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要約

このプロトコルの目的は、生体整血、コラーゲンベースのヒドロゲル、心臓組織工学、薬物スクリーニング、および疾患モデリングにおける応用のために、心臓線維芽細胞(CF)と共培養された幹細胞由来心筋細胞で構成される、高度に整列したヒト心臓組織の三次元(3D)微小流体モデルの開発を説明し、実証することである。

要約

世界的に主要な死因は心血管疾患(CVD)として持続する。しかし、心筋の生理学的および生物学的複雑さをモデル化することは、心筋、 インビトロ で達成することは悪名高い困難である。主に、障害は、大人であるか、または成人のような型を示し、心筋の細胞複雑さと複雑な3Dアーキテクチャをうまく再現できる人間の心筋細胞(CM)の必要性にあります。残念ながら、倫理的な懸念と利用可能な一次患者由来のヒト心臓組織の欠如のために、CMの最小限の増殖と組み合わせることで、実行可能なヒトCMの調達は心臓組織工学の限界ステップであった。この目的のために、ほとんどの研究はヒトCMの主要な供給源としてヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)の心臓分化に移行し、心臓組織モデリングのための インビトロ アッセイ内にhiPSC-CMを広く組み込むことになった。

本研究では、マイクロ流体装置内で3D成熟した幹細胞由来ヒト心臓組織を開発するためのプロトコルを示す。HiPSC由来のCMから3D インビトロ 異方性心臓組織オンチップモデルの生産を具体的に説明し、視覚的に実証する。我々は、主にCMに対して選択する精製プロトコル、ヒトCF(hCF)とCMを混合することによって定義された比率を有する細胞の共培養、およびコラーゲンベースのヒドロゲル内でのこの共培養の停止を記述する。我々はさらに、周囲の細胞とヒドロゲルマトリックスの高度な整列を誘導する表面地形として機能するずらした楕円マイクロポストを埋め込んだ、明確に定義されたマイクロ流体装置内の細胞を含むヒドロゲルの注入を実証し、天然心筋のアーキテクチャを模倣する。我々は、提案された3D異方性心臓組織オンチップモデルが基礎生物学研究、疾患モデリング、およびスクリーニングツールとしての使用を通じて、医薬品試験に適していると考える。

概要

組織工学的アプローチは広く探求されており、近年、再生医療および疾患モデリング1,2における生体内臨床所見に付随する。特に、ヒト原発性心臓組織を調達し、生理学的に関連する生体内サロゲートを産生する際の固有の困難のために、インビトロ心臓組織モデリングに重点が置かれていたので、心血管疾患(CVD)1,3の複雑なメカニズムの基本的な理解を制限する。従来のモデルは、しばしば2D単層培養アッセイを含む。しかし、心筋のネイティブな風景と複雑な細胞相互作用の両方を模倣するために3D環境内で心臓細胞を培養することの重要性は、4,5を大きく特徴づけられてきた。さらに、これまでに生産されたほとんどのモデルには、幹細胞から分化したCMの単一培養が含まれています。しかし、心臓は複雑な3Dアーキテクチャ7内の複数の細胞タイプ6で構成され、3D in vitroモデル内の組織組成の複雑さを改善し、ネイティブ心筋の細胞構成体をよりよく模倣する重要な必要性を保証する。

現在までに、多くの異なるアプローチが心筋8のバイオミメティック3Dモデルを生成するために探求されてきた。これらのアプローチは、生成された力のリアルタイム計算を可能にする実験的なセットアップから、薄膜に播種されたモノカルチャーCM(筋肉薄膜(MTFとみなされる)9)から、自立性カンチレバー(設計心臓組織(EHT))の間に浮遊する3Dヒドロゲルマトリックスの心臓細胞の共培養まで多岐にわたる。他のアプローチは、心筋異方性を模倣するマイクロモールディング技術の実施に焦点を当て、組織パッチ11内の突出マイクロポストの間に浮遊する3Dヒドロゲル中の単培養CMから、インデントマイクログルーブ12、13の間に播種された単一培養CMに。これらの方法のそれぞれに固有の長所と短所があり、したがって、意図された適用および対応する生物学的問題と一致する技術を利用することが適切である。

