성인 얼룩말 물고기를 사용하여 학습 및 메모리 연구에서 인지 평가를위한 연관 학습 도구로 셔틀 박스 분석

요약

학습과 기억은 발달, 질병 의존, 또는 환경 유발 인지 장애를 연구하는 데 강력한 지표입니다. 대부분의 인지 평가에는 특수 장비와 광범위한 시간 약속이 필요합니다. 그러나 셔틀박스 분석체는 기존의 젤박스를 활용하여 성인 제브라피시 인식의 신속하고 신뢰할 수 있는 평가를 제공하는 연관 학습 도구입니다.

초록

인지 적자, 장애인 된 학습 및 메모리를 포함 하 여, 다양 한 발달 및 나이 관련 된 신경 퇴행 성 질환및 외상성 뇌 손상의 주요 증상 (TBI). Zebrafish는 개발 중 투명성과 신경 외상에 따른 강력한 재생 기능으로 인해 중요한 신경 과학 모델입니다. 제브라피시에는 다양한 인지 검사가 존재하지만, 급속히 비 연관 학습을 검사하는 인지 평가의 대부분은. 동시에, 연관 학습 소법은 종종 며칠 또는 몇 주가 필요합니다. 여기서는 불리한 자극(감전)을 활용하고 최소한의 준비 시간이 필요한 신속한 연관 학습 테스트를 설명합니다. 여기에 제시 된 셔틀 박스 분석법은 간단하고 초보자 수사관에게 이상적이며 최소한의 장비가 필요합니다. TBI에 이어 이 셔틀 박스 테스트는 인지 적자와 젊은 자발물고기로의 회복을 재현적으로 평가합니다. 또한 분석법은 즉시 또는 지연된 메모리를 검사할 수 있습니다. 단일 TBI와 반복된 TBI 이벤트가 학습 및 즉각적인 메모리에 부정적인 영향을 미치지만 메모리가 지연되지 는 않음을 입증합니다. 따라서 셔틀박스 분석이 인지 장애의 진행과 회복을 재현적으로 추적한다는 결론을 내릴 수 있습니다.

서문

학습과 기억은 노화, 신경 퇴행성 질환 또는 부상으로 인해 발생하는 인지 장애의 지표로 일상적으로 사용됩니다. 외상성 뇌 손상 (TBIs) 인지 적자 결과 가장 일반적인 부상. 결핵은 전두엽 치매 및 파킨슨 병^1,2와 같은 여러 신경 퇴행성 질환과의 연관성 때문에 우려가 커지고^{있습니다.} 또한, 일부 TBI 환자에서 관찰된 베타 아밀로이드 집계증가는 알츠하이머병^3,4의발병과도 연관될 수 있음을 시사한다. 결핵은 종종 무딘 힘 외상의 결과이며, 경미한 뇌 손상 (miTBI)이 가장 일반적인 것으로, 단절의 범위에 걸쳐^5. 그러나, miTBIs는 수시로 보고되지 않고 단지 짧은 기간 동안 경미한 인식 손상 귀착되기 때문에잘못 진단되고, 부상당한 개별은 일반적으로 완전히 6복구합니다. 대조적으로, 반복되는 miTBI 사건은 젊은 과 중년 성인에서 매우 널리 퍼진 때문에, 시간^7에걸쳐 축적될 수 있고, 인지 발달을 손상시킬 수 있고, 신경 퇴행성 질환^1,2,3,4,5,중등도 또는 중증 TBI^8을경험하는 개인과 유사하게 증가하는 관심사가 되고 있다.

