미세 유체 플랫폼 내에서 3D 조직 된 인간 심장 조직 개발

요약

이 프로토콜의 목표는 심장 조직 공학, 약물 스크리닝 및 질병 모델링을 위해 심장 섬유아세포(CFs)와 공동 배양된 줄기 세포 유래 심근세포(CFs)로 구성된 고도로 정렬된 인간 심장 조직의 3차원(3D) 미세유체 모델의 개발을 설명하고 시연하는 것이다.

초록

전 세계적으로 사망의 주요 원인은 심혈관 질환 (CVD)으로 지속됩니다. 그러나, 심장 근육의 생리적, 생물학적 복잡성을 모델링, 심근, 시험관 내에서 달성하기 위해 악명 높게 어렵다. 주로, 장애물은 성인 또는 성인과 같은 표현형을 전시하고 성공적으로 심근의 세포 복잡성과 복잡한 3D 아키텍처를 복제 할 수있는 인간의 심근 세포 (CM)에 대한 필요성에 있다. 불행히도, 윤리적 우려와 가능한 1 차 환자 파생 인간 심장 조직의 부족으로 인해, CM의 최소한의 증식과 결합, 실행 가능한 인간 CM의 소싱은 심장 조직 공학을위한 제한 단계되었습니다. 이를 위해 대부분의 연구는 인간 CM의 주요 공급원으로 인간 유도만능 줄기 세포(hiPSCs)의 심장 분화로 전환되어 심장 조직 모델링을 위한 시험관 내의 hiPSC-CM을 광범위하게 통합하는 결과입니다.

여기서, 우리는 미세 유체 장치 내에서 3D 성숙한 줄기 세포 유래 인간 심장 조직을 개발하기위한 프로토콜을 시연한다. 당사는 hiPSC 유래 CM에서 3D 내 이소성 심장 조직-온-어칩 모델의 생성을 구체적으로 설명하고 시각적으로 시연합니다. 우리는 주로 CM을 위해 선택하는 정화 프로토콜, 인간 CF (hCs)와 CM을 혼합하여 정의된 비율을 가진 세포의 공동 배양, 콜라겐 기반 하이드로겔 내에서 이 공동 배양의 중단을 설명합니다. 우리는 또한 우리의 잘 정의 된 미세 유체 장치 내에서 세포 라덴 하이드로겔의 주입을 시연, 주변 세포와 하이드로 겔 매트릭스의 높은 수준의 정렬을 유도하기 위해 표면 지형 역할을 비틀 거리는 타원형 마이크로 포스트로 내장, 네이티브 심근의 아키텍처를 모방. 우리는 제안 된 3D anisotropic 심장 조직 -에 칩 모델은 기본 생물학 연구에 적합 하다는 것을 구상, 질병 모델링, 그리고, 스크리닝 도구로 그것의 사용을 통해, 제약 테스트.

서문

조직 공학 접근법은 최근 몇 년 동안 재생 의학 및 질병 모델링^1,2에서 생체 내 임상 연구 결과를 동반하기 위해 널리 탐구되었습니다. 특히 인체 1차 심장 조직을 소싱하고 생체외 대리에서 생리적으로 관련된 것을 생산하는 데 내재된 어려움으로 인해 체외 내 심장 조직 모델링에 중점을 두어 심혈관 질환(CVDs)^1,3의복잡한 메커니즘에 대한 근본적인 이해를 제한하고 있다. 전통적인 모델은 종종 2D 단층 문화 에세이를 포함했습니다. 그러나, 심근의 토착 경관과 복잡한 세포 상호 작용을 모방하기 위해 3D 환경 내에서 심장 세포를 배양하는 것의 중요성은^{광범위하게4,5를}특징으로 한다. 또한, 지금까지 생산된 대부분의 모델은 줄기 세포와 분화된 CM의 모노 배양을 포함하였다. 그러나, 심혼은 복잡한 3D 아키텍처⁷내에서 다중 세포 유형^6으로 이루어져 있으며, 본체 모델 내에서 조직 조성의 복잡성을 개선하여 토착 심근의 세포 성분을 더 잘 모방할 필요가 있다고 보증한다.

현재까지 심근^8의생체 모방 3D 모델을 생산하기 위해 많은 다른 접근법이 탐구되었습니다. 이러한 접근법은 박막(근육 박막(MTF)9에 시드된 모노 배양 CM에서부터 독립형 캔틸레버(EHTs)로 간주되는 3D 하이드로겔 매트릭스의 공동 배양 심장 세포에 이르기까지 생성된 힘의 실시간 계산을 허용하는 실험용 설정에서부터다양합니다. 다른 접근법은 조직 패치^11에서돌출 된 마이크로 포스트 중 현탁되는 3D 하이드로겔에서 모노 배양 CM에서 심근 적색을 모방하는 미세 몰딩 기술을 구현하는 데 중점을 두어 들여진 마이크로그루브(12,^13)에중점을 두고 있다. 이러한 각 방법에는 고유한 장점과 단점이 있으므로 의도된 적용 및 해당 생물학적 질문에 부합하는 기술을 활용하는 것이 관련되어 있다.