幹細胞由来のCMの成熟を高める能力は、成人様心筋組織の正常なインビトロ工学と、その後の知見を臨床解釈に翻訳するために不可欠である。このため、成熟したCMの方法は、2Dと3D14、15、16の両方で広く探求されてきました。例えば、EHTに組み込まれた電気刺激、表面地形によるCMの強制アライメント、シグナル伝達キュー、共培養からの成長因子、および/または3Dヒドロゲル条件などは、細胞形態、カルシウム処理、肉体構造、遺伝子発現、収縮力の少なくとも1つでCM成熟を支持する変化を招く。

これらのモデルのうち、マイクロ流体プラットフォームを利用するアプローチは、勾配の制御、限られた細胞入力、および最小限の必要な試薬など、本質的に一定の利点を保持します。さらに、多くの生物学的複製は、マイクロ流体プラットフォームを用いて一度に生成することができ、目的の生物学的機構をより良く解剖し、統計的パワー17、18、19を支持して実験サンプルサイズを増加させる役割を果たすことができる。さらに、マイクロ流体デバイスの製造プロセスでフォトリソグラフィーを使用すると、微細およびナノレベルでの正確な特徴(例えば、地形)を作成することができ、これは、組織再生および疾患モデリングにおける異なる用途に対して、周囲の細胞構造およびマクロレベル組織アーキテクチャ18、20、21、22を強化するメソスコピックキューとして機能するマイクロレベルおよびナノレベルでの正確な特徴を作成する。

我々は、先ず、表面地形を組み込んだ新規3D心臓組織オンチップモデルの開発を実証し、自然楕円形のマイクロポストの形態で、ヒドロゲルカプセル化された共培養心臓細胞を相互接続された異方性組織20に整列させた。培養の14日後、マイクロ流体デバイス内に形成された組織は、単層および3D等方性対照23と比較した場合に、その表現型、遺伝子発現プロファイル、カルシウム処理特性、および医薬応答においてより成熟している。本明細書に記載されているプロトコルは、この3D共培養を作成するための方法を概説し、 hiPSC由来のCMを用いたマイクロ流体装置内のヒト心臓組織(すなわち異方性)を具体的に説明する具体的には、HIPSCをCMに向けて区別および精製し、確立された共培養集団を産生するためにCMを用いてhCFを補充し、コラーゲンハイドロゲル内にカプセル化した細胞集団をマイクロ流体デバイスに挿入し、その後の3D組み立てられたtf結果として得られた3D工学的マイクロ組織は、基礎生物学研究、CVDモデリング、医薬品試験など、さまざまな用途に適しています。

プロトコル

バイオセーフティキャビネット内で細胞処理と試薬の準備をすべて行います。細胞に接触するすべての表面、材料、および装置が無菌であることを確認します(すなわち、70%エタノールでスプレーダウン)。細胞は加湿37°C、5%CO2インキュベーターで培養されるべきである。hiPSCの培養と分化は、すべて6ウェルプレートで行われます。

1. マイクロ流体デバイスの作成(概算所要時間:1週間)

