Cellules épithéliales nasales humaines primaires : la biobanque dans le contexte de la médecine de précision

Résumé

Nous décrivons ici l’isolement, l’amplification et la différenciation des cellules primaires de l’épithélium nasal humain (HNE) à l’interface air-liquide et un protocole de biobanque permettant de congeler avec succès puis de décongeler l’HNE amplifiée. Le protocole analyse les propriétés électrophysiologiques des cellules HNE différenciées et la correction de la sécrétion de chlorure liée au CFTR sur différents traitements modulateurs.

Résumé

Les cellules épithéliales nasales humaines (HNE) sont faciles à prélever par simple brossage nasal non invasif. Les cellules HNE primaires dérivées du patient peuvent être amplifiées et différenciées en un épithélium pseudo-stratifié dans des conditions d’interface air-liquide pour quantifier le transport cyclique du chlorure (Cl^-) médié par l’AMP en tant qu’indice de la fonction de régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR). Si des étapes critiques telles que la qualité du brossage nasal et la densité cellulaire lors de la cryoconservation sont effectuées efficacement, les cellules HNE peuvent être biobancées avec succès. De plus, les études de courant de court-circuit démontrent que la décongélation ne modifie pas de manière significative les propriétés électrophysiologiques des cellules HNE et leur réponse aux modulateurs CFTR. Dans les conditions de culture utilisées dans cette étude, lorsque moins de 2 x 10⁶ cellules sont congelées par cryoviale, le taux d’échec est très élevé. Nous recommandons de congeler au moins 3 x 10⁶ cellules par cryovial. Nous montrons que les bithérapies combinant un correcteur CFTR avec un potentiateur CFTR ont une efficacité de correction comparable pour l’activité CFTR dans les cellules HNE homozygotes F508del. La trithérapie VX-445 + VX-661 + VX-770 a significativement augmenté la correction de l’activité CFTR par rapport à la bithérapie VX-809 + VX-770. La mesure de l’activité CFTR dans les cellules HNE est un biomarqueur préclinique prometteur utile pour guider le traitement par modulateur CFTR.

Introduction

La fibrose kystique (FK) est un trouble autosomique récessif résultant de mutations du gène régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) conduisant à l’absence ou au dysfonctionnement de la protéine CFTR, un canal anionique situé à la surface apicale de l’épithélium ^1,2. Les progrès récents dans le traitement CFTR ont amélioré le pronostic de la maladie, et les derniers médicaments approuvés combinant des correcteurs CFTR et des potentialisateurs CFTR ont conduit à des améliorations majeures de la fonction pulmonaire et de la qualité de vie des patients atteints de mucoviscidose porteurs de la mutation p.Phe508del la plus fréquente (F508del)^3,4. Malgré ces progrès thérapeutiques prometteurs, environ 10% des patients atteints de mucoviscidose ne sont pas éligibles car ils sont porteurs de mutations incupérables par ces modulateurs CFTR. Pour ces patients, il est nécessaire de tester d’autres médicaments ou combinaisons de médicaments pour trouver la combinaison la plus efficace pour des mutations spécifiques, soulignant l’importance des thérapies personnalisées.

Les cellules épithéliales nasales humaines (HNE) sont faciles à prélever par brossage nasal simple et non invasif et permettent de quantifier le transport cyclique du chlorure (Cl⁻) médié par l’AMP en tant qu’indice de la fonction CFTR. Les cellules HNE donnent un modèle précis des voies respiratoires humaines, mais leur durée de vie est limitée en culture. Grâce à l’optimisation des techniques de culture, les cellules HNE primaires dérivées du patient peuvent être reprogrammées conditionnellement avec un inhibiteur de kinase rho-associé (ROCKi), amplifiées et différenciées en un épithélium pseudo-stratifié dans des conditions d’interface air-liquide (ALI) sur des filtres microporeux ^5,6. Il existe de nombreux protocoles de culture pour la culture de l’HNE (disponibles dans le commerce, sans sérum, « fait maison », co-culture avec des cellules nourricières, etc.), et le choix des milieux et des conditions de culture a été décrit comme ayant un impact sur la croissance, la différenciation de la population cellulaire et la fonction épithéliale ^7,8. Le protocole présente ici une méthode d’amplification ROCKi simplifiée, sans chargeur, qui permet d’obtenir avec succès un grand nombre de cellules HNE qui sont ensuite différenciées à ALI pour les tests de fonction CFTR.

