Shuttle Box Assay как ассоциативный инструмент обучения для когнитивной оценки в обучении и исследованиях памяти с использованием взрослых рыбок данио

Резюме

Обучение и память являются мощными показателями в изучении когнитивных нарушений, вызванных развитием, болезнью или окружающей средой. Большинство когнитивных тестов требуют специализированного оборудования и длительных временных обязательств. Тем не менее, анализ челнока является ассоциативным инструментом обучения, который использует обычную геловую коробку для быстрой и надежной оценки познания взрослых рыбок данио.

Аннотация

Когнитивный дефицит, включая нарушение обучения и памяти, является основным симптомом различных нейродегенеративных заболеваний развития и возрастных заболеваний и черепно-мозговой травмы (ЧМТ). Рыбки данио являются важной моделью нейробиологии из-за их прозрачности во время развития и надежных регенеративных способностей после нейротравм. В то время как различные когнитивные тесты существуют у рыбок данио, большинство когнитивных тестов, которые являются быстрыми, исследуют неассоциативное обучение. В то же время ассоциативно-обучающие анализы часто требуют нескольких дней или недель. Здесь мы описываем тест быстрого ассоциативного обучения, который использует неблагоприятный стимул (удар током) и требует минимального времени на подготовку. Представленный здесь анализ челночного ящика прост, идеально подходит для начинающих исследователей и требует минимального оборудования. Мы демонстрируем, что после ЧМТ этот тест челнока воспроизводимо оценивает когнитивный дефицит и восстановление от молодых до старых рыбок данио. Кроме того, анализ адаптируется для изучения либо немедленной, либо замедленной памяти. Мы демонстрируем, что как одиночная ЧМТ, так и повторяющиеся события ЧМТ негативно влияют на обучение и немедленную память, но не задерживают память. Таким образом, мы пришли к выводу, что анализ челнока воспроизводимо отслеживает прогрессирование и восстановление когнитивных нарушений.

Введение

Обучение и память обычно используются в качестве показателей когнитивных нарушений, которые происходят из-за старения, нейродегенеративных заболеваний или травм. Черепно-мозговые травмы (ЧМТ) являются наиболее распространенными травмами, которые приводят к когнитивному дефициту. ЧМТ вызывают растущую озабоченность из-за их связи с несколькими нейродегенеративными расстройствами, такими как лобно-височная деменция и болезнь Паркинсона^1,2. Кроме того, повышенные скопления бета-амилоида, наблюдаемые у некоторых пациентов с ЧМТ, позволяют предположить, что это также может быть связано с развитием болезни Альцгеймера^3,4. ЧМТ часто являются результатом травмы тупой силой и охватывают диапазон тяжестей^5,причем легкие травмы головного мозга (миТМТ) являются наиболее распространенными. Тем не менее, миТБИ часто не сообщаются и неправильно диагностируются, потому что они приводят к незначительным когнитивным нарушениям только в течение короткого периода, и пострадавшие люди обычно полностью выздоравливают^6. Напротив, повторные события миТМТ вызывают растущую озабоченность, потому что она широко распространена у молодых и людей среднего возраста, может накапливаться с течением^{времени 7,}может ухудшать когнитивное развитие и усугублять нейродегенеративные заболевания^1,2,3,4,5,подобно лицам, которые испытывают либо умеренную, либо тяжелую ЧМТ^8.

Рыбка данио (Danio rerio) является полезной моделью для изучения различных тем в нейробиологии, включая способность регенерировать потерянные или поврежденные нейроны по всей центральной нервной системе^{9,10,11,12,13.} Нейронная регенерация также была продемонстрирована в теленцефалоне, который содержит архипаллий в дорсально-внутренней области. Эта нейроанатомическая область аналогична гиппокампу и, вероятно, необходима для познания у рыб и для кратковременной памяти у людей^14,15,16. Кроме того, поведение рыбок данио было широко охарактеризовано и каталогизировано¹⁷. Обучение изучалось с помощью различных методов, включая привыкание к реакции испуги^18,которая может представлять собой быструю форму неассоциативного обучения при выполнении в коротких блоках и с вниманием к быстрому времени распада^19. Используются более сложные тесты ассоциативного обучения, такие как Т-боксы, плюс-лабиринты и зрительная дискриминация^20,21, но часто они отнимают много времени, требуют дней или недель подготовки и полагаются на мелководье или положительное подкрепление. Здесь мы описываем быструю парадигму для оценки как ассоциативного обучения, так и немедленной или замедленной памяти. Этот анализ челночной коробки использует аверсивный стимул и отрицательное подкрепление для оценки когнитивного дефицита и восстановления после тупой ЧМТ. Мы демонстрируем, что неповрежденные контрольные взрослые рыбки данио (8-24 месяца) воспроизводимо учатся избегать красного света в течение 20 испытаний (<20 минут оценки) в челночной коробке с высокой степенью согласованности среди наблюдателей. Кроме того, используя челнок, мы демонстрируем, что способности к обучению и памяти у взрослых (8-24 месяца) последовательны и полезны для анализа познания со значительными нарушениями между различными тяжестями ЧМТ или повторной ЧМТ. Кроме того, этот метод может быть быстро использован в качестве метрики для отслеживания широкого спектра прогрессирования заболевания или эффективности лекарственных вмешательств, влияющих на поддержание или восстановление познания у взрослых рыбок данио.

