成人ゼブラフィッシュを用いた学習・記憶研究における認知評価のための連想学習ツールとしてのシャトルボックスアッセイ

要約

学習と記憶は、発達障害、疾患依存性、または環境に依存する認知障害の研究において強力な指標です。ほとんどの認知評価には、特殊な機器と広範な時間のコミットメントが必要です。しかし、シャトルボックスアッセイは、従来のゲルボックスを利用して、成体ゼブラフィッシュ認知の迅速かつ信頼性の高い評価を行う自動調整学習ツールです。

要約

学習障害や記憶障害を含む認知障害は、様々な発達および加齢性神経変性疾患および外傷性脳損傷(TBI)の主要な症状である。ゼブラフィッシュは、開発中の透明性と神経外傷後の堅牢な再生能力のために重要な神経科学モデルです。ゼブラフィッシュには様々な認知テストが存在する一方で、迅速な認知評価のほとんどは非連想学習を調べる。同時に、連想学習アッセイは、多くの場合、数日または数週間を必要とします。ここでは、有害な刺激(感電)を利用し、必要な準備時間を最小限に抑える、迅速な連想学習試験について述べています。ここに示されるシャトルボックスのアッセイは、初心者の研究者にとって理想的で、最小限の機器を必要とします。我々は、TBIに続いて、このシャトルボックステストが認知障害と若いゼブラフィッシュから古いゼブラフィッシュへの回復を再現的に評価することを実証する。さらに、アッセイは即時または遅延メモリを調べるために適応可能である。我々は、単一のTBIと繰り返されるTBIイベントの両方が学習と即時記憶に悪影響を及ぼすが、遅延メモリではないことを示す。したがって、我々は、シャトルボックスアッセイが認知障害の進行と回復を再現的に追跡すると結論付ける。

概要

学習と記憶は、老化、神経変性疾患、または傷害のために起こる認知障害の指標として日常的に使用されています。外傷性脳損傷(TI)は、認知障害をもたらす最も一般的な傷害である。TISは、前頭側頭型認知症や^{パーキンソン病1、2}などのいくつかの神経変性疾患との関連のために懸念が高まっている。さらに、一部のTBI患者において観察されたβ-アミロイド凝集の増加は、アルツハイマー病^3,4の発症にも関連している可能性があることを示唆している。TISはしばしば鈍い力の外傷の結果であり、軽度の脳損傷(miTBI)が最も一般的である重度^の範囲をまたがる。しかし、miTIsは短期間だけ軽度の認知障害を引き起こし、負傷した個人は通常^完全に6回復するため、報告されず、誤診されることが多い。対照的に、miTBIイベントの繰り返しは、若年および中年の成人に非常に普及しており^、時間7を経て蓄積し、認知発達を損なう可能性があり、中等度または重度のTBI⁸を経験する個人と同様に、神経変性疾患^{1、2、3、4、5}を悪化させるため、懸念が高まっている。

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、神経科学における様々なトピックを探索するための有用なモデルであり、中枢神経系^{9、10、11、12、13}を通して失われたまたは損傷したニューロンを再生する能力を含む。神経再生は、後頭領域にアーキマリウムを含むテレンスファルンでも実証された。この神経解剖学的領域は海馬に類似しており、魚の認知とヒト^14、15、16の短期記憶のために必要とされる可能性が高い。さらに、ゼブラフィッシュの挙動は^、17を広範囲に特徴付け、カタログ化されている。学習は、驚くべき応答¹⁸への慣化を含む様々な技術を通じて研究されてきたが、これは短いブロックで行われ、急速な減衰時間¹⁹に注意を払って行われるときの非連想学習の急速な形態を表すことができる。Tボックス、プラス迷路、視覚差別^20、21などの連想学習のより複雑なテストが使用されますが^、多くの場合、時間がかかり、準備の数日または数週間を必要とし、浅瀬または肯定的な補強に依存しています。ここでは、連想学習と即時記憶または遅延メモリの両方を評価するための迅速なパラダイムについて説明します。このシャトルボックスアッセイは、鈍い力TBIに続く認知障害と回復を評価するために回避刺激および否定的な補強コンディショニングを使用する。我々は、損傷を受けていない対照成類のゼブラフィッシュ(8〜24ヶ月)が、観察者間で高い一貫性を持つシャトルボックス内の20回の試験(<20分の評価)以内に赤色光を避けることを再現的に学ぶことを実証する。さらに、シャトルボックスを使用すると、成人(生後8~24ヶ月)の学習能力と記憶能力が一貫しており、異なるTBIの重大な障害または繰り返しTBIの間に重大な障害を持つ認知をアッサングするのに有用であることを実証しています。さらに、この方法は、成人ゼブラフィッシュにおける認知の維持または回復に影響を与える幅広い疾患の進行または薬物介入の有効性を追跡するための指標として迅速に採用することができる。