Zebrafish(Danio rerio)는중추 신경계^{9,10,11,12,13에}걸쳐 분실 되거나 손상된 뉴런을 재생하는 기능을 포함하여 신경 과학에서 다양한 주제를 탐구하는 데 유용한 모델입니다. 신경 재생은 또한 등내 부위에 있는 아르치팔륨을 포함하는 텔렌스팔론에서 입증되었다. 이 신경 해부학 영역은 해마와 유사하며 물고기의 인식과인간^14,15,16의짧은 메모리에 필요할 가능성이 있습니다. 또한, 제브라피쉬 의 행동은 광범위하게 특징지어지고^{카탈로그화되어 있다 17.} 학습은 짧은 블록에서 수행 될 때 비 연관 학습의 빠른 형태를 나타낼 수있는 깜짝 반응^(18)에대한 습관화를 포함하여 다양한 기술을 통해 연구되었으며, 급속한 부패 시간^{19에주의를}기울입니다. T 박스, 플러스 미로 및 시각적 차별⁽²⁰⁾및^20과 같은 연관 학습의 더 복잡한 테스트가 사용되지만 종종 시간이 많이 걸리며 며칠 또는 몇 주 동안 준비가 필요하며 shoaling 또는 긍정적 인 보강에 의존합니다. 여기서는 연관 학습과 즉각적이거나 지연된 메모리를 모두 평가하는 빠른 패러다임을 설명합니다. 이 셔틀 박스 분석은 역경 자극과 부정적인 보강 컨디셔닝을 사용하여 무딘 힘 TBI에 따라 인지 적자와 회복을 평가합니다. 우리는 손상되지 않은 제어 성인 제브라피쉬 (8-24 개월)가 관찰자에 걸쳐 높은 수준의 일관성으로 셔틀 박스에서 20 번의 시험 (평가 <20 분)내에서 적색불을 피하는 법을 다시 배우는 것을 보여줍니다. 또한 셔틀 박스를 사용하면 성인(8-24개월)의 학습 능력과 기억 능력이 일관되며 TBI 가사 나 반복된 TBI 간에 상당한 장애가 있는 인지를 말하는 데 유용합니다. 더욱이, 이 방법은 성인 제브라피시의 인지 유지 또는 회복에 영향을 미치는 약물 내정간섭의 광범위한 질병 진행 또는 효능을 추적하는 지표로 급속하게 사용될 수 있었다.

여기서는 즉각적인 기억과 지연된 메모리 측면에서 복잡한 연관 학습(섹션 1)과 메모리를 모두 검사할 수 있는 신속한 인지 평가에 대한 교육 개요를 제공합니다. 이 패러다임은 학습 된 연관 인지 작업의 단기 및 장기 기억의 평가를 제공합니다 (섹션 2).

프로토콜

브라위피쉬는 프레이만 생명과학 센터의 노틀담 제브라피시 시설에서 자랐으며 유지되었습니다. 이 원고에 설명 된 방법은 노틀담 동물 관리 및 사용위원회 (동물 복지 보증 번호 A3093-01)의 대학에 의해 승인되었다.

1. 셔틀 박스 학습 패러다임(그림 1A)

참고: 학습 패러다임은 연관 학습에 관한 인식의 신속한 평가를 제공합니다.