줄기 세포 유래 CM의 성숙을 향상 하는 능력은 성인 같은 심근 조직의 성공적인 체 외 공학 및 임상 해석에 후속 결과의 번역에 대 한 필수적이다. 이를 위해, CM을 성숙하는 방법은 2D 와 3D^14,15,16모두에서 널리 탐구되었습니다. 예를 들어, EHT에 통합된 전기 자극, 표면 지형과 CM의 강제 정렬, 신호 신호 신호, 공동 배양및/또는 3D 하이드로겔 조건에서 인한 성장 인자 등은 모두 세포 형태학, 칼슘 취급, 육종 구조, 유전자 발현 또는 수축력 중 적어도 하나에서 CM 성숙에 찬성하는 변화로 이어집니다.

이러한 모델 중, 미세 유체 플랫폼을 활용하는 접근 방식은 그라데이션 제어, 제한된 세포 입력 및 최소한의 필요한 시약과 같은 특성상 특정 이점을 유지합니다. 더욱이, 많은 생물학적 복제는 미세유체 플랫폼을 사용하여 한 번에 생성될 수 있으며, 생물학적 관심의 능력을 더 잘 해부하고 통계적^{힘(17,18,19)에}찬성하여 실험시 크기를 증가시키는 역할을 한다. 또한, 미세유체 장치 제조 공정에서 포토리소그래피를 사용하면 조직 재생 및 질병모델링에^대한 상이한 적용을 위해 주변 세포 구조 및 거시 수준의 조직^{아키텍처를}향상시키기 위해 중견수 큐역할을 하는 마이크로 및 나노 수준에서 정밀기능(예를 들어, 지형)을 생성할 수 있다.

우리는 이전에 표면 지형을 통합하는 새로운 3D 심장 조직 온 칩 모델의 개발을 시연, 타고난 타원형 마이크로 포스트의 형태로, 상호 연결된, 이소트로피 조직^(20)에하이드로겔 캡슐화 공동 배양 심장 세포를 정렬. 배양 14일 후, 미세유체 장치 내에서 형성된 조직은 단층 및 3D 이소트로픽^{대조군(23)과}비교했을 때 표현형, 유전자 발현 프로파일, 칼슘 취급 특성 및 제약 반응에서 더욱 성숙하다. 본 명세서에 기재된 프로토콜은 hiPSC 유래 CM을 사용하여 미세유체 장치 내에서 이러한 3D 공동 배양, 정렬(즉, 애니소트로픽) 인간 심장 조직을 만드는 방법을 설명한다. 구체적으로는 CM을 향해 hiPSC를 분화하고 정화하는 방법, 기존 공동 배양 인구를 생성하기 위한 CCF의 보충, 콜라겐 하이드로겔 내에 캡슐화된 세포 집단의 삽입, 수축 및 면역형을 통한 3D 건설 조직의 후속 분석 등을 설명한다. 그 결과 3D 엔지니어링 마이크로 조직은 기초 생물학 연구, CVD 모델링 및 제약 테스트를 포함한 다양한 응용 분야에 적합합니다.

프로토콜

바이오 세이프티 캐비닛 내에서 모든 세포 처리 및 시약 준비를 수행합니다. 세포와 접촉하는 모든 표면, 재료 및 장비가 멸균되었는지 확인하십시오 (즉, 70 %의 에탄올로 분무하십시오). 세포는 가습 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양되어야 한다. 모든 hiPSC 문화와 차별화는 6웰 플레이트로 수행됩니다.

1. 미세 유체 장치 생성 (대략적인 기간 : 1 주)