  1. 写真石版
    注: CAD ファイル ( 補助ファイル 1として提供) を使用して設計されたマスクには、マイクロ流体チャネルの設計が含まれています。透明なマスクでデザインを印刷します。次に、クリーンルーム内の4インチシリコンウエハで負のフォトレジストSU8 2075で標準フォトリソグラフィを行います。
    1. ケイ素ウエハースをイソプロピルアルコール(IPA)で洗浄し、窒素で乾燥させます。200°Cで5分間焼いて脱水します。
      注:ウエハーピンセットでウエハーを扱ってください。
    2. ウエハーをスピンコーターに入れる。ウエハーの中央に3〜4mLのSU8を堆積し、200μmの層を形成するために回転します(すなわち、15 sから500rpmにランプアップし、10sのためにスピンし、5 sから1,200rpmを立て、30 sでスピンし、停止するまで15秒スピンします)。
    3. ウエハースとソフトベークを65°Cで7分間取り出し、95°Cで45分焼きます。
    4. ウエハーをマスクアライナに移動し、マスクホルダーに UV フィルターを使用して透明マスクを配置します。ウエハーを2サイクルの2サイクルに2サイクル、30s遅延で、合計460 mJ/cm 2の露出を行います。
    5. 露光後のウエハースを一晩50°Cのオーブンで焼きます。
    6. 翌朝オーブンの電源を切り、ウエハーが室温まで冷却した後、SU8-現像剤に沈めます。5分ごとにウエハーを取り出し、IPAで洗浄し、開発者に戻します。
    7. 約20分後、またはIPAが透明に走ったら、ウエハースを空気窒素で乾燥させ、150°Cに設定したオーブンでハードベークします。オーブンが150°Cに達するとすぐに、それをオフにしますが、開かないでください。室温になるまでウエハーをオーブンに入れたままにしてから、ウエハーを取り出します。
    8. プロフィロメーターでSU8の高さを確認し、光学機能を光学顕微鏡で確認します。確認したら、150mmプラスチックペトリ皿の中にウエハーをテープで貼ります。
  2. ソフトリソグラフィー
    注:ペトリ皿にテープで留めたウエハーは、SU8機能へのPDMSの付着を防ぐために、シラナナイズする必要があります。
    1. 0.4 mLのメチルトリクロロシラン(MTCS)を含む同じサイズのガラスペトリ皿の上にウエハー(プラスチックペトリ皿に叩き)を反転させ、ウエハーを蒸気に4分間露出させます。ウエハーを直立させ、ペトリ皿の上に蓋を置きます。
    2. 30gのシリコーンエラストマー基剤を硬化剤に10:1比で混合する。ペトリ皿から蓋を取り出し、ウエハーにポリジメチルシロキサン(PDMS)を注ぎ、デシケーター内で脱気します。
    3. すべての気泡がなくなったら、80°Cの1.5時間にウエハーを置き、PDMSを治癒します。
    4. PDMSを慎重に剥がし、それぞれ1mmと1.5mmのバイオプシーパンチで組織ポートとメディアチャンネルの入口と出口をパンチします。
    5. PDMSチャネルをテープでクリーニングして、ほこりを取り除きます。次に、カバーリップ(18 x 18 mm、No.1)を70%エタノールに15分以上浸します。その後、これらをティッシュワイプで乾かします。
    6. カバースリップとPDMSチャネル(特徴側が露出した)の両方をプラズマに1分間(高く設定)し、すぐに一緒に結合し、80°Cのオーブンに一晩置いて結合を確保します。
      注: ボンディング中は、PDMS チャネルの端に軽い圧力をかけて、チャネル自体を避けながら PDMS とガラスの間に良好なシールを適用し、チャネルが崩壊するのを防ぐことが不可欠です。
  3. デバイスの準備
    1. 結合PDMSデバイスを脱イオン水(DIH2O)に沈め、オートクレーブを液体サイクルに浸します。次に、デバイスから液体を吸引し、重力サイクルで再びオートクレーブを行う。次いで、滅菌装置を80°Cで一晩脱水する。

2. 幹細胞培養(おおよその期間:1~2ヶ月)

