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Resumo

Aqui descrevemos o isolamento, amplificação e diferenciação das células epiteliais nasais primárias (HNE) na interface ar-líquido e um protocolo de biobanco permitindo congelar com sucesso e, em seguida, descongelar HNE amplificada. O protocolo analisa propriedades eletrofisiológicas de células HNE diferenciadas e correção de secreção de cloreto relacionada ao CFTR em diferentes tratamentos moduladores.

Resumo

As células epiteliais nasais humanas (HNE) são fáceis de coletar por escovação nasal simples e não invasiva. As células HNE primárias derivadas do paciente podem ser amplificadas e diferenciadas em um epitélio pseudo-estratificado em condições de interface ar-líquido para quantificar o transporte de Cloreto mediado por AMP cíclico (Cl-) como um índice da função CFTR (Cystic Fibrosis Conductance Regulator, regulador de condução transmembrana). Se etapas críticas como qualidade da escovação nasal e densidade celular após a criopreservação forem executadas de forma eficiente, as células HNE podem ser biobancaradas com sucesso. Além disso, estudos atuais de curto-circuito demonstram que o congelamento não modifica significativamente as propriedades eletrofisiológicas das células HNE e a resposta aos moduladores CFTR. Nas condições de cultura utilizadas neste estudo, quando menos de 2 x 106 células são congeladas por criovial, a taxa de falha é muito alta. Recomendamos congelar pelo menos 3 x 106 células por criovial. Mostramos que as terapias duplas que combinam um corretivo cftr com um potencializador CFTR têm uma eficácia de correção comparável para a atividade de CFTR em células HNE F508del-homozygous. Terapia tripla VX-445 + VX-661 + VX-770 aumentou significativamente a correção da atividade cftr em comparação com a dupla terapia VX-809 + VX-770. A medida da atividade de CFTR em células HNE é um promissor biomarcador pré-clínico útil para orientar a terapia moduladora CFTR.

Introdução

A Fibrose Cística (CF) é uma doença recessiva autossômica resultante de mutações no gene cftr (Cistic Fibrostic Fibrosis Conductance Regulator, regulador de condução da fibrose transmembrana) que leva à ausência ou disfunção da proteína CFTR, um canal de ânion localizado na superfície apical da epitélio 1,2. Os recentes avanços na terapia cftr melhoraram o prognóstico da doença, e os últimos medicamentos aprovados que combinam corretivos cftr e potencializadores de CFTR levaram a grandes melhorias na função pulmonar e qualidade de vida para pacientes cf portadores da mutação mais frequente p.Phe508del mutação (F508del)3,4. Apesar desse progresso terapêutico promissor, cerca de 10% dos pacientes com CF são inelegíveis, pois carregam mutações que são inscuáveis por esses moduladores de CFTR. Para esses pacientes, é necessário testar outras drogas ou combinações de medicamentos para encontrar a combinação mais eficiente para mutações específicas, destacando a importância de terapias personalizadas.

As células epiteliais nasais humanas (HNE) são fáceis de coletar por escovação nasal simples e não invasiva e permitem quantificação do transporte cíclico de Cloreto mediado por AMP (Cl−) como um índice de função CFTR. As células HNE produzem um modelo preciso das vias aéreas humanas, mas sua vida útil é limitada na cultura. Graças à otimização das técnicas de cultura, as células HNE primárias derivadas do paciente podem ser reprogramadas condicionalmente com o inibidor de quinase (ROCKi), amplificado e diferenciado em um epitélio pseudo-estratificado em condições de interface ar-líquido (ALI) em filtrosmicroporosos 5,6. Existem inúmeros protocolos culturais para a cultura HNE (comercialmente disponíveis, sem soro, "caseiro", co-cultura com células alimentador, etc.), e a escolha das condições de mídia e cultura foram descritas para impactar o crescimento, a diferenciação populacional celular e a função epitelial 7,8. O protocolo aqui apresenta um método simplificado, sem alimentação, de amplificação ROCKi que permite obter com sucesso um grande número de células HNE que são então diferenciadas em ensaios de função CFTR para CFTR.