Nous avons démontré que, dans les cellules HNE différenciées, un traitement de 48 h avec des modulateurs CFTR est suffisant pour induire une correction électrophysiologique du courant Cl^- dépendant du CFTR et que la correction observée in vitro peut être corrélée à l’amélioration clinique du patient⁹. Les cellules HNE représentent donc un modèle approprié non seulement pour la recherche fondamentale sur la FK, mais aussi pour les études précliniques avec des tests de modulateur CFTR spécifiques au patient. Dans ce contexte de thérapie personnalisée, l’objectif du protocole était de valider que les cellules HNE cryoconservées de patients atteints de mucoviscidose, cultivées dans nos conditions, constituaient un modèle approprié pour les études de correction CFTR, et des résultats similaires pouvaient être attendus lors de la comparaison du transport Cl^- dépendant du CFTR à partir de cellules fraîches et congelées-décongelées. L’étude a également évalué l’efficacité de différents modulateurs CFTR lors de l’utilisation de thérapies doubles et triples.

Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et règlements décrits par la Déclaration d’Helsinki et la loi Huriet-Serusclat sur l’éthique de la recherche humaine.

1. Préparation des flacons et des différents milieux

1. Préparer le milieu d’amplification, d’air liquide et de congélation comme décrit dans le tableau 1.
2. Préparer une solution mère de collagène IV humain en dissolvant 50 mg de collagène dans 100 mL d’acide acétique glacial à 0,2%. Mélanger sur un agitateur magnétique pendant au moins 1 h, et filtrer stériliser la solution. Conserver à 4 °C jusqu’à 6 mois dans une bouteille en verre, à l’abri de la lumière.
3. Préparer une solution de travail de collagène IV en diluant la solution mère 1:5 dans de l’eau doublement distillée. Conserver à 4 °C jusqu’à 6 mois.
4. Enduire les flacons de culture cellulaire en plastique ou les filtres transwell avec la solution de travail du collagène. Répartir uniformément 100 μL pour 0,33 cm² filtres transwell, 500 μL pour 25 cm² flacons et 1 mL pour 75 cm² flacons sur toute la surface de croissance du flacon.
   REMARQUE: Cela peut être réalisé en inclinant doucement la fiole d’un côté à l’autre. Alternativement, pour faciliter le revêtement des flacons, un volume accru peut être utilisé, et lorsque toute la surface est uniformément recouverte, la solution de collagène est aspirée pour ne laisser que le volume indiqué. La solution de collagène aspirée peut ensuite être utilisée immédiatement pour enrober la fiole suivante (c’est-à-dire, pour trois fioles de 75 cm² , répartir uniformément 3 mL de solution de collagène dans la première fiole, aspirer 2 mL, qui sont ensuite utilisées pour la fiole suivante, etc.).
5. Laissez les flacons de culture cellulaire dans l’incubateur pendant au moins 2 h ou pendant la nuit. Aspirer soigneusement le collagène et laisser sécher les flacons dans l’incubateur ou sous le capot pendant au moins 20 minutes ou toute la nuit.
6. Laver avec 10 mL de DPBS sans Mg²⁺ et Ca²⁺, laisser sécher dans l’incubateur et conserver dans du papier d’aluminium à l’abri de la lumière. Conservez les flacons jusqu’à 6 mois à température ambiante (RT).

2. Brossage nasal

REMARQUE: Assurez-vous que le brossage nasal est effectué pendant que le participant n’a pas d’infection aiguë. Si les patients atteints de mucoviscidose présentent une infection pulmonaire, reportez-vous à l’antibiogramme du patient et ajoutez des antibiotiques supplémentaires au milieu d’amplification. Les cellules épithéliales nasales humaines ont été prélevées par brossage nasal chez des patients F508del/F508del comme décrit précédemment⁹.

