Оценка мочевых нанокристаллов у людей с использованием маркировки флуорофора кальция и анализа отслеживания наночастиц

Резюме

Цель этого исследования состояла в том, чтобы определить, может ли анализ отслеживания наночастиц (NTA) обнаружить и количественно оценить мочевой кальций, содержащий нанокристалл, у здоровых взрослых. Результаты текущего исследования показывают, что NTA может быть потенциальным инструментом для оценки нанокристаллов мочи при почечнокаменной болезни.

Аннотация

Камни в почках становятся все более распространенными во всем мире у взрослых и детей. Наиболее распространенный тип камней в почках состоит из кристаллов оксалата кальция (CaOx). Кристаллурия возникает, когда моча перенасыщена минералами (например, кальцием, оксалатом, фосфатом) и предшествует образованию камней в почках. Стандартные методы оценки кристаллурии в камнеобмениках включают микроскопию, фильтрацию и центрифугирование. Однако эти методы в первую очередь обнаруживают микрокристалл, а не нанокристалл. Было высказано предположение, что нанокристаллы более вредны для эпителиальных клеток почек, чем микрокристаллы in vitro. Здесь мы описываем способность анализа отслеживания наночастиц (NTA) обнаруживать нанокристаллы мочи человека. Здоровых взрослых кормили контролируемой оксалатной диетой перед употреблением оксалатной нагрузки для стимуляции мочевых нанокристаллов. Моча собиралась в течение 24 часов до и после оксалатной нагрузки. Образцы обрабатывали и промывали этанолом для очистки образцов. Мочевые нанокристаллы окрашивали кальцийсвязывающим флуорофором Fluo-4 AM. После окрашивания размер и количество нанокристаллов определяли с помощью NTA. Результаты этого исследования показывают, что NTA может эффективно обнаруживать нанокристаллурию у здоровых взрослых. Эти данные свидетельствуют о том, что NTA может быть ценным методом раннего выявления нанокристаллурии у пациентов с почечнокаменной болезнью.

Введение

Мочевые кристаллы образуются, когда моча становится перенасыщенной минералами. Это может произойти у здоровых людей, но чаще встречается у людей с камнями в почках^1. Наличие и накопление кристаллов в моче может увеличить риск развития камня в почках. В частности, это происходит, когда кристаллы связываются с бляшкой Рэндалла, нуклеат, накапливаются и растут с течением^{времени 2,3,4.} Кристаллурия предшествует образованию камней в почках и оценка кристаллурии может иметь прогностическое значение у камнеобразовательных почек^3,5. В частности, было предложено, чтобы кристаллурия была полезна для прогнозирования риска рецидива камней у пациентов с анамнезом оксалата кальция, содержащего камни^6,7.

Сообщалось, что кристаллы негативно влияют на функцию почечных эпителиальных и циркулирующих иммунных клеток^{8,9,10,11,12,13.} Ранее сообщалось, что циркулирующие моноциты из камнеуловителей оксалата кальция (CaOx) подавляют клеточную биоэнергетику по сравнению со здоровыми людьми^14. Кроме того, кристаллы CaOx снижают клеточную биоэнергетику и нарушают окислительно-восстановительный гомеостаз в моноцитах^8. Потребление пищи, богатой оксалатами, может вызвать кристаллурию, которая может привести к повреждению почечных канальцев и изменить выработку и функцию макромолекул в моче, которые защищают от образования камней в почках^15,16. Несколько исследований показали, что мочевые кристаллы могут различаться по форме и размеру в зависимости от рН и температуры мочи^17,18,19. Кроме того, было показано, что мочевые белки модулируют поведение кристаллов^20. Daudon et al.¹⁹предположили, что анализ кристаллурии может быть полезен в ведении пациентов с почечнокаменной болезнью и в оценке их реакции на терапию. Несколько традиционных методов, доступных в настоящее время для оценки присутствия^{кристаллов,}включают поляризованную микроскопию^{21,22, электронную}микроскопию^23,счетчики частиц^3,фильтрацию мочи^24,испарение^3,5 или центрифугирование^21. Эти исследования дали ценную информацию о области камней в почках относительно кристаллурии. Однако ограничением этих методов была неспособность визуализировать и количественно оценивать кристаллы размером менее 1 мкм. Кристаллы такого размера могут влиять на рост камней CaOx, прикрепляясь к бляшке Рэндалла.