Demonstramos que, em células HNE diferenciadas, um tratamento de 48 horas com moduladores cftr é suficiente para induzir a correção eletrofisiológica da corrente cl dependente de CFTR e que a correção observada in vitro pode estar correlacionada com a melhora clínica do paciente9. As células HNE, portanto, representam um modelo apropriado não apenas para pesquisas fundamentais de CF, mas para estudos pré-clínicos com testes moduladores CFTR específicos do paciente. Nesse contexto de terapia personalizada, o objetivo do protocolo foi validar que as células HNE criopreservadas de pacientes cf, cultivadas em nossas condições, eram um modelo apropriado para estudos de correção de CFTR, e resultados semelhantes poderiam ser esperados ao comparar o transporte cl dependente de CFTR de células frescas e descongeladas. O estudo também avaliou a eficácia de diferentes moduladores de CFTR ao utilizar terapias duplas e triplas.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados seguindo as diretrizes e regulamentos descritos pela Declaração de Helsinque e pela lei Huriet-Serusclat sobre ética em pesquisa humana.

1. Preparação de frascos e diferentes mídias

  1. Prepare amplificação, líquido-ar e meio de congelamento conforme descrito na Tabela 1.
  2. Prepare uma solução de estoque de colágeno humano IV dissolvendo 50 mg de colágeno em 100 mL de ácido acético glacial de 0,2%. Misture um agitador magnético por pelo menos 1 h, e o filtro esteriliza a solução. Armazene a 4 °C por até 6 meses em uma garrafa de vidro, protegida contra a luz.
  3. Prepare uma solução de trabalho de colágeno IV diluindo a solução de estoque 1:5 em água duplamente destilada. Armazene a 4 °C por até 6 meses.
  4. Cubra frascos de cultura de células plásticas ou filtros transwell com a solução de trabalho de colágeno. Distribua uniformemente 100 μL por 0,33 cm2 filtros transwell, 500 μL para frascos de 25 cm2 e 1 mL para frascos de 75 cm2 em toda a superfície de crescimento do frasco.
    NOTA: Isso pode ser alcançado inclinando suavemente o frasco de um lado para o outro. Alternativamente, para facilitar o revestimento dos frascos, um volume aumentado pode ser usado, e quando toda a superfície é uniformemente coberta, a solução de colágeno é aspirada a deixar apenas o volume indicado. A solução aspirada de colágeno pode então ser usada imediatamente para revestir o próximo frasco (ou seja, para três frascos de 75 cm2 , distribuir 3 mL de solução de colágeno uniformemente no primeiro frasco, aspirar 2 mL, que são então usados para o próximo frasco, e assim por diante).
  5. Deixe os frascos de cultura celular na incubadora por um mínimo de 2h ou durante a noite. Aspire bem o colágeno e deixe os frascos secarem na incubadora ou sob o capô por um mínimo de 20 minutos ou durante a noite.
  6. Lave com 10 mL de MG2+- e CA2+-free DPBS, deixe secar na incubadora e armazene em papel alumínio para proteger contra a luz. Armazene os frascos por até 6 meses em temperatura ambiente (RT).

2. Escovação nasal

NOTA: Certifique-se de que a escovação nasal seja realizada enquanto o participante não tiver uma infecção aguda. Se os pacientes cf apresentarem uma infecção pulmonar, consulte o antibiograma do paciente e adicione antibióticos adicionais ao meio de amplificação. As células epiteliais nasais humanas foram coletadas por escovação nasal de pacientes F508del/F508del, como descrito anteriormente9.

  1. Peça ao paciente para assoar o nariz, em seguida, anestesiar topicamente a mucosa de ambas as narinas usando malhas de algodão embebidas em xylocaine 5% com solução de naphazolina.
  2. Escove suavemente a parede medial e o turbinado inferior de ambas as narinas usando uma escova de citologia. Mergulhe a escova em um tubo de 15 mL com 2 mL de meio de descarga comercialmente disponível; agitar suavemente para desapegar células. Repita escovação na segunda narina.
  3. Adicione os seguintes antibióticos ao meio de descarga: Penicilina (100 U/mL), Estreptomicina (100 μg/mL), Tazocillin (10 μg/mL), Anfotericina B (2,5 μg/mL) e Colimycina (16 μg/mL).
    NOTA: As escovações nasais podem ser enviadas na RT para laboratórios dedicados para expansão e cultura e podem ser semeadas até 72 h após a escovação.

