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要約

ここでは、空気-液体界面での初代ヒト鼻上皮(HNE)細胞の単離、増幅、分化、および増幅HNEの凍結と融解に成功することを可能にするバイオバンキングプロトコルについて説明します。このプロトコルは、分化したHNE細胞の電気生理学的特性と、異なるモジュレーター処理時のCFTR関連の塩化物分泌補正を分析します。

要約

ヒト鼻上皮(HNE)細胞は、簡単で非侵襲的な鼻ブラッシングによって収集が容易である。患者由来の初代HNE細胞を増幅し、気液界面条件下で擬似層状上皮に分化させて、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)機能の指標として環状AMP媒介塩化物(Cl-)輸送を定量化することができる。鼻ブラッシングの質や凍結保存時の細胞密度などの重要なステップを効率的に行えば、HNE細胞をバイオバンク化することに成功することができます。さらに、短絡電流研究は、凍結融解がHNE細胞の電気生理学的特性およびCFTR変調器に対する応答を有意に変化させないことを実証している。本試験で用いた培養条件では、クライオバイアルあたり2 x106 細胞未満が凍結されると、故障率が非常に高い。クライオバイアルあたり少なくとも3 x106 セルを凍結することをお勧めします。我々は、CFTR補正器とCFTR増強剤を組み合わせた二重療法が、F508delホモ接合型HNE細胞におけるCFTR活性に対して同等の補正有効性を有することを示す。トリプルセラピーVX-445 + VX-661 + VX-770は、二重療法VX-809 + VX-770と比較してCFTR活性の補正を有意に増加させた。HNE細胞におけるCFTR活性の測定は、CFTRモジュレーター療法を導くのに有用な有望な前臨床バイオマーカーである。

概要

嚢胞性線維症(CF)は、上皮1,2の頂端表面に位置するアニオンチャネルであるCFTRタンパク質の不在または機能不全をもたらす嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)遺伝子の変異に起因する常染色体劣性障害である。CFTR療法における最近の進歩は、疾患の予後を改善し、CFTR矯正剤とCFTR増強剤を組み合わせた最後の承認薬は、最も頻繁な変異p.Phe508del変異(F508del)を有するCF患者の肺機能および生活の質の大幅な改善をもたらした3,4。この有望な治療の進歩にもかかわらず、CF患者の約10%は、これらのCFTRモジュレーターによって救出できない変異を有するため、不適格である。これらの患者にとって、特定の変異について最も効率的な組み合わせを見つけるために、他の薬物または薬物の組み合わせをテストする必要があり、個別化療法の重要性を強調しています。

ヒト鼻上皮(HNE)細胞は、簡単で非侵襲的な鼻ブラッシングによって収集が容易であり、CFTR機能の指標としてのサイクリックAMP媒介塩化物(Cl−)輸送の定量を可能にする。HNE細胞はヒト気道の正確なモデルをもたらすが、その寿命は培養において限られている。培養技術の最適化のおかげで、患者由来の初代HNE細胞をRho関連キナーゼ阻害剤(ROCKi)で条件付きで再プログラムし、増幅し、微多孔性フィルター5,6上の気液界面(ALI)条件下で擬似層状上皮に分化させることができる5,6。HNE培養のための多数の培養プロトコールが存在し(市販、無血清、「自家製」、「フィーダー細胞との共培養など)、培地および培養条件の選択は、増殖、細胞集団の分化および上皮機能に影響を与えることが記載されている7、8。ここでのプロトコルは、CFTR機能アッセイのためにALIで分化される多数のHNE細胞を首尾よく得ることを可能にする、単純化されたフィーダーフリーのROCKi増幅法を提示する。