Было показано, что нанокристаллы вызывают обширное повреждение почечных клеток по сравнению с более крупными микрокристаллами^25. Сообщалось о присутствии нанокристаллов в моче с использованием анализатора наночастиц^26,27. Недавние исследования использовали флуоресцентно меченые бисфосфатные зонды (алендронат-флуоресцеин/алендронат-Cy5) для изучения нанокристаллов с использованием наноразмерной проточной цитометрии^28. Ограничение этого красителя заключается в том, что он не является специфическим и будет связываться практически со всеми типами камней, кроме цистеина. Таким образом, точная оценка присутствия нанокристаллов у людей может быть эффективным инструментом для диагностики кристаллурии и/или прогнозирования риска камней. Целью этого исследования было обнаружение и количественная оценка нанокристаллов кальция (размером <1 мкм) с использованием анализа отслеживания наночастиц (NTA). Для достижения этой цели технология NTA использовалась в сочетании с кальцийсвязывающим флуорофором Fluo-4 AM для обнаружения и количественной оценки нанокристаллов кальция, содержащих в моче здоровых взрослых.

протокол

Все эксперименты, описанные в этой работе, были одобрены Советом по институциональному обзору Университета Алабамы в Бирмингеме (UAB). Здоровые взрослые (33,6 ± 3,3 года; n = 10) были включены в исследование, если у них была нормальная комплексная метаболическая панель крови, не употребляли табак, не беременные, ИМТ между 20-30 кг /^м2и без хронических заболеваний или острых заболеваний. Здоровые участники подписали письменную форму информированного согласия до начала исследования.

1. Клинический протокол и сбор мочи

1. Запрочем участникам потреблять диету с низким содержанием оксалатов, подготовленную Центром клинических и трансляционных наук UAB Bionutrition Core в течение 3 дней и голодать на ночь, прежде чем собирать мочу (24-часовой образец).
2. На следующий день участники должны вернуть свой 24-часовой образец мочи (преоксалат) перед употреблением оксалатной нагрузки (смузи, содержащий фрукты и овощи, ~ 8 мМ оксалата). Впоследствии участники собирали мочу в течение 24 часов (образец после оксалата) и возвращали свою мочу на следующий день.
3. Поддерживайте все образцы мочи при комнатной температуре (RT) перед обработкой, как описано ниже и показано на рисунке 1.

2. Обработка мочи

ПРИМЕЧАНИЕ: Все используемые материалы и оборудование перечислены в Таблице материалов.
ВНИМАНИЕ: Носите средства индивидуальной защиты в любое время при обращении с клиническими образцами и реагентами. В частности, перчатки, щитки для лица и глаз, защита органов дыхания и защитная одежда.

1. Измерьте и запишите рН и объем мочи. Тщательно перемешайте перед добавлением 50 мл мочи в меченую стерильную коническую трубку 50 мл.
2. Образец центрифуги при 1200 х г в течение 10 мин при РТ с использованием настольная центрифуга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите образец на rt, чтобы предотвратить дальнейшее образование кристаллов, так как более низкие температуры могут способствовать кристаллизации.
3. Выбросьте супернатант, промыть и снова суспендировали гранулу 5 мл 100% этанола. Центрифугировать образец при 1200 х г в течение 10 минут на RT с помощью настольная центрифуга.
4. Выбросьте супернатант и повторно суспендьте гранулу в 1 мл 100% этанола. Храните образец при -20 °C для последующей обработки ИЛИ окрашивайте образец, как описано ниже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Между сохраненными или свежеокрашенными образцами не существует существенной разницы в точках данных (т.е. размере/концентрации частиц).

3. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)