  1. hiPSCの文化とメンテナンス
    注:hiPSCは、凍結保存または分化の前に インビトロで 解凍した後、3つの連続した通路のために培養する必要があります。hiPSCは、E8またはmTeSR1培地のいずれかで培養され、細胞株に応じて、基質膜マトリックス被覆プレート24上に配置される。
    1. hESC品質の基膜マトリックスでプレートをコーティングするには、マトリックス媒体の1つのアリコート(ロット依存容積、一般的に200〜300μL、-80°Cで保存)を氷上のDMEM/F-12Kの25 mLに加えて解凍します。この懸濁液の1 mLを6ウェルプレートの各ウェルに分配します。プレートを37°Cで少なくとも1時間放置します。
    2. 解凍時に、Y-27632 25(E8+RI)の5 μMを加えて、hiPSC培養用のE8メディアを変更します。このメディアを24時間使用してから、メディアを新しいE8に変更します。
      注: 日常的なメディア変更の場合、変更されていない E8 メディアは hiPSC のカルチャに使用されます。定期的なメンテナンスのために、E8メディアは、以前のメディア変更後約24時間後に毎日変更する必要があります。
    3. 3日目または4日目のパッセージ細胞は、吸引培地を、1xダルベッコのリン酸緩衝溶液(DPBS)の1mLでそれぞれをよく洗う。
      注: セルが約 70% コンフルエントであることを確認します。彼らは70%の合流を超えて成長させないでください。
    4. DPBSを吸引し、各ウェルに0.5 mM EDTAの1mLを加え、室温で6〜7分間インキュベートします。
    5. EDTAを慎重に吸引し、E8+RIを1mLずつ各ウェルに加え、1 mLピペットで表面に対してブラストします(細胞の全てを収集するには5~10回)。15 mLマイクロ遠心チューブに細胞懸濁液を回収します。
    6. E8+RIで所望の細胞密度(すなわち、ウェルあたり〜200K)で細胞懸濁液および通過を数える。
    7. メディアをE8(RIなし)24時間後に変更します。細胞をRIで24時間以上放置しないでください。
      注:E8は37°Cに加熱しないでください。 細胞培養前に常に温めるため、常に室温にしておきます。
  2. 心筋細胞(CM)による分化
    注: hiPSCs26,27の異なる行間に異質性が存在することに注意することが重要です。CM の差別化については、以下の手順に従います。
    1. RPMI + B27を調製 - インスリンを10mLのB27マイナスインスリンと5mLのペニシリン/ストレプトマイシン(ペン/ストレップ)をRPMI 1640の500 mLに加える。
    2. RPMI + B27 + インスリンを調製し、10 mLのB27と5 mLのペン/ストレップをRPMI 1640の500 mLに加えます。
    3. B27の10 mL、ペン/ストレップの5 mL、および4 mM乳酸ナトリウムをグルコースなしでRPMI 1640の500 mLに加えることによってRPMIマイナスグルコース+B27+インスリンを準備しなさい。
    4. HIPSCが85%の合流度に達すると、 6ウェルプレートの各ウェルに10 μM CHIR99021を含むインスリン培地をRPMI+ B27の4mLに置き換えることによって分化(Day 0)を開始します(すなわち、10 mM CHIR99021の25 μLをRPMI + B27 - インスリンの25 mLに加え、すぐに4mL/インスリンを加えます)。
      注意: CHIR99021はGSK阻害剤であり、Wnt活性化につながります。CHIR99021の最適濃度および初期合流度は、細胞株28ごとに異なる。実際の実験の前に、濃度勾配6-12 μM CHIR99021と一連のシード密度を必ず確認して、分化を開始するための最適な条件を決定します。
    5. ちょうど24時間後(1日目)、培地を吸引し、5 mLの事前に温めたRPMI+ B27 -インスリンを各ウェルに置き換える。
    6. ちょうど72時間チR99021添加後(3日目)、6ウェルプレートの各ウェルから使用済み培地の2.5mLを収集し、チューブ内に使用済み培地の合計15mLを。
    7. これに、新鮮なRPMI + B27 - インスリン培地の15 mLを追加します。IWP2を結合された媒体の管に5μMの集中に加える(すなわち、IWP2の1μLは1 mLの結合された媒体の1 mLで、または30 μLのIWP2の合計mL媒体に加える)。
    8. プレートのウェルごとに残りの培地の約1.5mLを取り除き、培地の1mLが残るようにします。細胞の破片の十分な除去を保障するために、プレートを激しく回す。次いで、残りの古い培地を吸引し、プレートのウェル当たりIWP2を含む組み合わせ培地の5mLを加えた。
      注: 細胞に IWP2 を追加すると Wnt 阻害が起こる。
    9. 5日目に、各ウェルから培地を吸引し、5mLの事前に温めたRPMI+B27-インスリンに置き換える。
    10. CM成熟:7日目、9日目、11日目に、各ウェルから培地を吸引し、5mLのプリウォームRPMI+B27+インスリンに置き換えます。自発的な殴打は、これらの日の周りに観察されるべきです.
    11. CM精製:13日目と16日目に、各ウェルから培地を吸引し、1x DPBSの1mLでそれぞれよく洗浄し、4mMの乳酸ナトリウムを添加した5mLのプリウォームRPMIマイナスグルコース+B27+インスリンを加えることによってグルコース飢餓を開始する。
    12. 19日目に、使用済み培地を吸引し、5mLのプリウォームRPMI+B27+インスリンを各ウェルに交換し、精製後の細胞回収を可能にする。
    13. 21日目に、細胞を再プレートし、以下に記載したCM解離プロトコル(ステップ3.3)に従う。6ウェルプレートに1.5-2 x 106 細胞をプレートすることを目指してください。例えば、非常に効率の高い分化であれば、一般的に6つのウェルを9ウェルに拡大することは良い。
    14. 21日目から、各ウェルから培地を吸引し、2〜3日ごとに4mLのRPMI+B27+インスリンに交換する。
      注: hiPSC-CM は 23 日目以降に実験的な使用の準備ができています。