1. 포토리스소그래피
   참고: CAD 파일을 사용하여 설계된 마스크(보충 파일 1로제공됨)에는 미세유체 채널의 설계가 포함되어 있습니다. 투명 마스크에 디자인을 인쇄합니다. 그런 다음 클린룸 내의 4인치 실리콘 웨이퍼에서 음의 포토레지스트 SU8 2075로 표준 포토리소그래피를 수행합니다.
   1. 이소프로필 알코올(IPA)으로 실리콘 웨이퍼를 청소하고 질소로 건조시다. 탈수시 5분간 200°C에서 굽습니다.
      참고: 웨이퍼 핀셋으로 웨이퍼를 처리합니다.
   2. 웨이퍼를 스핀 코트에 놓습니다. 웨이퍼 의 중앙에 3-4 mL의 SU8을 입금한 다음 스핀하여 200 μm의 층을 형성합니다 (즉, 15 s에서 500 rpm까지 경사로, 10 s, 5 s에서 1,200 rpm까지 회전, 30 s까지 회전 한 다음 정지 될 때까지 15 s의 다운 스핀).
   3. 웨이퍼와 부드러운 베이킹을 65°C에서 7분간, 95°C에서 45분간 제거합니다.
   4. 웨이퍼를 마스크 정렬기로 이동하고 UV 필터를 사용하여 투명 마스크를 마스크 홀더에 배치합니다. 웨이퍼를 230mJ/cm^2의2사이클에 노출하고, 30s 지연으로, 총 노출량은 460mJ/cm^2이다.
   5. 노출 후 웨이퍼에 대해 하룻밤 사이에 50°C 오븐에서 굽는 다.
   6. 다음날 아침 오븐을 끄고 웨이퍼가 실온으로 냉각된 후 SU8 개발자에게 담급니다. 개발자로부터 웨이퍼를 5분마다 제거하고 IPA로 세척한 다음 다시 개발자에 배치합니다.
   7. 약 20 분 후, 또는 IPA가 명확 실행 될 때, 공기 질소와 하드 베이킹 150 °C로 설정 오븐에서 웨이퍼를 건조; 오븐이 150 °C에 도달하면 꺼지지만 열지 마십시오. 실온에 도달할 때까지 웨이퍼를 오븐에 넣고 웨이퍼를 제거합니다.
   8. 능숙계와 가벼운 현미경으로 광학 기능으로 SU8의 높이를 확인합니다. 확인되면 웨이퍼를 150mm 플라스틱 페트리 접시 안에 테이프로 넣습니다.
2. 소프트 리소그래피
   참고: 페트리 접시에 테이프로 붙인 웨이퍼는 SU8 기능에 대한 PDMS의 준수를 방지하기 위해 격리되어야 합니다.
   1. 웨이퍼(플라스틱 페트리 접시에 도청)를 메틸트리클로로실레인(MTCS)의 0.4mL를 함유한 동일한 크기의 페트리 접시 위에 뒤집어 서 웨이퍼를 증기에 4분 동안 노출시키세요. 웨이퍼를 똑바로 세워 페트리 접시에 뚜껑을 놓습니다.
   2. 실리콘 엘라스토머 베이스 30g을 경화제에 10:1 비율로 섞는다. 페트리 접시에서 뚜껑을 꺼내 웨이퍼에 폴리디메틸실록산(PDMS)을 부은 다음 건조기 내에서 데가스를 드린다.
   3. 모든 거품이 사라지면 웨이퍼를 80°C에서 1.5h로 배치하여 PDMS를 치료합니다.
   4. PDMS를 조심스럽게 벗겨내고, 각각 1mm 및 1.5mm 생검 펀치로 조직 포트 및 미디어 채널을 위한 인렛과 콘센트를 펀치합니다.
   5. 먼지를 제거하기 위해 테이프로 PDMS 채널을 청소하십시오. 다음으로 커버립(18 x 18mm, No.1)을 70% 에탄올에 15분 이상 담가 둡니다. 그런 다음 조직 물티슈로 건조하십시오.
   6. 커버립과 PDMS 채널(피처 사이드 노출)을 플라즈마(높음 설정)에 1분 동안 피사체를 한 다음, 빠르게 결합하여 하룻밤 동안 80°C 오븐에 배치하여 결합을 확보합니다.
      참고: 본딩 하는 동안, 채널 붕괴를 방지 하기 위해 채널 자체를 피하면서 PDMS와 유리 사이 좋은 씰을 보장 하기 위해 PDMS 채널의 가장자리에 가벼운 압력을 적용 하는 것이 필수적이다.
3. 장치 준비
   1. 본딩 된 PDMS 장치를 탈온 된 물 (DI H₂O)에 담그고 액체 사이클로 오토클레이브하십시오. 다음으로, 장치에서 액체를 흡인하고 중력 주기로 다시 오토클레이브합니다. 그런 다음 멸균 장치를 밤새 80°C에서 탈수합니다.

2. 줄기 세포 배양 (대략적인 기간: 1-2 개월)