1. Demandez au patient de se moucher, puis anesthésiez topiquement la muqueuse des deux narines à l’aide de mailles de coton imbibées de xylocaïne à 5% avec une solution de naphazoline.
2. Brossez doucement la paroi médiale et le cornet inférieur des deux narines à l’aide d’une brosse de cytologie. Tremper la brosse dans un tube de 15 mL avec 2 mL de milieu de rinçage disponible dans le commerce; agiter doucement pour détacher les cellules. Répétez le brossage dans la deuxième narine.
3. Ajouter les antibiotiques suivants au milieu de rinçage : pénicilline (100 U/mL), streptomycine (100 μg/mL), tazocilline (10 μg/mL), amphotéricine B (2,5 μg/mL) et colimycine (16 μg/mL).
   REMARQUE: Les brossages nasaux peuvent être expédiés à RT à des laboratoires dédiés pour l’expansion et la culture et peuvent être ensemencés jusqu’à 72 h après le brossage.

3. Isolement de HNE

REMARQUE: Les HNE ont été isolés de la brosse de cytologie, lavés avec du DPBS sans Mg 2⁺ et Ca²⁺, dissociés avec 0,25% de trypsine et ensemencés sur une fiole en plastique^{de 25 cm 2} comme décrit précédemment¹⁰.

1. Détacher les cellules de la brosse de cytologie en passant à plusieurs reprises la brosse à travers un cône de pipette de 1000 μL et en rinçant avec 2 mL de DPBS sans Mg 2⁺ et Ca²⁺. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
2. Remettre la pastille dans 0,25% de trypsine pendant 8 à 12 minutes pour dissocier les cellules. Arrêtez la réaction enzymatique en ajoutant 5 mL de milieu d’amplification.
3. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant. Remettre la pastille dans 8 mL du milieu d’amplification et ensemencer sur une fiole enduite de collagène^{de 25 cm 2} . Cultiver à 37 °C et 5 % de CO₂. Cela correspond au passage 0.
4. Le lendemain, remplacez le milieu par 5 mL de milieu d’amplification frais et surveillez quotidiennement les cellules pour l’attachement, la morphologie (les cellules doivent avoir un aspect pavé cohésif) et le nombre.
   REMARQUE: La densité initiale d’ensemencement varie en fonction de la qualité du brossage nasal et de la proportion de cellules épithéliales. Les cellules HNE fraîchement isolées atteignent généralement une confluence de 80% à 90% dans les 3 à 10 jours. Un taux de croissance plus lent suggère l’insuffisance de cellules épithéliales dans l’échantillon et doit être jeté.

4. Amplification et passage des cellules épithéliales nasales humaines

1. Cultiver des cellules épithéliales nasales humaines dans le milieu d’amplification à 37 °C et 5 % de CO₂ sur des flacons enrobés de collagène jusqu’à une confluence de 80 % à 90 %, en changeant de milieu toutes les 48 à 72 h. Pour les flacons^{de 25 cm 2} , utilisez 5 mL de milieu d’amplification et 10 mL pour les flacons de 75 cm² .
2. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 % à 90 %, lavez les cellules avec 10 mL de DPBS sans Mg²⁺ et Ca²⁺, aspirez et jetez-les.
3. Ajouter 1 mL de trypsine à 0,25 % pour une fiole^{de 25 cm à 2} (ou 2 mL de trypsine pour une fiole de 75 cm^{à 2} ) et retourner à l’incubateur (37 °C, 5 % de CO₂) pendant 8 à 12 min.
4. Tapotez fermement la fiole, avec la paume de la main, pour aider les cellules à se détacher.
5. Ajouter 10 mL du milieu d’amplification pour arrêter la réaction enzymatique. Rincer vigoureusement la fiole à l’aide de la pipette de 10 mL pour aspirer et expulser le milieu d’amplification sur la surface de la fiole afin de rincer et de détacher les cellules.
6. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
7. Remettre la pastille dans 5 à 10 mL du milieu d’amplification.
8. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
   REMARQUE : Les cellules peuvent être gelées à ce stade (voir les étapes 5.1 à 5.3). Si une amplification supplémentaire est nécessaire, réensemencez sur des flacons enrobés de collagène (une fiole^{de 25 cm 2} peut être expansée en trois fioles de 75 cm² , une dilution plus importante n’est pas recommandée).