3. マイクロ流体装置内の3D心臓組織の作成:(概算持続時間:2-3時間)

  1. hCF 文化
    1. 培養ヒト心室心筋線維芽細胞(hCF;ロンザから商業的に得られる)のT75フラスコ(1フラスコあたり250K細胞で)線維芽細胞増殖培地-3(FGM3)。一日おきにメディアを変更し、70%コンフルエントの場合は通過します。彼らは高い通路29で筋線維芽細胞に分化し始める可能性があるため、通過10の前にhCFを使用してください。
  2. hCF 解離
    1. hCFを解離するには、まずインキュベーターからフラスコを取り出す。バイオセーフティキャビネットの中にフラスコを入れ、フラスコから使用済み培地を吸引し始めます。その後、T75フラスコを3mLの1xDPBSで洗います。キャップを閉じ、フラスコを旋回します。
    2. DPBSを吸引する。プリウォームド1xトリプシン-EDTAの3 mLを取る(0.05%)フラスコに加えます。フラスコを傾け、旋回して底をコーティングします。丸い細胞の形状と浮遊細胞を通して証明されるように、顕微鏡下でフラスコをチェックして細胞が剥離していることを確認し、37°Cインキュベーターに入れておきます。そうでなければ、フラスコをインキュベーターに戻してさらに1分間置きます。
    3. フラスコに3mLのプリウォームFGM3を加えてトリプシン作用を中和する。その後、フラスコの底部に対して溶液を上下にピペットして、CFを取り外します。
    4. 15 mLマイクロ遠心チューブに細胞懸濁液を回収します。細胞懸濁液を10μLとし、それをヘモサイトメーターに分配して顕微鏡で細胞を数えます。
    5. 細胞懸濁液を200xgで4分間遠心分離する。上清を吸引し、細胞ペレットを乱さないよう注意する。
    6. ペレットを新鮮なFGM3で再懸濁し、所望の75 x 106 細胞/mLを作る。一部(T75フラスコあたり250K細胞)を通過するか、または3D心臓組織を生成するために以下のプロトコルに従ってください。
  3. CM の解離
    注: 分化と精製の後、マイクロ流体デバイスへの注入に使用する CM を準備します。
    1. CMのプレートをインキュベーターから取り出し、メディアを吸引します。その後、6ウェルプレートのウェルあたり1x DPBSの1 mLでウェルを洗います。DPBSとピペット1 mLの6 mLを取る。
    2. プレートに取り付けられた細胞を邪魔しないように注意してDPBSを吸引する。ピペット6mLの温細胞剥離液(例えば、トリプルエクスプレス)を1ウェルあたり1 mL添加する。37°Cインキュベーターで細胞を10分間インキュベートします。
    3. 同量のRPMI+B27+インスリン(すなわち、ウェルあたり1mL)で酵素を中和し、1mLピペットで培養容器に対して上下にピペット化して細胞を機械的に解化する。
    4. 15 mL遠心分離管にCMを回収します。300 x g で遠心分離機 3 分間
    5. 上清を吸引する。細胞ペレットをRPMI+B27+インスリンの5mLで再懸濁する。適切な混合を確実にするために1 mLピペットで溶液を上下にピペット。細胞懸濁液を10μLとし、ヘモサイトメーターで分配して細胞の総数を決定します。
    6. 3分間300xgで再び遠心分離し(トリプレの完全な除去を確実にするために)、上清を吸引する。次に、RPMI + B27 + インスリンの適切な量を追加して、75 x 106細胞/mLを達成します。
      注:心臓分化/選択が高CM%(すなわち、>80%)をもたらさない場合、cTnTのようなCM特異的タンパク質の免疫染色またはフローサイトメトリーを通じて証明されるように、細胞は組織形成に適しているとは考えないでください。CHIR99021濃度の調整と初期開始密度によってこれが起こる場合、分化プロセスは最適化されるべきです。CM精製が改善を必要とする場合、蛍光活性化細胞分類(FACS)または磁気活性化細胞分類(MACS)30、31、32のいずれかを有するCMの並べ替えなどの他の方法を利用することができる。
  4. コラーゲン製剤
    注:コラーゲンストックの高濃度からコラーゲンを調製(8〜11mg/mLの範囲)。細胞を作るために使用されるコラーゲン:ヒドロゲル混合物は6mg/mLで、最終濃度は2mg /mLです。注入するデバイスの数に応じて、作られるコラーゲン溶液の量を戻す必要があります。
    1. バイオセーフティフード内の氷の上に必要なすべての試薬を保管してください。
      注:コラーゲンは、熱応答性ヒドロゲルです。したがって、温度は、早期重合を防ぐために低いままである必要があります。
    2. ストックコラーゲン(8mg/mL)を75μLとし、氷の上のマイクロ遠心分離チューブに入れて分配します。コラーゲン溶液は非常に粘性があるので、ピペットでゆっくりと吸引します。
