes do início do estudo.

1. Protocolo clínico e coleta de urina

1. Os participantes consomem uma dieta de baixo oxalato preparada pelo Núcleo de Bionutrição de Ciências Clínicas e Translacionais da UAB por 3 dias e rápido durante a noite antes de coletar sua urina (amostra de 24 horas).
2. No dia seguinte, os participantes retornam sua amostra de urina 24 horas (pré-oxalato) antes de consumir uma carga de oxalato (smoothie contendo frutas e legumes, ~8 mM oxalato). Os participantes posteriormente coletam sua urina por 24 horas (amostra pós-oxalato) e devolvem sua urina no dia seguinte.
3. Mantenha todas as amostras de urina à temperatura ambiente (RT) antes do processamento conforme descrito abaixo e mostrado na Figura 1.

2. Processamento de urina

NOTA: Todos os materiais e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
ATENÇÃO: Use equipamentos de proteção individual o tempo todo enquanto manuseia amostras clínicas e reagentes. Especificamente, luvas, escudos faciais e oculares, proteção respiratória e roupas protetoras.

1. Medir e registrar pH e volume de urina. Misture bem antes de adicionar 50 mL de urina em um tubo cônico estéril rotulado de 50 mL.
2. Amostra de centrífuga a 1200 x g por 10 min no RT usando uma centrífuga de bancada.
   NOTA: Mantenha a amostra em RT para evitar a formação de cristais, pois temperaturas mais frias podem promover a cristalização.
3. Descarte o supernasce e lave e resuspenque a pelota novamente com 5 mL de 100% de etanol. Centrifugar a amostra a 1200 x g por 10 minutos no RT usando uma centrífuga de bancada.
4. Descarte o supernasce e resuspenque a pelota em 1 mL de 100% de etanol. Armazene a amostra a -20 °C para posterior processamento ou manche a amostra conforme descrito abaixo.
   NOTA: Não há diferença significativa nos pontos de dados (ou seja, tamanho/concentração de partículas) entre amostras armazenadas ou recém-manchadas.

3. Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)