我々は、分化したHNE細胞において、CFTRモジュレーターによる48時間治療がCFTR依存性Cl- 電流の電気生理学的補正を誘導するのに十分であり、 インビトロで 観察される補正が患者の臨床的改善と相関し得ることを実証した9。したがって、HNE細胞は、基礎的なCF研究だけでなく、患者固有のCFTRモジュレーター試験を伴う前臨床試験にも適切なモデルである。個別化治療のこの文脈において、プロトコールの目標は、我々の条件で増殖したCF患者由来の凍結保存HNE細胞がCFTR補正研究のための適切なモデルであり、新鮮および凍結融解細胞からのCFTR依存性Cl- 輸送を比較する場合、同様の結果が期待できることを検証することであった。この研究はまた、二重療法および三重療法を使用する場合の異なるCFTRモジュレーターの有効性を評価した。

プロトコル

すべての実験は、ヘルシンキ宣言と人間の研究倫理に関するHuriet-Serusclat法によって記述されたガイドラインと規制に従って行われました。

1. フラスコおよび異種培地の調製

  1. 表1に記載したように増幅、空気 - 液体、および凍結媒体を調製する。
  2. コラーゲン50mgを0.2%氷酢酸100mLに溶解してヒトコラーゲンIVの原液を調製する。マグネチックスターラーで少なくとも1時間混合し、溶液をフィルター滅菌する。光から保護されたガラス瓶に4°Cで最大6ヶ月間保管してください。
  3. 原液を二重蒸留水で1:5に希釈してコラーゲンIVの作用溶液を調製する。4°Cで最大6ヶ月間保管してください。
  4. プラスチック細胞培養フラスコまたはトランスウェルフィルターをコラーゲン作業溶液でコーティングする。0.33 cm 2 トランスウェルフィルターに 100 μL、25 cm 2 フラスコに 500 μL、75cm 2 フラスコに 1 mL をフラスコの成長面全体に均等に分配します。
    注:これは、フラスコを左右に静かに傾けることによって達成することができる。あるいは、フラスコのコーティングを容易にするために、増加した体積を使用することができ、そして、表面全体が均等に覆われるとき、コラーゲン溶液は、指示された体積のみを残すように吸引される。吸引されたコラーゲン溶液は、その後、直ちに次のフラスコをコーティングするために使用することができる(すなわち、3つの75cm2フラスコに対して、3mLのコラーゲン溶液を最初のフラスコに均等に分配し、2mLを吸引し、次いで次のフラスコに使用される、など)。
  5. 細胞培養フラスコをインキュベーター内に最低2時間または一晩放置する。コラーゲンを徹底的に吸引し、フラスコをインキュベーター内またはフードの下で最低20分間または一晩乾燥させます。
  6. 10mLのMg2+-およびCa2+フリーDPBSで洗浄し、インキュベーター内で乾燥させ、光から保護するためにアルミニウム箔に保存する。フラスコを室温(RT)で最大6ヶ月間保管する。

2.鼻ブラッシング

注:参加者が急性感染症に罹患していない間に鼻ブラッシングが行われることを確認してください。CF患者が肺感染症を呈する場合は、患者の抗生物質を参照し、増幅培地に抗生物質を追加します。ヒト鼻上皮細胞を、前述のようにF508del/F508del患者から鼻ブラッシングによって収集した9。

  1. 患者に鼻を吹くように頼み、ナファゾリン溶液でキシロカイン5%に浸した綿網を使用して、両方の鼻孔の粘膜を局所麻酔する。
  2. 細胞診ブラシを使用して、両方の鼻孔の内側壁と下甲介を優しくブラッシングします。ブラシを市販のフラッシング培地2mLで15mLチューブに浸します。細胞を切り離すために静かに振る。2番目の鼻孔でブラッシングを繰り返します。
  3. ペニシリン(100 U/mL)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)、タゾシリン(10 μg/mL)、アンホテリシンB(2.5 μg/mL)、コリマイシン(16 μg/mL)の抗生物質をフラッシング培地に加えます。
    注:鼻ブラッシングは、RTで拡張と培養のために専用ラボに出荷することができ、ブラッシング後72時間まで播種することができます。

3. HNEの分離

注:HNEを細胞診ブラシから単離し、Mg2+-およびCa2+フリーDPBSで洗浄し、0.25%トリプシンで解離させ、前述のように25cm2プラスチックフラスコ上に播種した10。