5. Cryoconservation des cellules épithéliales nasales primaires

REMARQUE: Cultiver des cellules HNE jusqu’au passage 1 avant la biobanque pour obtenir suffisamment de cellules pour faciliter la croissance cellulaire lorsqu’elles sont décongelées. La biobanque est toutefois possible au passage initial 0 ou au passage 2. Les étapes de cryoconservation suivantes sont adaptées à tous les passages.

1. Après comptage des cellules, centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant
2. Remettre la pastille dans le milieu de congélation enrichi (tableau 1) pour obtenir 3 x 10^6-5 x 10⁶ cellules par mL et par cryovial.
3. Congelez lentement les cellules en réduisant la température à ~1 °C par min dans un récipient de cryocongélation approprié à -80 °C. Le lendemain, déplacer l’échantillon conservé dans un contenant de stockage d’azote pour un stockage à long terme (la présente étude est limitée à 17 mois de stockage).

6. Décongélation des cellules HNE amplifiées congelées

1. Réchauffez le bain-marie à 37 °C. Préparer le milieu d’amplification tel que décrit dans le tableau 1 et le réchauffer à 37 °C.
2. Retirez les cryoviaux du réservoir de stockage d’azote et placez-les rapidement dans le bain-marie, en prenant soin de ne pas immerger tout le flacon dans l’eau. Retirez les cryoviales du bain-marie lorsqu’il ne reste qu’une petite gouttelette congelée. Essuyez le flacon avec 70% d’alcool, essuyez-le et placez-le sous le capot.
3. À l’aide d’une pipette de 1 mL, transférer les cellules décongelées dans un tube vide de 15 mL.
4. En termes de gouttes, ajoutez 1 mL de milieu d’amplification chaud. Après 1 min, ajoutez encore 1 mL de milieu d’amplification et attendez une minute supplémentaire.
5. Ajouter 10 mL du milieu d’amplification et centrifuger pendant 2 min à 500 x g.
6. Aspirer et jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans un volume de milieu d’amplification nécessaire pour atteindre une densité cellulaire d’au moins 1 x 10⁶ cellules/mL.
7. Ensemencez les cellules sur une fiole enrobée de collagène contenant le milieu d’amplification.
   1. Si le cryovial contient plus de 4 x 10⁶ cellules, ensemencer sur une fiole^de 75 cm 2, dans 10 mL du milieu d’amplification
   2. Si cryovial contient moins de 4 x 10⁶ cellules, ensemencer les cellules sur une fiole^{de 25 cm 2} , dans 5 mL du milieu d’amplification
8. Incuber à 37 °C, 5 % de CO_2, et observer visuellement l’expansion cellulaire au cours des 2-3 prochains jours.
9. Ensuite, effectuez l’amplification cellulaire comme indiqué à la section 4.
   REMARQUE: Si peu de cellules ont été récoltées à l’étape 4.7. (c.-à-d. en cas de congélation au passage 0 avant l’expansion), étapes 6.5. et 6.6. peuvent être omises et les cellules peuvent être ensemencées directement sur une fiole de^{25 cm 2} recouverte de collagène sans centrifugation. Le milieu doit ensuite être changé le lendemain pour éliminer le diméthylsulfoxyde (DMSO).

7. Différenciation des cellules épithéliales nasales humaines à l’interface air-liquide

REMARQUE: Les HNE ont été différenciés à l’interface air-liquide comme décrit précédemment¹⁰.

1. Ensemencer les cellules à une densité de 330 000 cellules/filtre sur 0,33 cm² filtres poreux enrobés de collagène et compléter avec 300 μL du milieu d’amplification du côté apical et 900 μL du milieu air-liquide du côté basolatéral.
2. Après 3 jours, aspirer le milieu apical et cultiver les cellules à l’interface air-liquide pendant 3-4 semaines dans le milieu air-liquide pour établir un épithélium différencié. Changez le milieu basal toutes les 48-72 h.