1. hiPSC 문화 및 유지 보수
   참고: hiPSC는 냉동 보존 또는 분화 전에 시험관에서 해동 한 후 3 개의 연속 구절을 배양해야합니다. hiPSC는 세포주에 따라, 지하 막 매트릭스 코팅^{플레이트(24)에}E8 또는 mTeSR1 배지에서 배양된다.
   1. hESC-품질의 지하 멤브레인 매트릭스로 플레이트를 코팅하려면, 얼음 에 DMEM/F-12K의 25mL에 추가하여 매트릭스 매체(로트 의존량, 일반적으로 200-300 μL; -80°C에 저장됨)의 알리쿼트 1개를 해동한다. 이 서스펜션의 1mL를 6웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 플레이트를 37°C에서 37°C에서 적어도 1시간 동안 둡니다.
   2. 해동 시 Y-27632 25(E8+RI)의 5μM을 추가하여 hiPSC 배양을 위한 E8 미디어를 수정합니다. 이후에 이 미디어를 24시간 동안 사용한 다음 미디어를 신선한 E8로 변경합니다.
      참고: 일상적인 미디어 변경의 경우 수정되지 않은 E8 미디어는 hiPSC 문화에 사용됩니다. 정기적인 유지 관리를 위해 E8 미디어는 이전 미디어 변경 후 약 24시간 씩 매일 변경되어야 합니다.
   3. 3일 또는 4일째에, 흡인 매체에서 세포를 통과한 다음, 1x 덜벡코의 인산염 완충액(DPBS)의 1mL로 각각 잘 씻는다.
      참고: 세포가 약 70% 컨실수 있는지 확인합니다. 그들이 70 % 이상의 인플루엔자를 하지 못하게하십시오.
   4. DPBS를 흡습한 다음 각 우물에 0.5mMM EDTA의 1mL을 추가하고 실온에서 6-7 분 동안 배양하십시오.
   5. 신중하게 EDTA를 흡용, 각 우물에 E8 + RI의 1 mL을 추가하고 1mL 파이펫 (~5-10 시간 모든 세포를 수집)와 표면에 대해 폭발. 15 mL 마이크로 센심 분리기 튜브에서 세포 현탁액을 수집합니다.
   6. E8+RI에서 원하는 세포 밀도(즉, 웰당 ~200K)에서 세포 현탁액 및 통로를 계산합니다.
   7. 미디어를 Ri 없이 E8로 변경한 후 24시간 이후에 미디어를 변경합니다. 24시간 이상 RI로 셀을 두지 마십시오.
      참고: E8은 37°C로 가열해서는 안 됩니다. 항상 세포 배양 전에 온난화를 위해 실온에서 둡니다.
2. 심근세포(CM) 방향 분화
   참고: hiPSCs^26,27의상이한 선 들 사이에서 이질성의 존재를 주목하는 것이 중요하므로 각 세포주에 대해 다음 단계를 최적화해야 할 수도 있습니다. CM 차별화를 위해 아래 단계를 따르십시오.
   1. RPMI + B27 - 인슐린을 10mL의 인슐린을 뺀 인슐린과 5mL의 페니실린/연쇄절제술(펜/스트렙)을 RPMI 1640의 500mL에 첨가하여 준비한다.
   2. RPMI + B27 + 인슐린을 RPMI 1640의 500 mL에 B27 및 5 mL의 펜 / 스트렙을 추가하여 준비하십시오.
   3. RPMI 마이너스 포도당 + B27 + 인슐린을 B27 10mL, 펜/스트렙 5mL, 4mM 나트륨 락테이트 500mL의 포도당 없이 RPMI 1640을 첨가하여 준비하십시오.
   4. hiPSC가 85%에 도달하면 RPMI + B27의 4mL로 구 배지를 교체하여 분화(0일)를 시작하십시오- 6웰 플레이트의 각 웰에 10 μM CHIR99021을 함유한 인슐린 배지(즉, 10m CHIR99021의 25 μL를 RPMI + B27- 인슐린 당 25mL로 추가).
      참고: CHIR99021은 GSK 억제제이며 Wnt 활성화로 이어집니다. CHIR99021 및 초기 연결성의 최적 농도는 각^{세포주(28)에}따라 다릅니다. 항상 6-12 μM CHIR99021의 농도 그라데이션과 실제 실험 전에 일련의 파종 밀도를 확인하여 분화를 시작하기위한 최적의 조건을 결정합니다.
   5. 정확히 24 시간 후 (1 일 차), 매체를 흡인하고 사전 조립RPMI + B27의 5 mL로 대체 - 각 우물에 인슐린.
   6. CHIR99021 추가 후 정확히 72h (3일차), 6웰 플레이트의 각 웰에서 소비된 배지의 2.5mL를 수집하여 튜브내 소비 된 배지의 총 15 mL을 수집합니다.
   7. 이에, 신선한 RPMI + B27의 15 mL을 추가 - 인슐린 매체. 결합된 중간 튜브에 5 μM의 농도에 IWP2를 추가합니다(즉, 1mL당 5mM에서 IWP2의 1 μL 또는 IWP2의 30 μL을 30총 mL 미디어에 넣음).
   8. 중간 크기의 1mL가 유지되도록 플레이트의 웰당 나머지 배지의 ~1.5mL를 제거합니다. 세포 잔해를 적절히 제거하기 위해 플레이트를 힘차게 소용돌이시다. 이어서, 기존 배지의 나머지 부분을 흡인시키고 플레이트의 웰당 IWP2를 함유하는 결합된 배지의 5mL를 추가한다.
      참고: IWP2를 세포에 첨가하면 Wnt 억제가 이어집니다.
   9. 5일째에, 각 우물에서 매체를 흡인하고 미리 따뜻해진 RPMI + B27 - 인슐린의 5mL로 대체하십시오.
   10. CM 성숙: 7일째, 9일째, 11일째에 각 우물에서 배지를 흡인하고 예동된 RPMI + B27 + 인슐린 5mL로 대체하십시오. 자발적인 구타는 요즘 주위에 관찰되어야한다.
   11. CM 정화: 13일과 16일일에는 각 우물에서 배지를 심고, 1mL의 1mL로 잘 씻은 다음, 예열된 RPMI 마이너스 포도당 + B27 + 인슐린을 추가하여 4mM 나트륨 젖산으로 보충하여 포도당 기아를 시작합니다.
   12. 19일째에, 소비된 매체를 흡습하고 정제 후 세포 회복을 허용하기 위해 각 웰에 미리 따뜻진 RPMI + B27 + 인슐린5mL로 대체한다.
   13. 21일째, 하표세포는 아래 설명된 CM 해리 프로토콜(3.3단계)에 따른 것이다. 6웰 플레이트에서 잘 1.5-2 x 10⁶ 셀을 플레이트하는 것을 목표로합니다. 예를 들어, 고효율 차별화인 경우 일반적으로 6개의 우물을 9개의 우물로 확장하는 것이 좋습니다.
   14. 21일부터 각 우물에서 배지를 흡인하고 2-3일마다 RPMI + B27 + 인슐린 4mL로 교체하십시오.
       참고: hiPSC-CM은 23일 이후 실험용으로 사용할 수 있습니다.