  1. ブラシを1000 μLのピペットコーンに繰り返し通し、2 mLのMg 2+-およびCa2+フリーDPBSですすいで、細胞診ブラシから細胞を剥離します。500 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てる。
  2. ペレットを0.25%トリプシンに8〜12分間再懸濁し、細胞を解離させる。5 mLの増幅培地を加えて酵素反応を停止した。
  3. 500 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てる。ペレットを8mLの増幅培地に再懸濁し、25cm2のコラーゲンコーティングフラスコにシードする。37°Cおよび5%CO2で生育する。これはパッセージ 0 に対応します。
  4. 翌日、培地を5mLの新鮮な増幅培地と交換し、細胞の付着、形態(細胞は凝集した石畳の外観を有するべきである)、および数について毎日細胞を監視する。
    注:初期播種密度は、鼻ブラッシングの質および上皮細胞の割合によって異なる。新たに単離されたHNE細胞は、通常、3〜10日以内に80%〜90%のコンフルエンシーに達する。遅い増殖速度は、サンプル中の不十分な上皮細胞を示唆するものであり、廃棄されるべきである。

4. ヒト鼻上皮細胞の増幅と継代

  1. コラーゲンコートフラスコ上で37°Cおよび5%CO2で増幅培地中でヒト鼻上皮細胞を80%〜90%コンフルエントになるまで増殖させ、48〜72時間ごとに培地を交換する。25 cm 2 フラスコの場合は、5 mL の増幅培地を使用し、75 cm2 フラスコの場合は 10 mL を使用します。
  2. 細胞が80%~90%のコンフルエントに達したら、10mLのMg2+-およびCa2+フリーDPBSで細胞を洗浄し、吸引し、廃棄する。
  3. 25 cm 2フラスコに1 mLの0.25 %トリプシンを加え(または75 cm 2フラスコに2 mLのトリプシンを加え)、インキュベーター(37°C、5% CO2)に8〜12分間戻します。
  4. フラスコを手のひらでしっかりと叩いて、細胞が剥離するのを助けます。
  5. 10 mLの増幅培地を加え、酵素反応を停止した。フラスコを激しくすすぎ、10mLピペットを使用してフラスコ表面上に増幅培地を引き上げて排出し、細胞をすすぎ、剥離する。
  6. 500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てる。
  7. ペレットを5〜10mLの増幅培地に再懸濁する。
  8. 血球計数器を用いて細胞を計数する。
    メモ: この時点で細胞を凍結できます (手順 5.1 ~ 5.3 を参照)。さらなる増幅が必要な場合は、コラーゲンコーティングフラスコに再シードします(25cm2フラスコを3つの75cm2フラスコに拡張することができますが、それ以上の希釈は推奨されません)。

5. 初代鼻上皮細胞の凍結保存

注:バイオバンキングの前に継代1までHNE細胞を増殖させ、解凍時に細胞増殖を促進するのに十分な細胞を得る。しかしながら、バイオバンキングは、最初の通路0または通路2で可能である。以下の凍結保存ステップは、すべての通路に適合しています。

  1. 細胞計数後、500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てる
  2. ペレットを濃縮凍結培地に再懸濁し(表1)、mLあたりおよびクライオバイアルあたり3 x 106〜5 x 106個の細胞を得た。
  3. -80°Cの適切な凍結凍結容器中で毎分〜1°Cで温度を下げることによって細胞をゆっくりと凍結する。 翌日、保存した試料を長期保存のために窒素保存容器に移す(本研究は17ヶ月保存に制限されている)。