1. 30.5 x 19 x 7.5cm 젤 박스를 45° 각도로 양쪽에 추가한 5 x 19cm 크기의 수족관 급 플렉시글래스로 수정하여 셔틀 박스를 준비합니다. 물고기가 탱크의 중간을 교차 했을 때 평가 하는 탱크의 중간 지점을 표시 하는 선을 확인(그림 1B).
2. 셔틀 박스에 800mL의 시스템 물을 추가합니다. 1 L의 탈온화 된 RO 물에 인스턴트 오션 60 mg을 용해하여이 물을 확인하십시오. 탱크 의 중앙에 물을 채우는 것은 5cm의 깊이로 채웁니다.
   참고: 매 h~3마리의 물고기를 테스트한 후 매 h~c의 신선한 시스템 물로 대체하십시오.
3. 셔틀 박스 분석이 수행 될 어두운 방에위치한 시스템 물이 들어있는 홀딩 탱크에 2-3 물고기를 놓습니다.
   1. 어두운 방에는 1마리의 물고기를 셔틀박스 중앙에 놓고 뚜껑을 열고 전극을 전원 공급장치에 부착합니다.
      참고: 적응 및 테스트 중에 방은 가능한 한 어둡게 유지되어야 합니다.
4. 셔틀 박스에 물고기를 15분 동안 수용합니다.
   참고: 조사관은 적응 기간 동안 방에 남아 있거나 시험 전에 충분한 시간으로 조용히 시험실로 돌아와 물고기가 조사관의 존재에 적응할 수 있도록 해야 합니다. 물고기가 자유롭게 탱크를 탐험 할 때 성공적인 적응을 고려할 수 있습니다.
   1. 물고기가 탐험하지 못하면 추가로 15분 동안 계속 적응하십시오. 물고기가 여전히 셔틀 박스에 적응하지 못하는 경우, 물고기를 제거합니다. 이 물고기를 테스트하려면 사용하지 마십시오.
5. 800루멘 레드 렌즈 손전등 ~2cm를 물고기가 점유한 측면의 젤 박스 벽에서 순출을 수동으로 비추는 다.
   참고: 물고기가 셔틀 박스의 깊은 끝 근처 벽에 대한 백금 와이어 옆에 쉬고 있는 경우 재판을 시작하지 마십시오.
6. 물고기에 직접 빛 자극을 비추고 수동으로 자극의 지속적인 시각화를 보장하기 위해 빛과 물고기의 측면 움직임을 따르십시오(도 1C). 다음 조건 중 하나가 충족 될 때까지 빛 자극을 제공하기 위해 계속.
   1. 물고기가 15s의 광 노출 내에서 탱크의 중간 지점을 가로 질러 가는 경우 트레일이 성공적이라고 생각해 보십시오. 물고기가 중간 지점을 교차하면 즉시 빛 자극을 중지(그림 1D).
   2. 물고기가 15s의 상자 의 중간 지점을 가로 질러 교차하지 않는 경우 실패로 흔적을 고려하십시오. 이 경우, 전기전도 전원 공급 장치를 사용하여 음성 충격 자극(20mV:1 A)을 번갈아 가며 15s 기간 동안 Off 2 s, 또는 물고기가 상자의 중간 지점을 통과할 때까지 빛과 음극을 모두 종료합니다.
7. 물고기가 30 s에 대한 휴식을 하자 및 반복 단계( 들) 1.5-1.6.2. 성공적인 시험 순서(1.6.1)와 실패한 시험(1.6.2)에 대한 자세한 기록을 보관하십시오.
   참고: 여기에서 학습을 5회 연속 성공적인 시험의 완료로 정의했습니다. 학습이 입증되면, 물고기는 셔틀 박스에서 제거하고 인도적으로 안락사해야합니다.

2. 메모리 패러다임(그림 1A)

참고: 이 패러다임은 학습된 연관 인지 작업의 단기 및 장기 기억에 대한 평가를 제공합니다.