3. Isolamento do HNE

NOTA: O HNE foi isolado da escova de citologia, lavado com DPBS mg++ e ca2+- livre, dissociado com 0,25% de Trypsin, e semeado em um frasco de plásticode 25 cm 2 como descrito anteriormente10.

  1. Desprender células da escova de citologia passando repetidamente o pincel através de um cone de pipeta de 1000 μL e enxaguando com 2 mL de MG2+- e Ca2+-free DPBS. Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 °C e descartar o supernatante.
  2. Resuspenda a pelota em 0,25% trypsin por 8-12 min para dissociar células. Pare a reação enzimática adicionando 5 mL do meio de amplificação.
  3. Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 °C e descartar o supernatante. Resuspenque a pelota em 8 mL do meio de amplificação e semente em um frasco revestido de colágeno de25 cm. Cresça a 37 °C e 5% de CO2. Isso corresponde à passagem 0.
  4. No dia seguinte, substitua o meio por 5 mL de meio de amplificação fresco e monitore as células diariamente para fixação, morfologia (as células devem ter aparência coesa de paralelepípedos) e número.
    NOTA: A densidade inicial de semeadura varia dependendo da qualidade da escovação nasal e da proporção de células epiteliais. As células HNE recém-isoladas geralmente atingem 80%-90% de confluência dentro de 3-10 dias. Uma taxa de crescimento mais lenta sugere células epiteliais insuficientes na amostra e deve ser descartada.

4. Amplificação e passagem de células epiteliais nasais humanas

  1. Cresça células epiteliais nasais humanas no meio de amplificação a 37 °C e 5% de CO2 em frascos revestidos de colágeno até 80%-90% de confluência, mudando de meio a cada 48-72 h. Para frascos de25 cm 2 , utilize 5 mL de meio de amplificação e 10 mL para frascos de 75 cm2 .
  2. Quando as células atingirem 80%-90% de confluência, lave as células com 10 mL de MG2+- e CA2+-free DPBS, aspire e descarte.
  3. Adicione 1 mL de 0,25% Trypsin para um frasco de25 cm 2 (ou 2 mL de Trypsin para um frasco de 75 cm2 ) e retorne à incubadora (37 °C, 5% CO2) por 8-12 min.
  4. Bata no frasco com firmeza, com a palma da mão, para ajudar as células a se desprenderem.
  5. Adicione 10 mL do meio de amplificação para parar a reação enzimática. Enxágue vigorosamente o frasco, usando a pipeta de 10 mL para elaborar e expulsar o meio de amplificação sobre a superfície do frasco para enxaguar e desprender as células.
  6. Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 °C e descartar o supernatante.
  7. Resuspense a pelota em 5-10 mL do meio de amplificação.
  8. Conte as células usando um hemócito.
    NOTA: As células podem ser congeladas neste ponto (ver passos 5.1-5.3). Se for necessária uma nova amplificação, a re-semente em frascos revestidos de colágeno (um frasco de25 cm 2 pode ser expandido em três frascos de 75 cm2 , uma diluição maior não é recomendada).

5. Criopreservação de células epiteliais nasais primárias

NOTA: Cultivar células HNE até a passagem 1 antes do biobanco para obter células suficientes para facilitar o crescimento celular quando descongelado. O biobanco é, no entanto, possível na passagem inicial 0 ou na passagem 2. As seguintes etapas de criopreservação são adaptadas a todas as passagens.

  1. Após a contagem celular, centrífuga a 500 x g por 5 min a 4 °C, e descarte o supernasce
  2. Resuspengem a pelota no meio de congelamento enriquecido (Tabela 1) para obter 3 x 106-5 x 106 células por mL e por criovial.
  3. Congele lentamente as células reduzindo a temperatura a ~1 °C por minuto em um recipiente de congelamento crio-congelante apropriado a -80 °C. No dia seguinte, mova a amostra preservada para um recipiente de armazenamento de nitrogênio para armazenamento a longo prazo (o presente estudo é limitado a 17 meses de armazenamento).