1. Preparação da Amostra
   1. Nanopartículas de ouro: Use nanopartículas de ouro para otimizar as configurações do instrumento. Diluir nanopartículas de ouro de tamanho 100 nm 1:1000 em água ultrapura.
   2. Urina humana: Diluir amostras de urina 20 vezes na água antes da coloração com 5 mM Fluo-4 AM (um corante de fluorescência de cálcio) por 30 min no escuro. Analise as amostras utilizando NTA.
   3. Prepare os cristais de Oxalato de Cálcio (CaOx) como descrito anteriormente²⁹. Diluir a solução de estoque de 10 mM (14,6 mg em 10 mL de água) a 50 μM de água e manchar as amostras diluídas usando 5 mM Fluo-4 AM por 30 minutos no escuro antes da análise.
   4. Cristais de fosfato de cálcio (CaP): Diluir a solução de estoque de 10 mM (50,4 mgs em 10 mL de água) a 50 μM de água e manchar as amostras diluídas usando 5 mM Fluo-4 AM por 30 minutos no escuro antes da análise da NTA.
2. Configuração de instrumentos, configurações da câmera e coleta de dados
   NOTA: A configuração do computador e do instrumento utilizada para este método são mostradas na Figura 2.
   1. Ligue o computador e depois o instrumento. Abra o software e ligue a câmera.
   2. Uma vez que a janela de software esteja aberta, clique no ícone de captura no canto superior esquerdo da janela para iniciar o modo de captura. A inicialização da câmera leva alguns segundos.
   3. Limpe a plataforma bombeando ar para dentro usando uma seringa de 1 mL até que a plataforma pareça limpa. Adicione suavemente água ao aparelho 2-3 vezes usando outra seringa de 1 mL para remover quaisquer bolhas de ar.
      NOTA: Procure por quaisquer bolhas de ar na plataforma, bem como na tubulação. É importante não ter bolhas em todo o aparelho antes e durante a execução de amostras. Se as bolhas estiverem presentes, limpe a plataforma novamente com ar e água.
   4. Uma vez que a plataforma esteja limpa, adicione água para verificar se há alguma contaminação na superfície, visualizando a câmera. Em seguida, adicione nanopartículas de ouro como controle ao injetor da bomba de carregamento de amostras para configurar o instrumento.
   5. Ajuste o nível da câmera na tela ou no botão para o lado direito do instrumento até que a imagem comece a exibir pixels coloridos e, em seguida, reduza o nível da câmera.
   6. Em seguida, ajuste a tela para otimizar a imagem. Clique à esquerda no botão do mouse na imagem do vídeo. Segure o botão esquerdo do mouse e arraste a imagem para cima e para baixo para obter toda a vista.
      NOTA: A lente e o filtro normais da câmera são usados para avaliar nanopartículas de ouro e amostras não manchadas.
   7. Configure a velocidade de infusão e concentre a câmera para que as nanopartículas de ouro sejam visíveis na tela da câmera. Defina a velocidade de infusão em alta (ou seja, 500 μL/min) para configuração inicial para garantir que as nanopartículas de ouro sejam detectadas. Uma vez detectado, reduza a velocidade para 50 μL/min.
   8. Ajuste o nível da câmera para visualizar as partículas. Para amostras não manchadas, ajuste o ganho de tela no nível 5 para alcançar o foco da câmera e ajuste o nível da câmera em 8. Uma vez definido o foco, registo a amostra (ou seja, 1 medição por apenas 60 segundos).
      NOTA: O foco e a velocidade contínua de fluxo são importantes para obter imagens claras e nítidas das partículas para contagem.
   9. Após a otimização, limpe novamente o aparelho com água antes de avaliar amostras. Veja a câmera para garantir que a tubulação esteja limpa e que as partículas não estejam presentes.
      NOTA: Lave a câmara entre cada amostra até que nenhuma partícula seja detectada pela câmera.
   10. Para analisar amostras manchadas, ajuste a câmera à posição do filtro contendo o filtro fluorescente adequado. Carregue amostras diluídas e manchadas no injetor da bomba de carga da amostra e reduza a velocidade para 20 μL/min para análise da amostra.
   11. Em seguida, ajuste o ganho de tela e o nível da câmera, pois estes são parâmetros importantes. Para amostras manchadas (fluorescentes), defina o ganho da tela para 5 e o nível da câmera no nível 13.
       NOTA: Esses parâmetros variam de acordo com o tipo de amostra e cada amostra precisará ser otimizada para ganhar foco.
   12. Use a medição padrão para medir as amostras para 5 capturas por amostra onde uma duração de captura é de 60 segundos.
   13. Salve e armazene dados após cada medição. O software salvará arquivos de imagem e vídeo para cada medição. O software fornece dados de saída (por exemplo, tamanho de cristal: 10 nM - 1000 nM e concentração) em formatos excel e pdf.
   14. Calcule o número médio de nanopartículas para todas as 5 leituras para cada amostra individual. Analise os dados usando desvio padrão ou erro padrão da média e use t-tests para análise emparelhada.

Resultados

Os achados deste estudo mostram que a NTA pode detectar eficientemente o tamanho médio e a concentração de cálcio contendo nanocristais urinários na urina humana. Isso foi conseguido utilizando-se a análise de rastreamento de fluoforas, Fluo-4 AM e nanopartículas. Fluo-4 AM foi capaz de se ligar tanto aos cristais CaOx quanto aos cap. Como mostrado na Figura 3A,os cristais caOx foram determinados entre 50-270 nm de tamanho e têm uma concentração média de 1,26 x 10⁹ part...

Discussão

A NTA tem sido utilizada no presente estudo para avaliar nanocristais na urina humana usando uma sonda de ligação de cálcio, Fluo-4 AM. Não há um método padrão disponível para detectar nanocristais na urina. Alguns grupos de pesquisa detectaram nanocristais na urina e se basearam no uso de protocolos ou métodos extensos que são limitados em sua capacidade de quantificar as amostras^27,28. Este estudo mostra um método específico e sensível para detecta...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benchtop Centrifuge	Jouan Centrifuge	CR3-12
Calcium Oxalate monohydrate	Synthesized in the lab as previously described29.		Store at RT; Stock 10 mM
Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder)	Sigma	677418	Store at RT; Stock 10 mM
Ethanol	Fischer Scientific	AC615095000	Store at RT; Stock 100%
Fluo-4 AM*	AAT Bioquest, Inc.	20550	Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM
Gold Nanoparticles	Sigma	742031	Store at 2-8°C
NanoSight Instrument	Malvern Instruments, UK	NS300
Syringe pump	Harvard Apparatus	98-4730
Virkon Disinfectant	LanXESS Energizing Company, Germany	LSP
*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C.