    3. 13.85 μLの培地(すなわち、RPMI + B27 + インスリン)を取り、同じチューブに分配します。
    4. その後、フェノールレッドの10 μLを取り、混合物に追加し、再中断します。
    5. 最後に、1N NaOHの1.15 μLを取り、サスペンションに加えます。
    6. 200 μL ピペットチップを使用して、懸濁液を再中断します。
      注:ストックコラーゲンは酸性pHを有し、心臓細胞をカプセル化するためにそれを使用する前に中和するためにNaOHの添加を必要とする。フェノール赤は、pH のインジケータとして機能します。;したがって、NaOH 追加の前にこれを追加します。この時点で、コラーゲン溶液は黄色になり、その酸性度を示します。NaOHを添加した後、溶液はオレンジ色に点灯し、中和を示す。
  5. ヒドロゲル混合物および細胞製剤
    注:このステップでは、コラーゲンベースのヒドロゲル内の細胞のカプセル化が行われます。細胞は、すべてのヒドロゲル前駆体と同様に、次のステップ中に氷の上に置かれるべきです。
    1. この時点で、CF がまだトリプシン化されていない場合は、CM懸濁液を15 mL遠心管に保管し、蓋を緩めてガスの流れを可能にします。並行して、CF の関連付けを解除し、デバイスのロード用に 75 x 106 セル/mL の密度で収集します。
    2. 中断した CM と CF を 4:1 の比率で混合します。8 μLのCMのアリコートを取り、氷の上の新鮮な遠心管に加えます。その後、2 μL の CF を取り、遠心分離管の細胞懸濁液に加えます。
    3. 細胞懸濁液を再懸濁し、5.6μLの細胞懸濁液をつかみ、新鮮なマイクロ遠心チューブに入れます。
    4. 上記の手順で調製したコラーゲンの4 μLを取り、4:1 CM:CF混合物に追加します。成長因子低減(GFR)基膜マトリックスの2.4 μLを加え、最終的な細胞密度を35 x 106 細胞/mLとしてデバイス注入にします。混合物を上下にピペットし、細胞懸濁液が均質であることを確認する。
  6. デバイスの挿入
    注:セル:ヒドロゲル混合物が調製されたら、デバイスに挿入する必要があります。
    1. 80°Cのオーブンからオートクレーブされたマイクロ流体装置を取り出し、細胞懸濁液挿入の前に少なくとも1時間、バイオセーフティキャビネットにセットして、無菌性を維持しながらデバイスを室温まで冷却できるようにします。
    2. 60 x 15 mm のペトリ皿に装置を3~4個の装置で置きます。150 x 15 mm ペトリ皿に薄い層の DI H2 Oを充填し、60 x 15 mm ペトリ皿の 3 個を保持します。このステップはマイクロ流体装置を取り囲む加湿された環境を作成する。
    3. 新しい先端を使用し、チューブが氷の上に残っている間に懸濁液をピペット化することによって、セル:ヒドロゲル混合物を徹底的に再中断します。
    4. チップをデバイスの注入口に挿入し、20 μL ピペットチップを使用して、3 μLの細胞ハイドロゲル懸濁液をマイクロ流体デバイスの組織領域入口にゆっくりと着実に注入します。ポートがいっぱいになったら、注入を停止し、チップを取り外します。すべてのデバイス、または調製されたヒドロゲル懸濁液の全体について繰り返します。
      注:セルの小さなボリューム:ヒドロゲルサスペンションは非常に迅速に加熱/冷却するので、できるだけ長く氷の上にサスペンションを維持することが適切です。挿入する際、溶液を氷からピペットし、できるだけ早くデバイスに挿入し、ヒドロゲルがピペットチップで重合し始める可能性があります。一度にセル:ヒドロゲル懸濁液の少量を作成することが重要であるため、多くのデバイスを注入する場合は、4つのデバイスのセットごとにセル:ヒドロゲルサスペンションを新鮮にする必要があります。
    5. ピンセットでペトリ料理内のデバイスを反転し、水で大きなペトリ皿の中に置きます。ヒドロゲル重合のため9分間37°Cインキュベーターでインキュベート。
    6. インキュベーターからデバイスを取り出し、デバイスを直立させ、37°Cで9分間インキュベートしてヒドロゲル重合を完了します。
    7. RPMI + B27 + インスリンを隣接するメディアチャンネルに注入します(デバイスあたり20 μL程度)。デバイスをインキュベーターの 37 °C に戻します。 新鮮なRPMI + B27 +インスリンでメディアチャンネル内のメディアを毎日変更します。装置は14-21日20から培養されることを実証した。
      注:チップあたりのメディアの少量のため、メディアの蒸発を防ぐために、加湿チャンバとして機能するDI H2Oで満たされた大きなペトリ皿内のデバイスを維持することが重要です。さらに、過剰なRPMI + B27 +インスリンの小さな液滴は、ルーチンのメディア変更時にチャネル入口/出口の上部にピペット化することができます。