6. Descongelamento de células HNE congeladas amplificadas

  1. Aqueça o banho de água a 37 °C. Prepare o meio de amplificação conforme descrito na Tabela 1 e aqueça o médio a 37 °C.
  2. Remova os criovials do tanque de armazenamento de nitrogênio e coloque-os rapidamente no banho de água, tomando cuidado para não submergir todo o frasco na água. Remova os criovials do banho de água quando apenas uma pequena gota congelada permanecer. Limpe o frasco com 70% de álcool, limpe e coloque sob o capô.
  3. Usando uma pipeta de 1 mL, transfira as células descongeladas para um tubo vazio de 15 mL.
  4. De forma em gota, adicione 1 mL de meio de amplificação quente. Depois de 1 min, adicione mais 1 mL de meio de amplificação e espere mais um minuto.
  5. Adicione 10 mL do meio de amplificação e centrífuga por 2 min a 500 x g.
  6. Aspire e descarte o supernaspe. Resuspenda a pelota celular em um volume de meio de amplificação necessário para alcançar uma densidade celular de pelo menos 1 x 106 células/mL.
  7. Semear as células em um frasco revestido de colágeno contendo o meio de amplificação.
    1. Se o criovial contiver mais de 4 x 106 células, semente em um frasco de 75 cm2 , em 10 mL do meio de amplificação
    2. Se o criovial contiver menos de 4 x 106 células, as células de sementes em um frasco de25 cm 2 , em 5 mL do meio de amplificação
  8. Incubar a 37 °C, 5% de CO2 e observar visualmente a expansão celular nos próximos 2-3 dias.
  9. Em seguida, realize a amplificação celular conforme detalhado na seção 4.
    NOTA: Se poucas células foram colhidas na etapa 4.7. (ou seja, se congelar na passagem 0 antes da expansão), etapas 6.5. e 6,6. pode ser omitido, e as células podem ser semeadas diretamente em um frasco revestido de colágeno de25 cm 2 sem centrifugação. Em seguida, o meio deve ser alterado no dia seguinte para remover o sulfóxido de dimetila (DMSO).

7. Diferenciação das células epiteliais nasais humanas na interface ar-líquido

NOTA: O HNE foi diferenciado na interface ar-líquido como descrito anteriormente10.

  1. Seme as células a uma densidade de 330.000 células/filtro em 0,33 cm2 filtros porosos revestidos de colágeno e suplemento com 300 μL do meio de amplificação no lado apical e 900 μL do meio líquido-ar no lado basolateral.
  2. Após 3 dias, aspire o meio apical e a cultura das células na interface ar-líquido por 3-4 semanas no meio ar-líquido para estabelecer um epitélio diferenciado. Troque o meio basal a cada 48-72 h.

8. Moduladores CFTR

  1. Prepare o meio líquido-ar contendo moduladores CFTR. Use VX-445, VX-661 e VX-809 em uma concentração final de 3 μM e VX-770 a 100 nM. Use corretivo ABBV-2222 em concentração final de 1 μM e potencializador ABBV-974 a 10 μM. Use 100% DMSO para dissolver todos os moduladores CFTR.
  2. Prepare o meio ar-líquido contendo a mesma quantidade de DMSO 100% como no meio correto.
  3. Adicione o meio contendo drogas ou DMSO ao lado basolateral das células HNE polarizadas cultivadas em uma interface ar-líquido e incubar por 24 h em 5% de CO2 a 37 °C.
  4. Após 24h, aspire e descarte o meio e substitua por meio fresco preparado como nas etapas 8.1-8.2., e incuba ainda mais por um período de 24h em 5% de CO2 a 37 °C.

9. Estudos de câmara de Ussing

  1. Meça as medidas de corrente de curto-circuito (Isc) sob condições de repressão de tensão, conforme descrito anteriormente9.
    NOTA: A resistência elétrica transeptelial (TEER) das culturas foi medida com um voltímetro de pauzinho, e apenas culturas que atingiram pelo menos 200 Ω·cm2 foram consideradas para os seguintes experimentos. Filtros de células HNE polarizadas foram montados em câmaras de Ussing, e as medidas de corrente de curto-circuito (Isc) foram medidas sob condições de repressão de tensão.

10. Imunocytoquímica

  1. Realize a detecção de imunodetecção como descrito anteriormente9.
    NOTA: A imunodetecção de CFTR foi realizada utilizando-se o anticorpo monoclonal anti-CFTR C (24-1) durante a noite, em uma diluição de 1/100. Zona-ocluano-1 (ZO-1) (diluição 1/500), alfa-tubulina (diluição de 1/300), Muc 5AC (diluição de 1/250) e cytokeratin 8 (diluição de 1/250) foram feitas em filtros adicionais. Após a lavagem com PBS-Triton-X100 0,1%, anticorpos secundários de cabra conjugados à Alexa 488 ou 594 foram adicionados por 30 min em 10% de soro de cabra (diluição de 1/1000). Após uma lavagem final, os filtros foram cortados do suporte e montados com meio de montagem Vectashield contendo DAPI. Um microscópio confocal (63x/1.4 contraste de interferência diferencial de óleo λ azul PL APO objetivo) foi utilizado para capturar imagens, que foram analisadas com o software ImageJ.