Здесь мы предоставляем учебный обзор быстрой когнитивной оценки, которая может исследовать как сложное ассоциативное обучение (раздел 1), так и память с точки зрения как немедленной, так и замедленной памяти. Эта парадигма обеспечивает оценку кратковременной и долговременной памяти выученной ассоциативной когнитивной задачи (раздел 2).

протокол

Рыбки данио выращивались и содержались на объекте Нотр-Дам Даниофиш в Центре наук о жизни Фраймана. Методы, описанные в этой рукописи, были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Нотр-Дам (номер страхования благополучия животных A3093-01).

1. Парадигма обучения челночнойкоробке (рисунок 1A)

ПРИМЕЧАНИЕ: Парадигма обучения обеспечивает быструю оценку познания в отношении ассоциативного обучения.

1. Подготовьте коробку-шаттл, изменив гелевой ящик размером 30,5 x 19 x 7,5 см с куском плексигласа аквариумного класса размером 5 x 19 см, добавленным к каждой стороне под углом 45°. Сделайте линию, обозначав половину точки резервуара, чтобы оценить, когда рыба пересекла середину аквариума(рисунок 1B).
2. Добавьте 800 мл системной воды в челнок. Сделайте эту воду, растворив 60 мг Instant Ocean в 1 л деионизированной воды RO. Наполните воду до середины бака на глубину 5 см.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Замените пресной системной водой при 28 °C каждый час или после тестирования 3 рыб.
3. Поместите 2-3 рыбы в резервуар для хранения, содержащий системную воду, расположенный в темном помещении, где будет проводиться анализ челночной коробки.
   1. В темной комнате поместите 1 рыбу в центр челночной коробки, закрепите крышку и прикрепите электроды к источнику питания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Помещение должно оставаться как можно более темным во время акклиматизации и тестирования.
4. Акклиматизировать рыбу в челноке в течение 15 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователь должен оставаться в комнате в течение периода акклиматизации или спокойно возвращаться в комнату для тестирования с достаточным количеством времени до тестирования, чтобы позволить рыбе приспособиться к присутствию исследователя. Успешной акклиматизации можно считать, когда рыба свободно исследует аквариум.
   1. Если рыба не может исследовать, продолжайте акклиматацию в течение дополнительных 15 минут. Если рыба все еще не может акклиматизироваться в челночном ящике, удалите рыбу. Не используйте эту рыбу для тестирования.
5. Вручную светите 800-люменным красным объективом фонарика ~ 2 см от стенки гелевой коробки на стороне, занятой рыбой, после акклиматизации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не начинайте испытание, если рыба лежит рядом с платиновой проволокой у стены возле глубоких концов челночной коробки.
6. Наводите световой стимул непосредственно на рыбу и вручную следите за любым боковым движением рыбы светом, чтобы обеспечить непрерывную визуализацию стимула(рисунок 1C). Продолжайте предоставлять легкий стимул до тех пор, пока не будет выполнено одно из следующих условий.
   1. Считайте след успешным, если рыба пересекает половину аквариума в пределах 15 с воздействия света. Как только рыба пересечет половину пути, немедленно остановите световой стимул(рисунок 1D).
   2. Считайте тропу неудачной, если рыба не пересекает половину коробки за 15 с. В этом случае используйте электрофорезный источник питания для применения отрицательного шокового стимула (20 мВ:1 А), чередующего 2 с Вкл., 2 с Выкл. в течение 15 с (максимум 4 удара) или до тех пор, пока рыба не пройдет половину точки коробки, после чего прекратится как световой, так и отрицательный стимул.
7. Дайте рыбе отдохнуть в течение 30 с и повторите шаг (этапы) 1.5-1.6.2. Ведите подробный учет порядка успешных испытаний (1.6.1) и неудачных испытаний (1.6.2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы определили обучение как завершение 5 последовательных успешных испытаний. После того, как обучение было продемонстрировано, рыбу следует вынуть из челнока и гуманным образом усыпить.