4. 組織分析

  1. ライブイメージング
    注:すべてのライブイメージングは、37°Cと5%CO2を維持するためにステージインキュベーターで行う必要があります。
    1. 環境に配慮したステージインキュベーターにデバイスを設置します。最大フレームレートで各デバイス内の複数のスポットの30 sのビデオを記録します。
    2. 拍動信号を抽出した後の組織の収縮性を評価するには、拍間インターバル変動を計算するために、補足のカスタム記述MATLABコードを使用してピーク(補足ファイル2)を抽出します。
    3. 細胞培養フード内のデバイス内の培地を変更し、細胞培養インキュベーターに戻します。
  2. 免疫蛍光染色
    1. PBS-グリシンを準備する: PBSで100 mMグリシンを溶解し、長期保存のために0.02%NaN3 を追加します。pH を 7.4 に調整します。
    2. PBS-Tween-20を準備する:PBSに0.05%Tween-20を追加し、長期保存のために0.02%NaN3 を追加します。pH を 7.4 に調整します。
    3. IFバッファを準備する:0.2%トリトンX-100、0.1%BSA、0.05%Tween-20をPBSに追加し、0.02%NaN3 を長期保存に追加します。pH を 7.4 に調整します。
    4. 10%ヤギ血清を調製:凍結乾燥したヤギの血清をPBSの2 mLで再中断し、100%ヤギ血清を作ります。その後、2 mLをPBS 18 mLで希釈し、10%のヤギ血清を作ります。
    5. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)を組織チャネルに加え、37°Cで20分間インキュベートしてサンプルを固定します。
    6. 室温で10分間培養するために、組織チャネル2xにPBS-グリシンを加えて細胞を洗浄します。
    7. PBS-Tween-20を室温で10分間加えて細胞を洗浄します。
    8. 室温で30分間、組織チャネルにIFバッファーを加えて細胞を透過させる。
    9. 室温で1時間組織チャネルに10%のヤギ血清溶液を加えることによって細胞をブロックする。
    10. 非共役一次抗体を所望の濃度で10%ヤギ血清で希釈し( 補足ファイル3を参照)、組織チャネルに加え、サンプルを一晩4°Cでインキュベートする。
    11. 翌日、PBS-Tween-20を組織チャネル3xに加えて、それぞれ室温で20分間洗浄します。
      注: ステップ 4.2.12 から、暗い環境ですべてのタスクを実行し、サンプルが光から保護されるようにします。
    12. PBS-Tween-20の二次抗体を所望の濃度で希釈し、遠心分離機を10,000 x g で10分間希釈して任意の沈殿物を採取し、組織チャネルに加えます。
    13. 30分から1時間後、PBS-Tween-20 3xでサンプルを室温で10分間洗浄します。
    14. 抗フェードまたは所望の取り付け媒体を組織チャネルに加えます。次いで、より高い倍率が望まれる場合には、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いてサンプルを画像化することができる。3D 組織全体を視覚化するために、異なる Z 平面の画像を積み重ねて再構築して、代表的な 3D 画像を形成することができます。