1. 훈련 기간
   1. 셔틀 박스에 800mL의 시스템 물을 추가합니다. 1 L의 탈온화 된 RO 물에 인스턴트 오션 60 mg을 용해하여이 물을 확인하십시오. 탱크 의 중앙에 물을 채우는 것은 5cm의 깊이로 채웁니다.
      참고 : 물은 매 h 또는 3 물고기를 테스트 한 후 28 °C에서 신선한 시스템 물로 대체해야합니다.
   2. 셔틀 박스 분석이 수행 될 어두운 방에위치한 시스템 물이 들어있는 홀딩 탱크에 2-3 물고기를 놓습니다.
   3. 어두운 방에는 1마리의 물고기를 셔틀박스 중앙에 놓고 뚜껑을 열고 전극을 전원 공급장치에 부착합니다.
      참고: 적응 및 테스트 중에 방은 가능한 한 어둡게 유지되어야 합니다.
   4. 셔틀 박스에 물고기를 15분 동안 반갑게 합니다.
      참고: 조사관은 적응 기간 동안 방에 남아 있거나 물고기가 조사관의 존재에 적응할 수 있도록 테스트하기 전에 충분한 시간을 가지고 조용히 시험실로 돌아와야 합니다. 물고기가 자유롭게 탱크를 탐험 할 때 성공적인 적응을 결정합니다.
   5. 물고기가 탐험하지 못하면 추가로 15분 동안 계속 적응하십시오. 물고기가 여전히 셔틀 박스에 적응하지 못하는 경우, 물고기를 제거하고 테스트에 사용하지 마십시오.
   6. 성공적인 적응 후, 수작업으로 800 루멘 레드 렌즈 손전등 ~2cm 젤 박스 사이드 월에서, 물고기에 의해 점유 되는 셔틀 박스의 측면에 빛난다.
   7. 물고기에 직접 빛 자극을 비추고 물고기에 의해 자극의 지속적인 시각화를 보장하기 위해 빛과 물고기의 측면 움직임을 따르십시오.
   8. 물고기에 빛이 비추는 동안, 동시에 불리 한 충격 자극 (20 mV:1 A) 2 s On, 2 s Off 15 s (최대 4 충격)에 대 한 또는 물고기 상자의 중간 지점을 통과 할 때까지 적용 합니다. 일단 이것이 달성되면, 빛과 불리한 자극을 모두 종료합니다.
      참고: 물고기가 30s동안 휴식을 취하도록 허용한 다음 25회 반복에 대해 2.1.6-2.1.8단계를 반복합니다(그림1A).
2. 초기 테스트
   1. 훈련 기간 이후에 물고기에게 15분 의 휴식을 허용하십시오. 셔틀 박스에서 제거하지 마십시오. 이 휴식 기간 이후에 각 평가판을 엄격하게 통과/실패로 기록하여 초기 메모리 보존을 테스트합니다.
   2. 최대 15s의 라이트 자극만 적용하고 다음과 같이 응답을 기록합니다.
      1. 물고기가 빛 자극을 시작한 후 15 s 이내에 셔틀 박스의 중간 지점을 가로 질러 가는 경우 시험이 성공적이라고 생각해 보십시오. 물고기가 중간 지점을 교차 할 때 즉시 빛 자극을 중지합니다.
      2. 물고기가 빛 자극을 시작한 후 셔틀 박스 15s의 중간 지점을 가로질러 교차하지 않으면 시험이 실패한 것으로 간주하십시오. 15s 후 빛 자극을 중지합니다.
         참고: 초기 테스트 중에 실패한 시도 에 따라 불리한 자극이 적용되지 않습니다.
   3. 반복 단계 2.2.2, 재판 사이의 30의 휴식 기간, 기록 성공적인 시험 (2.2.2.1) 및 실패 한 시험 (2.2.2.2) 에 걸쳐 25 재판. 이 값은 각 물고기에 대한 개별 참조 역할을 합니다.
3. 즉각적인 메모리
   1. 바람직한 손상 패러다임에 의해 초기 시험 기간 직후에 부상을 유도한다(예를 들어, 수정된 Marmarou 체중 투하를 이용한 무딘 힘 외상). 쉽게 식별할 수 있는 생선을 개별적으로 보관할 수 있습니다. 초기 테스트 값을 기록하고 물고기를 동물 시설로 반환합니다.
      참고 : 물고기는 이전에 설명 된 대로 무딘 힘 TBI에 의해^{부상했다 22}.
   2. 동물 시설에서 초기 테스트 및/또는 4h 후 부상 후(또는 문제의 실험 기간에) 2-3개의 손상되지 않은 또는 TBI 물고기를 수집합니다. 시스템 물이 들어있는 개별 탱크의 어두운 방에있는 모든 물고기를 유지하십시오.
   3. 셔틀 박스 의 중앙에 물고기를 배치 (1.1에 설명 된 대로 시스템 물로 준비), 한 번에 하나의 물고기, 뚜껑을 고정. 전원 공급 장치를 부착하고 물고기가 15 분 동안 적응 할 수 있습니다.
   4. 적응 후 최대 15s에 대한 광 자극만 적용하여 즉각적인 메모리(엄격하게 통과/실패)를 평가하고 다음과 같이 응답을 기록합니다.
      1. 물고기가 15의 시험 기간 내에 상자의 중간 지점을 가로 질러 가는 경우 시험이 성공적이라고 생각해 보십시오. 중간 지점을 건널 때 광 자극을 종료합니다.
      2. 물고기가 빛 자극을 시작하는 15 s 이내에 상자의 중간 지점을 교차하지 않는 경우 실패로 재판을 고려하십시오. 15의 기간이 끝난 후 빛 자극을 종료합니다.
         참고: 이 부상 후 테스트 중에 실패한 시도 에 따라 불리한 충격 자극이 적용되지 않습니다.
   5. 시험 사이에 30의 휴식 기간을 가진 2.3.4단계를 반복하고, 25번의 시험에서 성공적인 시험(2.3.4.1)과 실패한 시험(2.3.4.2)의 수를 기록합니다.
   6. 방정식을 사용하여 부상 후 부상 후 성공적인 시험의 백분율 차이를 방정식을 사용하여 초기 테스트 기간의 백분율 차이를 계산합니다.
      