1. Пробоподготовка
   1. Наночастицы золота: используйте наночастицы золота для оптимизации настроек на приборе. Разбавьте наночастицы золота размером 100 нм 1:1000 в сверхчистой воде.
   2. Человеческая моча: Разбавьте образцы мочи 20 раз в воде перед окрашиванием 5 мМ Fluo-4 AM (краситель флуоресценции кальция) в течение 30 мин в темноте. Анализируйте образцы с помощью NTA.
   3. Готовят кристаллы оксалата кальция (CaOx), как^{описано ранее 29.} Разбавляют 10 мМ запасного раствора (14,6 мг в 10 мл воды) до 50 мкМ в воде и окрашивают разбавленные образцы с использованием 5 мМ Fluo-4 AM в течение 30 мин в темноте перед анализом.
   4. Кристаллы фосфата кальция (CaP): Разбавить 10 мМ раствора (50,4 мг в 10 мл воды) до 50 мкМ в воде и окрашивать разбавленные образцы с использованием 5 мМ Fluo-4 AM в течение 30 мин в темноте перед анализом NTA.
2. Настройка приборов, настройки камеры и сбор данных
   ПРИМЕЧАНИЕ: Компьютер и прибор, используемые для этого метода, показаны на рисунке 2.
   1. Включите компьютер, а затем инструмент. Откройте программное обеспечение и включите камеру.
   2. Открыв окно программного обеспечения, щелкните значок захвата в левом верхнем углу окна, чтобы запустить режим захвата. Инициализация камеры занимает несколько секунд.
   3. Очистите платформу, сначала закачивая в нее воздух с помощью шприца 1 мл, пока платформа не появится чистой. Осторожно добавьте воду в аппарат 2-3 раза, используя еще шприц 1 мл, чтобы удалить пузырьки воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ищите любые пузырьки воздуха в платформе, а также в трубке. Важно, чтобы во всем аппарате не было пузырьков до и во время запуска образцов. Если пузырьки присутствуют, снова очистите платформу воздухом и водой.
   4. Как только платформа будет чистой, добавьте воду, чтобы проверить наличие загрязнений на поверхности, просмотрев камеру. Затем добавьте наночастицы золота в качестве элемента управления в инжектор насоса загрузки образцов для настройки инструмента.
   5. Отрегулируйте уровень камеры на экране или на ручке в правой части инструмента, пока изображение не начнет отображать цветные пиксели, а затем уменьшите уровень камеры.
   6. Затем настройте экран, чтобы оптимизировать изображение. Щелкните левой кнопкой мыши на видеоизоблике. Удерживайте левую кнопку мыши и перетаскивайте изображение вверх и вниз, чтобы получить весь вид.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычный объектив камеры и фильтр используются для оценки наночастиц золота и неокрашаемых образцов.
   7. Настройте скорость инфузии и сфокусировать камеру так, чтобы наночастицы золота были видны на экране камеры. Установите высокую скорость инфузии (т.е. 500 мкл/мин) для первоначальной настройки, чтобы обеспечить обнаружение наночастиц золота. После обнаружения уменьшите скорость до 50 мкл/мин.
   8. Отрегулируйте уровень камеры, чтобы визуализировать частицы. Для неокрашированных образцов отрегулируйте коэффициент усиления экрана на уровне 5, чтобы достичь фокусировки камеры, и установите уровень камеры на 8. Как только фокус установлен, запишите образец (т.е. 1 измерение только в течение 60 секунд).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фокусировка и непрерывная скорость потока важны для получения четких и четких изображений частиц для подсчета.
   9. После оптимизации снова очистите аппарат водой перед оценкой образцов. Посмотрите на камеру, чтобы убедиться, что трубка чистая и частицы отсутствуют.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мойте камеру между каждым образцом до тех пор, пока камера не обнаружит частицы.
   10. Чтобы проанализировать окрашенные образцы, отрегулируйте камеру в положение фильтра, содержащего подходящий флуоресцентный фильтр. Загрузите разбавленные и окрашенные образцы в инжектор насоса загрузки образцов и уменьшите скорость до 20 мкл/мин для анализа образца.
   11. Затем отрегулируйте коэффициент усиления экрана и уровень камеры, так как это важные параметры. Для окрашенных (флуоресцентных) образцов установите коэффициент усиления экрана равным 5, а уровень камеры — 13.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры будут варьироваться в зависимости от типа выборки, и каждый образец должен быть оптимизирован для получения фокуса.
   12. Используйте стандартное измерение для измерения образцов в течение 5 захватов на образец, где одна продолжительность захвата составляет 60 секунд.
   13. Сохраняйте и храните данные после каждого измерения. Программа сохранит изображения и видео файлы для каждого измерения. Программное обеспечение предоставляет выходные данные (например, размер кристалла: 10 нМ - 1000 нМ и концентрацию) как в формате Excel, так и в формате pdf.
   14. Рассчитайте среднее количество наночастиц для всех 5 показаний для каждого отдельного образца. Анализируйте данные, используя стандартное отклонение или стандартную погрешность среднего значения и используйте t-тесты для парного анализа.

Результаты

Результаты этого исследования показывают, что NTA может эффективно обнаруживать средний размер и концентрацию кальция, содержащего нанокристаллы мочи в моче человека. Это было достигнуто с помощью анализа флуорофора, Fluo-4 AM и отслеживания наночастиц. Fluo-4 AM был способен связываться как с...

Обсуждение

NTA был использован в настоящем исследовании для оценки нанокристаллов в моче человека с использованием кальцийсвязывающего зонда Fluo-4 AM. Не существует стандартного метода обнаружения нанокристаллов в моче. Некоторые исследовательские группы обнаружили нанокристалла в моче и полагал?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benchtop Centrifuge	Jouan Centrifuge	CR3-12
Calcium Oxalate monohydrate	Synthesized in the lab as previously described29.		Store at RT; Stock 10 mM
Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder)	Sigma	677418	Store at RT; Stock 10 mM
Ethanol	Fischer Scientific	AC615095000	Store at RT; Stock 100%
Fluo-4 AM*	AAT Bioquest, Inc.	20550	Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM
Gold Nanoparticles	Sigma	742031	Store at 2-8°C
NanoSight Instrument	Malvern Instruments, UK	NS300
Syringe pump	Harvard Apparatus	98-4730
Virkon Disinfectant	LanXESS Energizing Company, Germany	LSP
*Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C.