11. Análise estatística

  1. Realize análises estatísticas utilizando software apropriado.
    NOTA: A análise estatística foi realizada utilizando-se o software S.A.S. Como foram obtidos diversos filtros de HNE por paciente e por condição, os parâmetros quantitativos foram expressos como valores medianos (± SEM) por paciente. As comparações (média ± SD) foram realizadas utilizando-se um teste de classificação assinado por Wilcoxon ou um teste t não remunerado.

Resultados

Células HNE frescas cultivadas na interface ar-líquido exibem características típicas do epitélio respiratório polarizado e diferenciado, conforme avaliado pela imunostaining (Figura 1). As células HNE se refaziem em uma camada heterogênea de células epiteliais (queratina positiva 8 imunostaining) que imitam a situação in vivo de um epitélio respiratório pseudo-estratificado composto de ciliado (coloração positiva alfa-tubulina) e células de cálco não ciliadas prod...

Discussão

O uso de células epiteliais nasais derivadas do paciente como substitutos para células epiteliais brônquicas humanas (HBE) para medir a atividade de CFTR no contexto da medicina personalizada tem sido proposto como propriedades de células de reprodução de HNE na cultura 9,11. A forte vantagem do HNE sobre as culturas celulares HBE é que elas são facilmente e não invasivamente amostradas. As medições de corrente de curto-circuito nas culturas celulares ...

Divulgações

Os autores não relatam interesses financeiros concorrentes relacionados a esta publicação ou produção de vídeo científico.

Agradecimentos

Agradecemos calorosamente a todos os pacientes e suas famílias pela participação no estudo. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Associação Francesa Vaincre la Mucoviscidose; Associação Francesa ABCF 2 e Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
ABBV-2222SelleckchemS8535
ABBV-974SelleckchemS8698
Advanced DMEM/F-12Life Technologies12634010
Alexa 488 goat secondary antibodyInvitrogenA11001
Alexa 594 goat secondary antibodyInvitrogenA11012
Amphotericin BLife Technologies15290026
Anti-alpha-tubulin antibodyAbcamab80779
Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)R&D SystemsMAB25031
Anti-cytokeratin 8 antibodyProgen61038
Anti-Muc5AC antibodySanta Cruz Biotechsc-20118
Anti-ZO-1 antibodySanta Cruz Biotechsc-10804
Ciprofloxacinprovided by Necker Hospital Pharmacy
ColimycinSanofiprovided by Necker Hospital Pharmacy
Collagen type IVSigma-Aldrich MerckC-7521
cytology brushLaboratory GYNEAS02.104
DMSOSigma-Aldrich MerckD2650
EGFLife TechnologiesPHG0311
EpinephrinSigma-Aldrich MerckE4375
F12-Nutrient MixtureLife Technologies11765054
FBSLife Technologies10270106
FerticultFertipro NVFLUSH020
Flasks 25Thermo Scientific156.367
Flasks 75Thermo Scientific156.499
Glacial acetic acidVWR20104.298
HEPESSigma-Aldrich MerckH3375
HydrocortisoneSigma-Aldrich MerckSLCJ0893
InsulinSigma-Aldrich MerckI0516
Mg2+ and Ca2+-free DPBSLife Technologies14190094
Penicillin/StreptomycinLife Technologies15140130
TazocillinMylanprovided by Necker Hospital Pharmacy
Transwell FiltersSigma-Aldrich MerckCLS3470-48EA
Triton-X100Sigma-Aldrich MerckT8787
Trypsin 0,25%Life Technologies25200056
Vectashield mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
VX-445SelleckchemS8851
VX-661SelleckchemS7059
VX-770SelleckchemS1144
VX-809SelleckchemS1565
Xylocaine naphazoline 5%Aspen Franceprovided by Necker Hospital Pharmacy
Y-27632SelleckchemS1049

Referências

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