3. 미세 유체 장치 내에서 3D 심장 조직의 생성 : (대략적인 기간 : 2-3 시간)

1. hCF 문화
   1. 배양 인간 심실 심장 섬유아세포 (hCFs; Lonza에서 상업적으로 얻은) T75 플라스크에서 (플라스크 당 250K 세포에서) 섬유 아세포 성장 미디어-3 (FGM3). 매일 미디어를 변경하고 70 %의 컨할 때 통과하십시오. 그들은 높은 구절^(29)에서근섬유 세포에 분화하기 시작할 수 있기 때문에, 통과 10 전에 hCFs를 사용합니다.
2. hCF 해리
   1. hCF를 해리하려면 먼저 인큐베이터에서 플라스크를 꺼낸다. 생물 안전 캐비닛 내부에 플라스크를 넣고 플라스크에서 소비 된 미디어를 심미하기 시작합니다. 그런 다음 T75 플라스크를 1x DPBS 3mL로 세척합니다. 캡을 닫고 플라스크를 소용돌이시다.
   2. DPBS를 흡인합니다. 예동 1x 트립신-EDTA(0.05%) 3mL 섭취 플라스크에 추가합니다. 플라스크를 기울이고 소용돌이하여 바닥을 코팅합니다. 37°C 인큐베이터에 4-6분 동안 두어 현미경으로 플라스크를 검사하여 둥근 세포 모양과 부동 세포를 통해 입증된 바와 같이 세포가 분리되도록 한다. 그렇지 않은 경우 플라스크를 인큐베이터에 다시 넣고 1분 간 다시 넣습니다.
   3. 플라스크에 미리 따뜻해진 FGM33mL3mL을 추가하여 트립신 액션을 중화시다. 그런 다음 솔루션을 플라스크 바닥에 위아래로 대고 피펫하여 CF를 제거합니다.
   4. 15 mL 마이크로 센심 분리기 튜브에서 세포 현탁액을 수집합니다. 세포 현탁액의 10 μL을 가지고 현미경으로 세포를 계산하기 위해 혈류계에 분배하십시오.
   5. 4 분 동안 200 x g에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 셀 펠릿을 방해하지 않도록 주의하는 슈퍼 내피를 흡인합니다.
   6. 원하는 75 x 10⁶ 셀/mL을 만들기 위해 신선한 FGM3에서 펠릿을 다시 놓습니다. 일부(T75 플라스크 당 250K 세포)를 통과하거나 아래 프로토콜을 따라 3D 심장 조직을 생성합니다.
3. CM 해리
   참고: 분화 및 정제 후, 마이크로 유체 장치에 주입에 사용하기 위해 CM을 준비합니다.
   1. CM 접시를 인큐베이터에서 꺼내 미디어를 흡인합니다. 그런 다음 6웰 플레이트당 1mL의 1x DPBS로 우물을 씻습니다. 잘 당 DPBS와 파이펫 1 mL의 6 mL을 가져 가라.
   2. DPBS를 흡인하되어 플레이트에 부착된 세포를 방해하지 않도록 주의하십시오. 파이펫 6 mL의 따뜻한 셀 분리 용액 (예 : 트립LE 익스프레스)과 웰 당 1 mL을 추가합니다. 세포를 37°C 인큐베이터에서 10분 동안 배양한다.
   3. RPMI + B27+ 인슐린(즉, 웰당 1mL)의 동일한 부피로 효소를 중화하고 1mL 파이펫으로 배양 용기에 대해 위아래로 피펫을 하여 세포를 기계적으로 해리시화합니다.
   4. 15mL 원심분리기 튜브에서 CM을 수집합니다. 3분 동안 300 x g의 원심분리기.
   5. 상체를 흡인합니다. RPMI + B27 + 인슐린의 5 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 적절한 혼합을 보장하기 위해 1mL 파이펫으로 용액을 위아래로 피펫합니다. 세포 현탁액의 10 μL을 복용하고 혈류계에 분배하여 총 세포 수를 결정합니다.
   6. 3 분 동안 300 x g에서 세포를 다시 원심 분리하고 (트립을 완전히 제거하려면) 슈퍼 나티블을 흡인시합니다. 그런 다음 75 x 10⁶ 세포 /mL을 달성하기 위해 RPMI + B27 + 인슐린의 적절한 볼륨을 추가하십시오.
      참고: cTnT와 같은 CM 특이적 단백질에 대한 면역 염색 또는 유동 세포형을 통해 입증된 바와 같이 심장 분화/선택이 높은 CM%(즉, >80%)를 초래하지 않는 경우, 세포가 조직 형성에 적합하다고 생각하지 않는다. CHIR99021 농도 및 초기 시작 밀도의 조정을 통해 발생하는 경우 분화 공정을 최적화해야 합니다. CM 정제가 개선이 필요한 경우, 형광 활성화 셀 정렬(FACS) 또는 자기 활성화 셀 정렬(MACS)^30,31,32를가진 CM을 분류하는 것과 같은 다른 방법을 활용할 수 있다.
4. 콜라겐 제제
   참고: 콜라겐 스톡의 고농도에서 콜라겐을 준비합니다(8-11 mg/mL에 해당). 세포를 만드는 데 사용되는 콜라겐: 하이드로겔 혼합물은 6 mg/mL이며 최종 농도는 2 mg/mL입니다. 주입할 장치 수에 따라 콜라겐 솔루션의 양을 다시 계산해야 합니다.
   1. 필요한 모든 시약을 생물 안전 후드 내부에 얼음에 보관하십시오.
      참고: 콜라겐은 열반응하이드로겔입니다. 따라서, 온도는 조기 중합을 방지하기 위해 낮은 유지해야합니다.
   2. 75 μL의 스톡 콜라겐(8 mg/mL)을 얼음 위에 미세원심분리기 튜브에 분배하십시오. 콜라겐 용액은 매우 점성이 있으므로 파이펫으로 천천히 흡입합니다.