ここでは、複雑な連想学習(セクション1)とメモリの両方を即時記憶と遅延記憶の両方で調べることができる迅速な認知評価の説明的概要を提供する。このパラダイムは、学習した連想認知タスク(セクション2)の短期記憶と長期記憶の評価を提供します。

プロトコル

ゼブラフィッシュは、フライマン生命科学センターのノートルダム・ゼブラフィッシュ施設で飼育されました。この原稿に記載されている方法は、ノートルダム大学動物のケアと使用委員会(動物福祉保証番号A3093-01)によって承認されました。

1. シャトルボックス学習パラダイム (図1A)

注: 学習パラダイムは、連想学習に関する認知の迅速な評価を提供します。

1. 30.5 x 19 x 7.5 cmのゲルボックスを、45°の角度で両側に加えた5 x 19 cmのアクアリウムグレードのプレキシガラスで、シャトルボックスを準備します。魚がタンクの中央を横切ったときを評価するために、タンクの中間点を示す線を作ります(図1B)。
2. シャトルボックスに800mLのシステム水を追加します。脱イオンRO水の1 Lにインスタントオーシャンの60mgを溶解することによって、この水を作ります。水をタンクの中央に5cmの深さに満たします。
   注:28 °C毎時間または3魚をテストした後、新鮮なシステムの水に交換してください。
3. シャトルボックスアッセイが行われる暗い部屋にある、システム水を含む保持タンクに2-3魚を置きます。
   1. 暗い部屋で、シャトルボックスの中央に1匹の魚を置き、蓋を固定し、電極を電源に取り付けます。
      注: 部屋は順応およびテスト中にできるだけ暗いままにする必要があります。
4. シャトルボックスに魚を15分間順応します。
   注:調査官は、順応期間中に部屋に残るか、魚が調査官の存在に適応できるようにテストの前に十分な時間で静かに試験室に戻る必要があります。魚が自由にタンクを探索するときに成功した順応を考慮することができます。
   1. 魚が探索できない場合は、さらに15分間順応を続けます。それでも魚がシャトルボックスに順応しない場合は、魚を取り除きます。この魚をテストに使用しないでください。
5. 手作業で魚が占める側のゲルボックスの壁から、800ルーメンの赤いレンズ懐中電灯を2cmほど照らし、順応します。
   注:魚がシャトルボックスの深い端近くの壁に対してプラチナワイヤーの隣で休んでいる場合は、試験を開始しないでください。
6. 光刺激を魚に直接照らし、手動で魚の横運動に光を追って、刺激の継続的な可視化を確実にする(図1C)。次のいずれかの条件が満たされるまで、光刺激を提供し続けます。
   1. 魚が光暴露の15 s内のタンクの中間点を横切る場合は、成功したトレイルを考えてみましょう。魚が中間点を越えたら、すぐに光刺激を止める(図1D)。
   2. 魚が15 sで箱の中間点を越えない場合は、失敗したトレイルを考えてみましょう。この場合、電気泳動電源を使用して、負の衝撃刺激(20 mV:1 A)を交互に適用し、2 sのOn、2sのオフを15の期間(最大4つの衝撃)に、または魚が箱の中間点を通過するまで、その点で光と負の刺激の両方を終了させます。
7. 魚は30のsのために休んで、ステップ(s)1.5-1.6.2を繰り返します。成功した試行(1.6.1)と失敗した試行(1.6.2)の順序を詳細に記録します。
   注:ここでは、5回連続で成功した試験の完了として学習を定義しました。学習が実証されたら、魚はシャトルボックスから取り除かれ、人道的に安楽死させるべきです。