2. Парадигма памяти(рисунок 1A)

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта парадигма обеспечивает оценку кратковременной и долговременной памяти усвоенной ассоциативной когнитивной задачи.

1. Период обучения
   1. Добавьте 800 мл системной воды в челнок. Сделайте эту воду, растворив 60 мг Instant Ocean в 1 л деионизированной воды RO. Наполните воду до середины бака на глубину 5 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вода должна быть заменена пресной системной водой при 28 °C каждый час или после тестирования 3 рыб.
   2. Поместите 2-3 рыбы в резервуар для хранения, который содержит системную воду, расположенный в темном помещении, где будет проводиться анализ челночной коробки.
   3. В темной комнате поместите 1 рыбу в центр челночной коробки, закрепите крышку и прикрепите электроды к источнику питания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Помещение должно оставаться как можно более темным во время акклиматизации и тестирования.
   4. Акклиматизировать рыбу в челноке в течение 15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователь должен оставаться в комнате в течение периода акклиматизации или спокойно возвращаться в комнату для тестирования с достаточным количеством времени до тестирования, чтобы позволить рыбе приспособиться к присутствию исследователя. Определите успешную акклиматацию, когда рыба свободно исследует аквариум.
   5. Если рыба не может исследовать, продолжайте акклиматацию в течение дополнительных 15 минут. Если рыба все еще не может акклиматизироваться к челночному ящику, удалите рыбу и не используйте ее для тестирования.
   6. После успешной акклиматизации вручную светите 800-люменным красным фонариком с линзой ~ 2 см от боковой стенки гелевой коробки, на стороне челночной коробки, которая занята рыбой.
   7. Наводите световой стимул непосредственно на рыбу и следите за любым боковым движением рыбы светом, чтобы обеспечить постоянную визуализацию стимула рыбой.
   8. Пока свет светит на рыбу, одновременно применяйте неблагоприятный ударный стимул (20 мВ:1 А), чередуя 2 с Вкл,2 с Выкл в течение 15 с (максимум 4 удара) или до тех пор, пока рыба не пройдет половину точки коробки. Как только это будет достигнуто, прекратите как свет, так и неблагоприятный стимул.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте рыбе отдохнуть в течение 30 с, затем повторите шаг 2.1.6-2.1.8 для 25 итераций(рисунок 1A).
2. Первоначальное тестирование
   1. Дайте рыбе 15 минут отдыха после периода тренировки. Не снимайте их с челнока. Проверьте начальное сохранение памяти, записав каждое испытание как строго пройденный/неудачный, сразу после этого периода отдыха.
   2. Применяйте только световой стимул на срок до 15 с и записывайте ответы следующим образом.
      1. Считайте испытание успешным, если рыба пересекает половину челнока в течение 15 с после запуска светового стимула. Немедленно прекратите световой раздражитель, как только рыба пересечет половину пути.
      2. Считайте испытание неудачным, если рыба не пересекает половину пути челночной коробки через 15 с после запуска светового стимула. Остановите световой раздражитель через 15 с.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Во время первоначального тестирования неблагоприятный стимул не применяется после неудачной попытки.
   3. Повторите шаг 2.2.2 с периодом отдыха 30 с между испытаниями и запишите успешные испытания (2.2.2.1) и неудачные испытания (2.2.2.2) в 25 испытаниях. Это значение будет служить индивидуальным ориентиром для каждой рыбы.
3. Мгновенная память
   1. Вызвать травму сразу после начального периода тестирования предпочтительной парадигмой повреждения (например, травма тупой силой с использованием модифицированного падения веса Мармару). Домашняя рыба индивидуально для легкой идентификации. Запишите их первоначальные значения испытаний и верните рыбу на объект для животных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рыба была ранена тупой ЧМТ, как описано^{ранее 22}.
   2. Соберите 2-3 неповрежденные или ЧМТ рыбы через 4 ч после первоначального тестирования и/или 4 ч после травмы (или в рассматриваемый экспериментальный период времени) из животного объекта. Держите всех рыб в темном помещении в отдельных резервуарах, содержащих системную воду.
   3. Поместите рыбу в центр челнока (приготовленную с помощью системной воды, как описано в 1.1), по одной рыбе за раз и закрепите крышку. Подключите блок питания и дайте рыбе акклиматизироваться в течение 15 минут.
   4. После акклиматизации оцените немедленную память (строго пройдите /не сдайте), применяя только световой стимул на срок до 15 с и запишите ответы следующим образом.
      1. Считайте испытание успешным, если рыба пересекает половину коробки в течение испытательного периода 15 с. Прекратите световой стимул при пересечении половины пути.
      2. Считайте испытание неудачным, если рыба не пересекает половину коробки в течение 15 с после начала светового стимула. Прекратите световой стимул после того, как 15-й период закончится.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого тестирования после травмы неблагоприятный шоковый стимул не применяется после неудачной попытки.
   5. Повторите шаг 2.3.4 с периодом отдыха 30 с между испытаниями и запишите количество успешных испытаний (2.3.4.1) и неудачных испытаний (2.3.4.2) в 25 испытаниях.
   6. Рассчитайте процентную разницу в успешных испытаниях после травмы до начального периода тестирования, используя уравнение:
      