   3. 13.85 μL의 미디어(예: RPMI + B27 + 인슐린)를 동일한 튜브로 분배하십시오.
   4. 그런 다음 페놀 레드 의 10 μL을 가지고 혼합물에 추가하고 다시 중단합니다.
   5. 마지막으로, 1N NaOH의 1.15 μL을 복용하여 서스펜션에 추가하십시오.
   6. 200 μL 파이펫 팁을 사용하여 서스펜션을 다시 일시 중지합니다.
      참고 : 주식 콜라겐은 산성 pH를 가지고 있으며, 심장 세포를 캡슐화하기 위해 사용하기 전에 중화하기 위해 NaOH를 첨가해야합니다. 페놀 레드는 pH 표시기역할을 한다. 따라서 NaOH 추가 전에 이 것을 추가합니다. 이 시점에서 콜라겐 용액은 산도를 나타내는 노란색이 될 것입니다. NaOH가 추가된 후, 솔루션은 주황색을 밝은 분홍색으로 전환하여 중화를 나타냅니다.
5. 하이드로겔 혼합물 및 세포 제제
   참고: 이 단계에서는 콜라겐 계 하이드로겔 내의 세포의 캡슐화가 수행됩니다. 모든 하이드로겔 전구체뿐만 아니라 세포는 다음 단계 동안 얼음 위에 두어야합니다.
   1. 이 시점에서, CF가 아직 트립시화되지 않은 경우, 37°C 인큐베이터 내에서 가스 흐름을 허용하기 위해 뚜껑이 풀려있는 15 mL 원심분리기 튜브에 CM 서스펜션을 저장합니다. 동시에, CF를 해리하고 장치 로딩을 위해 75 x 10⁶ 셀/mL의 밀도로 수집합니다.
   2. 일시 중단된 CM을 4:1 비율로 CF와 혼합합니다. 8 μL의 CM을 알리쿼트하고 얼음 위에 신선한 원심분리기 튜브를 추가합니다. 그런 다음 2 μL의 CF를 복용하고 원심 분리관의 세포 현탁액에 추가하십시오.
   3. 세포 현탁액을 다시 중단하고, 세포 현탁액의 5.6 μL을 잡고, 신선한 미세 원심 분리튜브에 넣습니다.
   4. 위의 단계에서 준비된 콜라겐의 4 μL을 복용하고 4:1 CM:CF 혼합물에 추가하십시오. 성장 인자 감소(GFR) 지하 멤브레인 매트릭스의 2.4 μL을 추가하여 최종 세포 밀도를 장치 주입을 위한 35 x 10⁶ 세포/mL로 만듭니다. 세포 현탁액이 균일하다는 것을 보장하기 위해 혼합물을 위아래로 피펫합니다.
6. 장치 삽입
   참고: 셀:하이드로겔 혼합물이 준비되면 장치에 삽입해야 합니다.
   1. 80°C 오븐에서 오토클레이브 된 미세 유체 장치를 꺼내 세포 서스펜션 삽입 전에 적어도 1 시간 동안 생물 안전 캐비닛에 설정하여 장치가 멸균을 유지하면서 실온으로 냉각 될 수 있도록하십시오.
   2. 60 x 15mm 페트리 접시에 장치를 놓고 접시 당 3-4 장치에 놓습니다. 150 x 15mm 페트리 접시에 얇은 레이어 DI H₂O를 채우고 60 x 15mm 페트리 요리 중 3개에 보관하십시오. 이 단계는 미세 유체 장치를 둘러싼 가습 환경을 만듭니다.
   3. 새로운 팁을 사용하고 튜브가 얼음 위에 남아있는 동안 서스펜션을 파이프팅하여 셀을 철저히 재중단합니다.
   4. 장치의 사출 포트에 팁을 삽입하고 천천히 꾸준히 세포의 3 μL을 주입 : 하이드로겔 현탁액은 20 μL 파이펫 팁을 사용하여 미세 유체 장치의 조직 영역 입구에 침입한다. 포트가 채워지면 주입을 중지하고 팁을 제거합니다. 모든 장치 또는 준비된 하이드로겔 서스펜션 전체에 대해 반복하십시오.
      참고: 셀의 소량:하이드로겔 서스펜션은 매우 빠르게 가열/냉각되므로 가능한 한 오랫동안 얼음에 서스펜션을 유지하는 것이 관련이 있습니다. 삽입할 때, 하이드로겔이 파이펫 끝에서 중합되기 시작할 수 있기 때문에, 얼음에서 용액을 피펫하고 가능한 한 빨리 장치에 삽입한다. 셀의 소량을 만드는 것이 중요합니다: 하이드로겔 현탁액은 한 번에, 그래서 많은 장치를 주입하는 경우에, 셀: 하이드로겔 현탁액은 4 개의 장치의 각 세트에 대해 신선하게 만들어져야 할 것이다.
   5. 페트리 요리 에 핀셋으로 장치를 뒤집어 물로 큰 페트리 접시 안에 놓습니다. 하이드로겔 중합화를 위해 9분 동안 37°C 인큐베이터에서 인큐베이터에 인큐베이션합니다.
   6. 인큐베이터에서 장치를 꺼내 장치를 똑바로 뒤집고 37°C에서 9분 동안 배양하여 하이드로겔 중합화를 완료하십시오.
   7. 측면 미디어 채널에 RPMI + B27 + 인슐린을 주입합니다(장치당 ~20 μL). 장치를 인큐베이터에 37°C로 다시 배치합니다. 매일 신선한 RPMI + B27 + 인슐린으로 미디어 채널 내에서 미디어를 변경합니다. 이 장치는 14일부터^{21일까지 20일 동안}배양되는 것으로 입증되었습니다.
      참고: 칩당 소량의 미디어로 인해 미디어의 증발을 방지하기 위해 가습 챔버 역할을 하는 DI H₂O로 채워진 대형 페트리 접시 내에서 장치를 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 초과 RPMI + B27 + 인슐린의 작은 방울은 일상적인 미디어 변화 동안 채널 입구 / 콘센트의 상단에 파이펫 될 수있다.