6. 凍結増幅HNE細胞の融解

  1. ウォーターバスを37°Cに温めます。 表1 に記載のように増幅培地を調製し、培地を37°Cに加温した。
  2. 窒素貯蔵タンクからクライオバイアルを取り出し、バイアル全体を水に浸さないように注意しながら、それらを水浴に素早く置きます。小さな凍った液滴だけが残っているときに、水浴からクライオバイアルを取り除きます。バイアルを70%のアルコールで拭き取り、乾拭き取り、フードの下に置きます。
  3. 1 mL ピペットを用いて、解凍した細胞を空の 15 mL チューブに移す。
  4. 滴下して、1mLの温かい増幅培地を加える。1分後、さらに1mLの増幅培地を加え、さらに1分間待ちます。
  5. 10mLの増幅培地を加え、500 x gで2分間遠心分離する。
  6. 上清を吸引して捨てる。細胞ペレットを、少なくとも1 x106 細胞/mLの細胞密度を達成するために必要な量の増幅培地に再懸濁する。
  7. 増幅培地を入れたコラーゲンコートフラスコに細胞を播種する。
    1. クライオビアルに4 x106個 以上の細胞が含まれている場合は、75 cm2 フラスコに10 mLの増幅培地でシードします。
    2. クライオビアルに含まれる細胞が4 x106 個未満の場合は、5 mLの増幅培地中で、25 cm 2 フラスコに細胞をシードします。
  8. 37°C、5%CO2 でインキュベートし、次の2〜3日間にわたる細胞増殖を目視で観察した。
  9. 次に、セクション4で詳述されているように細胞増幅を行う。
    注:ステップ4.7で回収された細胞が少ない場合。(すなわち、膨張前の通路0で凍結する場合)、ステップ6.5。および 6.6.省略することができ、細胞は遠心分離なしで25cm2 コラーゲンコーティングフラスコに直接播種することができる。その後、ジメチルスルホキシド(DMSO)を除去するために翌日に培地を交換しなければならない。

7. 気液界面におけるヒト鼻上皮細胞の分化

注:HNEは、前述のように気液界面で分化した10。

  1. 0.33cm2 のコラーゲンコーティング多孔質フィルターに330,000細胞/フィルターの密度で細胞を播種し、頂端側に300 μLの増幅培地、側底側に900 μLの気液培地を補充する。
  2. 3日後、頂端培地を吸引し、気液培地中で3〜4週間気液界面で細胞を培養し、分化上皮を樹立した。48〜72時間ごとに基礎培地を交換してください。

8. CFTR変調器

  1. CFTRモジュレーターを含む空気 - 液体培地を調製する。VX-445、VX-661、およびVX-809を終濃度3μMで使用し、VX-770を100nMで使用してください。コレクタABBV-2222を終濃度1 μMで、ポテンショネータABBV-974を10 μMで使用してください。100% DMSOを使用して、すべてのCFTR変調器を溶解します。
  2. 補正器培地と同量の100%DMSOを含む気液培地を調製する。
  3. 気液界面で増殖した分極HNE細胞の側底側に薬物またはDMSOを含む培地を添加し、37°Cで5%CO2中で24 時間インキュベートする。
  4. 24時間後、培地を吸引・廃棄し、ステップ8.1~8.2のように調製した新鮮な培地と交換し、さらに37°Cで5%CO2中で24 時間インキュベートする。

9. 室内調査

  1. 前述のように、電圧クランプ条件下で短絡電流測定値(Isc)を測定します 9.
    注:培養物の上皮経上皮電気抵抗(TEER)を箸電圧計で測定し、少なくとも200 Ω・cm2 に達した培養物のみを以下の実験で検討した。分極HNEセルのフィルタをUssingチャンバに取り付け、短絡電流測定(Isc)を電圧クランプ条件下で測定しました。

10. 免疫細胞化学

  1. 前述のように免疫検出を行う9.
    注:CFTR免疫検出は、抗CFTR C末端(24-1)モノクローナル抗体を用いて1/100希釈で一晩行った。ゾナ-オクルーデン-1(ZO-1)(1/500希釈)、α-チューブリン(1/300希釈)、Muc 5AC(1/250希釈)およびサイトケラチン8(1/250希釈)染色を、追加のフィルターで行った。PBS-Triton-X100で0.1%洗浄した後、Alexa 488または594に結合させたヤギ二次抗体を10%ヤギ血清(1/1000希釈)に30分間添加した。最終洗浄後、フィルターを支持体から切断し、DAPIを含むベクタシールドマウント培地を装着した。共焦点顕微鏡(63x/1.4オイル微分干渉コントラストλブルーPL APO対物レンズ)を使用して画像をキャプチャし、ImageJソフトウェアで分析しました。