2. メモリパラダイム (図 1A)

注:このパラダイムは、学習した連想認知タスクの短期記憶と長期記憶の評価を提供します。

1. トレーニング期間
   1. シャトルボックスに800mLのシステム水を追加します。脱イオンRO水の1 Lにインスタントオーシャンの60mgを溶解することによって、この水を作ります。水をタンクの中央に5cmの深さに満たします。
      注:水は28 °C毎時、または3魚をテストした後、新鮮なシステムの水に置き換える必要があります。
   2. シャトルボックスアッセイが行われる暗い部屋に位置するシステム水を含む保持タンクに2-3魚を置きます。
   3. 暗い部屋で、シャトルボックスの中央に1匹の魚を置き、蓋を固定し、電極を電源に取り付けます。
      注: 部屋は順応およびテスト中にできるだけ暗いままにする必要があります。
   4. シャトルボックスに魚を15分間順応します。
      注:調査官は、順応期間中に部屋に残るか、魚が調査官の存在に適応できるようにテストする前に十分な時間で静かに試験室に戻る必要があります。魚が自由にタンクを探索しているときに正常な順応を決定します。
   5. 魚が探索できない場合は、さらに15分間順応を続けます。それでも魚がシャトルボックスに順応しない場合は、魚を取り除き、テストに使用しないでください。
   6. 順応が成功した後、手動で魚が占めているシャトルボックスの側に、ゲルボックス側壁から〜2cmの800ルーメン赤レンズ懐中電灯を照らします。
   7. 魚に直接光刺激を照らし、魚の刺激の継続的な可視化を確実にするために、光と魚の任意の横の動きに従ってください。
   8. 光が魚に輝いている間、同時に逆衝撃刺激(20 mV:1 A)交互に2 sオン、2 sオフ15 s(最大4つの衝撃)、または魚が箱の中間点を通過するまでを適用します。これが達成されたら、光と有害な刺激の両方を終了します。
      注:魚が30 sのために休むことを許可し、25回の反復のためにステップ2.1.6-2.1.8を繰り返します(図1A)。
2. 初期テスト
   1. トレーニング期間の後、魚に15分の休息を許可します。シャトルボックスから取り外しないでください。この休止期間の直後に、各トライアルを厳密に合格/不合格として記録して、初期メモリ保持をテストします。
   2. 最大15 sの光刺激のみを適用し、次のように応答を記録します。
      1. 魚が光刺激を開始した後、15 s以内にシャトルボックスの中間点を横切る場合は、試験が成功したと考えてください。魚が中間点を越えたら、すぐに光刺激を止めます。
      2. 魚が光刺激を開始した後、シャトルボックス15sの中間点を越えない場合は、試行に失敗したと考えてください。15 sの後に光刺激を停止します。
         注: 最初のテストでは、試行が失敗した後に、有害な刺激は適用されません。
   3. 試行の間に30の休息期間を持つステップ2.2.2を繰り返し、25回の試行で成功した試験(2.2.2.1)と失敗した試験(2.2.2.2)を記録します。この値は、各魚の個別参照として機能します。
3. 即時記憶
   1. 初期検査期間の直後に好ましい損傷パラダイム(例えば、修正されたマルマルーの体重減少を用いた鈍力外傷)によって傷害を誘発する。簡単な識別のために個別に魚を家。初期のテスト値を記録し、動物施設に魚を返します。
      注:魚は、前述の²²のように鈍い力TBIによって負傷しました。
   2. 動物施設から2-3の損傷していないまたはTBI魚4時間を最初のテストおよび/または4時間の後の傷害(または問題の実験時間枠で)収集する。システムの水を含む個々のタンクで暗い部屋にすべての魚を保ちます。
   3. シャトルボックスの中央に魚を置き(1.1で説明したようにシステム水で準備)、一度に1匹の魚を配置し、蓋を固定します。電源を取り付け、魚を15分間順応させます。
   4. 順応後、最大15sの光刺激のみを適用して即時記憶(厳密に合格/不合格)を評価し、次のように応答を記録します。
      1. 魚が15のテスト期間内に箱の中間点を越えた場合、試験は成功したことを考えてみましょう。中間点を通過する際に光刺激を終了します。
      2. 魚が光刺激を開始する15のs以内に箱の中間点を越えない場合は、試行に失敗したと考えてください。15sの期間が終わった後に光刺激を終了します。
         注:この傷害後のテストでは、失敗した試みの後に不利なショック刺激は適用されません。
   5. 試行の間に 30 の休息期間を持つステップ 2.3.4 を繰り返し、25 回の試行で成功した試行回数 (2.3.4.1) と失敗した試行回数 (2.3.4.2) を記録します。
   6. 式を使用して、最初のテスト期間への傷害後の成功した試験の割合差を計算します。
      