4. 조직 분석

1. 라이브 이미징
   참고: 모든 라이브 이미징은 37°C 및 5% CO_2를유지하기 위해 단계 인큐베이터로 수행해야 합니다.
   1. 장치를 환경 제어 단계 인큐베이터에 배치합니다. 최대 프레임 속도로 각 장치 내에서 여러 반점의 30s 비디오를 녹화합니다.
   2. 구타 신호를 추출한 후 조직 수축을 평가하기 위해, 비비트 간격 가변성을 계산하기 위해피크(보충 파일 2)를추출하기 위해 추가 맞춤 작성 MATLAB 코드를 사용합니다.
   3. 세포 배양 후드의 장치에서 미디어를 변경한 다음 세포 배양 인큐베이터에 다시 배치합니다.
2. 면역형광 염색
   1. PBS-글리신 준비: PBS에 100mM 글리신을 녹이고 장기 보관을 위해 0.02% NaN_3을 추가합니다. pH를 7.4로 조정합니다.
   2. PBS-Tween-20 준비: PBS에 0.05% Tween-20을 추가하고 장기 저장을 위해 0.02% NaN_3을 추가합니다. pH를 7.4로 조정합니다.
   3. IF 버퍼 준비: PBS에 0.2% 트리톤 X-100, 0.1% BSA, 0.05% Tween-20을 PBS에 추가하고 장기 저장을 위해 0.02% NaN_3을 추가합니다. pH를 7.4로 조정합니다.
   4. 10% 염소 세럼 준비: 100% 염소 세럼을 만들기 위해 PBS의 2mL에서 lyophilized 염소 세럼을 다시 중단합니다. 그런 다음 PBS 18mL로 2mL를 희석하여 염소 세럼을 10% 만듭니다.
   5. 조직 채널에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 추가하고 37°C에서 20분 동안 배양하여 시료를 수정합니다.
   6. 실온에서 10분 동안 조직 채널2x에 PBS-글리신을 추가하여 세포를 세척한다.
   7. 실온에서 10 분 동안 PBS -Tween-20을 추가하여 세포를 씻으마십시오.
   8. 실온에서 30분 동안 조직 채널에 IF 버퍼를 추가하여 세포를 투과화한다.
   9. 실온에서 1h에 대한 조직 채널에 10 % 염소 혈청 용액을 추가하여 세포를 차단하십시오.
   10. 비-컨쥬게이드 1차 항체를 원하는 농도(보충 파일 3참조)에서 10% 염소 세럼으로 희석시키고, 조직 채널에 추가하고, 하룻밤 사이에 4°C에서 샘플을 배양한다.
   11. 다음 날, 실온에서 각각 20분 동안 조직 채널 3x에 PBS-Tween-20을 추가하여 샘플을 세척합니다.
       참고: 4.2.12 단계에서 는 어둠 속에서 모든 작업을 수행하므로 샘플이 빛으로부터 보호됩니다.
   12. PBS-Tween-20의 이차 항체를 원하는 농도로 희석하고, 원심분리기는 10분 동안 10,000 x g에서 원심분리기를 희석하여 침전물을 수집한 다음 조직 채널에 추가합니다.
   13. 30 분 -1 시간 후, 실온에서 각각 10 분 동안 PBS-Tween-20 3x로 샘플을 세척하십시오.
   14. 조직 채널에 페이드 방지 또는 원하는 장착 매체를 추가합니다. 이어서, 샘플은 형광 현미경을 사용하거나 공초점 현미경으로 이미지화될 수 있으며, 더 높은 배율이 바람직한 경우. 전체 3D 조직을 시각화하려면 서로 다른 z-평면의 이미지를 적층및 재구성하여 대표적인 3D 이미지를 형성할 수 있습니다.