11. 統計分析

  1. 適切なソフトウェアを使用して統計分析を実行します。
    注:統計分析は、S.A.Sソフトウェアを使用して実行しました。患者ごとおよび病態ごとに複数のHNEフィルターが得られたため、定量パラメータは患者ごとの中央値(SEM±)として表されました。比較(平均±SD)は、ウィルコクソン一致ペア符号付き順位検定または非対応t検定を用いて行った。

結果

気液界面で培養された新鮮なHNE細胞は、免疫染色によって評価されるように、分極および分化した呼吸器上皮の典型的な特徴を示す(図1)。HNE細胞は、繊毛化(陽性α-チューブリン染色)および非繊毛粘液産生杯細胞(陽性Muc5Ac免疫染色)からなる擬似重層化呼吸器上皮の in vivo 状況を模倣する上皮細胞の不均一な層(陽性ケラチン8免疫染色)に再分化する。全体的な上皮...

ディスカッション

個別化医療の文脈でCFTR活性を測定するためのヒト気管支上皮(HBE)細胞の代理として患者由来の鼻上皮細胞を使用することが、HNEが培養物9、11における細胞の特性を再現することとして提案されている。HBE細胞培養に対するHNEの強力な利点は、それらが簡単かつ非侵襲的にサンプリングされることです。HNE細胞培養における短絡電流測定は、上皮を?...

開示事項

著者らは、この出版物または科学ビデオ制作に関連する競合する金銭的利益を報告していない。

謝辞

私たちは、研究に参加してくれたすべての患者とその家族に暖かく感謝します。この研究は、フランス・ヴァンクレ・ラ・ムコビシドース協会からの助成金によって支援されました。フランス協会ABCF 2およびVertex Pharmaceuticals Innovation Awards。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
ABBV-2222SelleckchemS8535
ABBV-974SelleckchemS8698
Advanced DMEM/F-12Life Technologies12634010
Alexa 488 goat secondary antibodyInvitrogenA11001
Alexa 594 goat secondary antibodyInvitrogenA11012
Amphotericin BLife Technologies15290026
Anti-alpha-tubulin antibodyAbcamab80779
Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)R&D SystemsMAB25031
Anti-cytokeratin 8 antibodyProgen61038
Anti-Muc5AC antibodySanta Cruz Biotechsc-20118
Anti-ZO-1 antibodySanta Cruz Biotechsc-10804
Ciprofloxacinprovided by Necker Hospital Pharmacy
ColimycinSanofiprovided by Necker Hospital Pharmacy
Collagen type IVSigma-Aldrich MerckC-7521
cytology brushLaboratory GYNEAS02.104
DMSOSigma-Aldrich MerckD2650
EGFLife TechnologiesPHG0311
EpinephrinSigma-Aldrich MerckE4375
F12-Nutrient MixtureLife Technologies11765054
FBSLife Technologies10270106
FerticultFertipro NVFLUSH020
Flasks 25Thermo Scientific156.367
Flasks 75Thermo Scientific156.499
Glacial acetic acidVWR20104.298
HEPESSigma-Aldrich MerckH3375
HydrocortisoneSigma-Aldrich MerckSLCJ0893
InsulinSigma-Aldrich MerckI0516
Mg2+ and Ca2+-free DPBSLife Technologies14190094
Penicillin/StreptomycinLife Technologies15140130
TazocillinMylanprovided by Necker Hospital Pharmacy
Transwell FiltersSigma-Aldrich MerckCLS3470-48EA
Triton-X100Sigma-Aldrich MerckT8787
Trypsin 0,25%Life Technologies25200056
Vectashield mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
VX-445SelleckchemS8851
VX-661SelleckchemS7059
VX-770SelleckchemS1144
VX-809SelleckchemS1565
Xylocaine naphazoline 5%Aspen Franceprovided by Necker Hospital Pharmacy
Y-27632SelleckchemS1049

参考文献

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