結果

HIPSCから高精製されたCMの集団を得るために、Lian分化プロトコル33 とトーヤマ精製ステップ34 の組み合わせを含む改変バージョンが使用される(実験タイムラインについては 図1A を参照)。ヒポプサはコロニー様で、〜85%コンフルエントで、CM分化の開始時に、通過の3〜4日後に文化全体に均等に広がる必要があります(図...

ディスカッション

細胞と細胞の相互作用が強化された生体外ヒト心臓組織モデルの形成とバイオミメティック3D構造は、基礎的な心血管研究および対応する臨床応用のために不可欠である。この概説されたプロトコルは、コラーゲンヒドロゲル内にカプセル化された結合性CFを有する幹細胞由来CMの共培養を用いて、天然心筋の複雑な細胞組成および構造をモデル化する役割を果たし、?...

開示事項

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

謝辞

#1653193 NSF CAREERアワード、アリゾナ生物医学研究委員会(ABRC)新調査官賞(ADHS18-198872)、このプロジェクトの資金源を提供してくれたフリン財団賞に感謝します。hiPSCラインSCVI20は、NIH R24 HL117756が出資するスタンフォード心臓血管研究所のジョセフ・C・ウー博士(MD)から入手しました。HiPSCライン、IMR90-4は、WiCell研究所55、56から得られました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.65 mL centrifuge tubesVWR87003-290
1 mm Biopsy punchVWR95039-090
1.5 mm Biopsy punchVWR95039-088
15 mL Falcon tubesVWR89039-670
18x18mm coverslipsVWR16004-308The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging
4% paraformaldehydeThermoFisher101176-014
6-well flat botttom tissue-culture platesVWR82050-844
B27 minus insulinLifeTechA1895602
B27 plus insulinLifeTech17504001
CHIR99021VWR10188-030
Collagen I, rat tailCorning47747-218
DMEM F12ThermoFisher11330057
DPBSThermoFisher21600069
E8ThermoFisherA1517001can also be made in house
EDTAVWR45001-122
Ethanol
FGM3VWR10172-048
GFR-MatrigelVWR47743-718
GlycineSigmaG8898-500G
Goat serumVWR10152-212
hESC-MatrigelCorningBD354277
IPA
IWP2SigmaI0536-5MG
KimwipesVWR82003-820
MTCSSigma440299-1L
NaN3SigmaS2002-25G
NaOHSigmaS5881-500G
Pen/StrepVWR15140122
Petri dish (150x15mm)VWR25384-326
Petri dish (60x15mm)VWR25384-092
Phenol RedSigmaP3532-5G
RPMI 1640ThermoFisherMT10040CM
RPMI 1640 minus glucoseVWR45001-110
Silicon Wafers (100mm)University Wafer1196
Sodium lactateSigmaL4263-100ML
SU8 2075MicrochemY111074 0500L1GL
SU8 DeveloperThermoFisherNC9901158
Sylgard ElastomerEssex BrownellDC-184-1.1
T75 flasksVWR82050-856
Triton X-100SigmaT8787-100ML
TrypLEThermoFisher12604021
Trypsin-EDTA (0.5%)ThermoFisher15400054
Tween20SigmaP9416-50ML
Y-27632Stem Cell Technologies72304
EVG620 AlignerEVG
Plasma cleaner PDC-32GHarrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 microscopeNikon
Leica SP8 Confocal microscopeLeica

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