결과

hiPSC로부터 매우 정제된 CM 군수를 얻으려면 Lian 분화^{프로토콜(33)과} 도야마 정화^{단계(34)의} 조합을 포함하는 수정된 버전이 사용됩니다(실험 타임라인을 위한 도 1A 참조). hiPSC는 콜로니와 같은 , ~85% 컨서블이 되어야 하며, CM 분화(도1B)의발병 시, 통과 후 3~4일 후에 문화 전체에 균등하게 확산되어야 한다. 구체적으로, ...

토론

향상된 세포 세포 상호 작용 및 생체 모방 3D 구조를 가진 체외 인간 심장 조직 모델의 형성은 기본적인 심혈관 연구 및 상응하는 임상 응용^1에필수적이다. 이 설명된 프로토콜은 콜라겐 하이드로겔 내에 캡슐화된 결합 식 CF와 줄기 세포 유래 CM의 공동 배양을 사용하여, 토착 심근의 복잡한 세포 조성 및 구조를 모델링하기 위해 봉사하는 미세 유체 장치 내의 3D 인간 이소?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.65 mL centrifuge tubes	VWR	87003-290
1 mm Biopsy punch	VWR	95039-090
1.5 mm Biopsy punch	VWR	95039-088
15 mL Falcon tubes	VWR	89039-670
18x18mm coverslips	VWR	16004-308	The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging
4% paraformaldehyde	ThermoFisher	101176-014
6-well flat botttom tissue-culture plates	VWR	82050-844
B27 minus insulin	LifeTech	A1895602
B27 plus insulin	LifeTech	17504001
CHIR99021	VWR	10188-030
Collagen I, rat tail	Corning	47747-218
DMEM F12	ThermoFisher	11330057
DPBS	ThermoFisher	21600069
E8	ThermoFisher	A1517001	can also be made in house
EDTA	VWR	45001-122
Ethanol
FGM3	VWR	10172-048
GFR-Matrigel	VWR	47743-718
Glycine	Sigma	G8898-500G
Goat serum	VWR	10152-212
hESC-Matrigel	Corning	BD354277
IPA
IWP2	Sigma	I0536-5MG
Kimwipes	VWR	82003-820
MTCS	Sigma	440299-1L
NaN3	Sigma	S2002-25G
NaOH	Sigma	S5881-500G
Pen/Strep	VWR	15140122
Petri dish (150x15mm)	VWR	25384-326
Petri dish (60x15mm)	VWR	25384-092
Phenol Red	Sigma	P3532-5G
RPMI 1640	ThermoFisher	MT10040CM
RPMI 1640 minus glucose	VWR	45001-110
Silicon Wafers (100mm)	University Wafer	1196
Sodium lactate	Sigma	L4263-100ML
SU8 2075	Microchem	Y111074 0500L1GL
SU8 Developer	ThermoFisher	NC9901158
Sylgard Elastomer	Essex Brownell	DC-184-1.1
T75 flasks	VWR	82050-856
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
TrypLE	ThermoFisher	12604021
Trypsin-EDTA (0.5%)	ThermoFisher	15400054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Y-27632	Stem Cell Technologies	72304
EVG620 Aligner	EVG
Plasma cleaner PDC-32G	Harrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 microscope	Nikon
Leica SP8 Confocal microscope	Leica