4. 지연된 메모리
   1. 초기 테스트 기간 이후에 동물 시설로 쉽게 식별및 초기 테스트 값을 기록하기 위해 개별적으로 보관된 물고기를 반환합니다.
   2. 물고기 4 일 허용 (또는 문제의 실험 기간) 초기 테스트 및 부상 및/또는 지연 된 메모리 테스트 사이.
   3. 바람직한 손상 패러다임에 의해 부상을 유도한다(예: 수정된 마르마루 중량 저하와 같은 무딘 힘 외상을 유도한다). 집 어류는 개별적으로 개별적으로 초기 테스트 값을 쉽게 식별하고, 동물 시설로 물고기를 반환합니다.
      참고 : 물고기는 이전에 설명 된 대로 무딘 힘 TBI에 의해^{부상했다 22}.
   4. 동물 시설에서 초기 테스트 및/또는 4h 후 부상 후(또는 문제의 실험 기간에) 2-3개의 손상되지 않은 또는 TBI 물고기를 수집합니다.
   5. 시스템 물을 포함하는 개별 탱크의 어두운 방에있는 모든 물고기를 유지하고 셔틀 박스 (1.1에 설명된 대로 시스템 물로 준비)의 중앙에 한 번에 하나를 놓고 뚜껑을 고정하고 전원 공급 장치를 부착하고 물고기가 15 분 동안 적응할 수 있도록하십시오.
   6. 다음 적응은 최대 15s에 대한 라이트 자극만 적용하여 즉각적인 메모리(엄격하게 통과/실패)를 평가하고 다음 응답을 기록합니다.
      1. 물고기가 15의 테스트 기간 내에 상자의 중간 지점을 가로 질러 가는 경우 트레일이 성공적이라고 생각해 보십시오. 중간 지점을 건널 때 광 자극을 종료합니다.
      2. 물고기가 빛 자극을 시작의 15 s 이내에 상자의 중간 지점을 교차하지 않는 경우 실패로 흔적을 고려, 빛 자극을 종료.
         참고: 이 부상 후 테스트 중에 실패한 시도 에 따라 불리한 충격 자극이 적용되지 않습니다.
   7. 시험 사이에 30의 휴식 기간을 가진 2.4.6을 반복하고 25 번의 시험에서 성공적인 시험 (2.4.6.1)과 실패한 시험 (2.4.6.2)을 기록합니다.
   8. 방정식으로 초기 테스트 기간에 부상 후 의 성공적인 시험의 백분율 차이를 계산합니다.
      

결과

프로토콜 및 회로도(그림1)에설명된 학습 패러다임은 연관 학습에 대한 인식의 신속한 평가를 제공합니다. 또한, 이 패러다임은 학습을 5회 연속 양성 시험의 반복적이고 일관된 디스플레이로 정의함으로써 높은 수준의 스트링성을 가지고 있습니다. 이 패러다임은 또한 연령과 부상의 범위에 적용 할 수 있습니다. 8개월(청년 성인), 18개월(중년 성인), 24개월(고령자)의 손상?...

토론

인지 장애는 삶의 질에 크게 영향을 미칠 수 있습니다. 인구 전반에 걸쳐 뇌진탕과 외상성 뇌 손상의 가시성과 발생이 증가하기 때문에 인지 장애를 일으키는 방법과 손상을 최소화하거나 되돌릴 수있는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 이러한 이유로, 인지 감소에 대 한 테스트 할 수 있는 모델 유기 체 이러한 연구에서 중요 한 역할을. 설치류는 오랫동안 신경 행동 및 인식을 조사하?...

자료

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