4. 遅延メモリ
   1. 初期検査値を容易に識別および記録するために個別に収容された魚を、初期試験期間直後の動物施設に戻す。
   2. 最初のテストと怪我および/または遅延メモリテストの間に魚4日(または問題の実験的な時間枠)を許可します。
   3. 好ましい損傷パラダイム(鈍い力の外傷を誘発するために修正されたマルマルーの体重低下など)によって傷害を誘発する。初期の試験値を簡単に識別するために個別に魚を飼育し、動物施設に魚を戻します。
      注:魚は、前述の²²のように鈍い力TBIによって負傷しました。
   4. 動物施設から2-3の損傷していないまたはTBI魚4時間を最初のテストおよび/または4時間の後の傷害(または問題の実験時間枠で)収集する。
   5. すべての魚をシステムの水を含む個々のタンクの暗い部屋に保管し、シャトルボックスの中央に一つずつ(1.1で説明したようにシステム水で準備)、蓋を固定し、電源を取り付け、魚15分を順応させます。
   6. 順応後、最大15 sの光刺激のみを適用して即時メモリ(厳密に合格/不合格)を評価し、次の応答を記録します。
      1. 魚が15のテスト期間内に箱の中間点を越えた場合、成功したトレイルを考えてみましょう。中間点を通過する際に光刺激を終了します。
      2. 魚が光刺激を開始してから15s以内にボックスの中間点を越えない場合は、トレイルが失敗したと考え、光刺激を終了します。
         注:この傷害後のテストでは、失敗した試みの後に不利なショック刺激は適用されません。
   7. 試行の間に 30 の休息期間を持つステップ 2.4.6 を繰り返し、25 回の試行で成功した試行 (2.4.6.1) と失敗した試行の数を記録します。
   8. 式を使用して最初のテスト期間に傷害後の成功した試験の割合差を計算します。
      

結果

プロトコルと概略図(図1)に概説されている学習パラダイムは、連想学習に関する認知の迅速な評価を提供します。さらに、このパラダイムは、5回連続陽性試験の反復および一貫した表示として学習を定義することによって、高いレベルのストリンジェンシーを有する。このパラダイムは、年齢や怪我の範囲にも適用されます。8ヶ月(ヤングアダルト)、18ヶ月(中年成人)?...

ディスカッション

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資料

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