4. Задержка памяти
   1. Возврат рыб, размещенных индивидуально для легкой идентификации и регистрации их первоначальных испытательных значений, на животное оборудование сразу после начального периода тестирования.
   2. Дайте рыбе 4 дня (или экспериментальные временные рамки, о которые идет речь) между первоначальным тестированием и травмой и / или отложенным тестированием памяти.
   3. Вызвать травму с помощью предпочтительной парадигмы повреждения (например, модифицированное падение веса Мармару, чтобы вызвать травму тупой силы). Размещайте рыбу индивидуально для легкой идентификации первоначальных значений тестирования и возвращая рыбу на животное оборудование.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рыба была ранена тупой ЧМТ, как описано^{ранее 22}.
   4. Соберите 2-3 неповрежденные или ЧМТ рыбы через 4 ч после первоначального тестирования и/или 4 ч после травмы (или в рассматриваемый экспериментальный период времени) из животного объекта.
   5. Держите всех рыб в темном помещении в отдельных резервуарах, содержащих системную воду, и размещайте по одной в центре челночной коробки (подготовленной с помощью системной воды, как описано в 1.1), закрепите крышку, подключите источник питания и дайте рыбе 15 минут акклиматизироваться.
   6. После акклиматизации оцените немедленную память (строго пройдите/не сдайте), применяя только световой стимул на срок до 15 с и запишите следующие реакции:
      1. Считайте след успешным, если рыба пересекает половину коробки в течение 15-го испытательного периода. Прекратите световой стимул при пересечении половины пути.
      2. Считайте след неудачным, если рыба не пересекает половину точки коробки в течение 15 с от начала светового стимула, прекратит световой стимул.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого тестирования после травмы неблагоприятный шоковый стимул не применяется после неудачной попытки.
   7. Повторите шаг 2.4.6 с периодом отдыха 30 с между испытаниями и запишите количество успешных испытаний (2.4.6.1) и неудачных испытаний (2.4.6.2) в 25 испытаниях.
   8. Рассчитайте процентную разницу в успешных испытаниях после травмы к начальному периоду тестирования с помощью уравнения:
      

Результаты

Парадигма обучения, изложенная в протоколе и схеме(рисунок 1),обеспечивает быструю оценку познания по отношению к ассоциативному обучению. Кроме того, эта парадигма имеет высокий уровень жесткости, определяя обучение как повторяющееся и последовательное проявление 5 п?...

Обсуждение

Когнитивные нарушения могут существенно и негативно повлиять на качество жизни. Из-за повышенной видимости и возникновения сотрясений и черепно-мозговых травм среди населения важно понимать, как они вызывают когнитивные нарушения и как ущерб может быть сведен к минимуму или обращен в...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flashlight	Ultrafire	9145
Instant Ocean	Instant Ocean	SS15-10
Large DNA Gel Box	Fisher Scientific	FB-SB-1316	Shuttle Box
Power Supply	Fisher Scientific	FB-105