8. Modulateurs CFTR

1. Préparer un milieu air-liquide contenant des modulateurs CFTR. Utilisez VX-445, VX-661 et VX-809 à une concentration finale de 3 μM et VX-770 à 100 nM. Utilisez le correcteur ABBV-2222 à une concentration finale de 1 μM et le potentiateur ABBV-974 à 10 μM. Utilisez du DMSO à 100 % pour dissoudre tous les modulateurs CFTR.
2. Préparer un milieu air-liquide contenant la même quantité de DMSO à 100 % que dans un milieu correcteur.
3. Ajouter le milieu contenant des médicaments ou du DMSO à la face basolatérale des cellules HNE polarisées cultivées à une interface air-liquide et incuber pendant 24 h dans 5 % de CO₂ à 37 °C.
4. Après 24 h, aspirer et jeter le milieu et le remplacer par un milieu frais préparé comme indiqué aux étapes 8.1-8.2., puis incuber pendant une période de 24 h dans 5% de CO₂ à 37 °C.

9. Études de la chambre d’Ussing

1. Mesurer les mesures de courant de court-circuit (Isc) dans des conditions de tension-pince comme décrit précédemment⁹.
   NOTE: La résistance électrique transépithéliale (TEER) des cultures a été mesurée à l’aide d’un voltmètre à baguette, et seules les cultures atteignant au moins 200 Ω·cm² ont été prises en compte pour les expériences suivantes. Les filtres des cellules HNE polarisées ont été montés dans des chambres d’Ussing et les mesures de courant de court-circuit (Isc) ont été mesurées dans des conditions de tension-pince.

10. Immunocytochimie

1. Effectuer l’immunodétection comme décrit précédemment⁹.
   REMARQUE: L’immunodétection CFTR a été effectuée à l’aide de l’anticorps monoclonal anti-CFTR C-terminal (24-1) pendant la nuit à une dilution de 1/100. La coloration de la zone-occludens-1 (ZO-1) (dilution 1/500), de l’alpha-tubuline (dilution 1/300), de la Muc 5AC (dilution 1/250) et de la cytokératine 8 (dilution 1/250) a été effectuée sur des filtres supplémentaires. Après lavage avec PBS-Triton-X100 0,1%, des anticorps secondaires de chèvre conjugués à Alexa 488 ou 594 ont été ajoutés pendant 30 min dans du sérum de chèvre à 10% (dilution 1/1000). Après un lavage final, les filtres ont été coupés du support et montés avec un support de montage Vectashield contenant du DAPI. Un microscope confocal (63x/1,4 contraste d’interférence différentielle d’huile λ bleu PL APO objectif) a été utilisé pour capturer des images, qui ont été analysées avec le logiciel ImageJ.

11. Analyse statistique

1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide d’un logiciel approprié.
   REMARQUE: L’analyse statistique a été effectuée à l’aide du logiciel S.A.S. Comme plusieurs filtres HNE ont été obtenus par patient et par condition, les paramètres quantitatifs ont été exprimés sous forme de valeurs médianes (± SEM) par patient. Les comparaisons (moyenne ± SD) ont été effectuées à l’aide du test de rang signé des paires appariées de Wilcoxon ou d’un test t non apparié.

Résultats

Les cellules HNE fraîches cultivées à l’interface air-liquide présentent les caractéristiques typiques de l’épithélium respiratoire polarisé et différencié, telles qu’évaluées par immunocoloration (figure 1). Les cellules HNE se redifférencient en une couche hétérogène de cellules épithéliales (immunocoloration positive de la kératine 8) qui imitent la situation in vivo d’un épithélium respiratoire pseudo-stratifié composé de cellules de gobelet cilié...

Discussion

L’utilisation de cellules épithéliales nasales dérivées du patient comme substituts des cellules épithéliales bronchiques humaines (HBE) pour mesurer l’activité CFTR dans le contexte de la médecine personnalisée a été proposée alors que l’HNE reproduit les propriétés des cellules en culture ^9,11. Le grand avantage des cultures cellulaires HNE par rapport aux cultures cellulaires HBE est qu’elles sont facilement et non invasivement échantill...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABBV-2222	Selleckchem	S8535
ABBV-974	Selleckchem	S8698
Advanced DMEM/F-12	Life Technologies	12634010
Alexa 488 goat secondary antibody	Invitrogen	A11001
Alexa 594 goat secondary antibody	Invitrogen	A11012
Amphotericin B	Life Technologies	15290026
Anti-alpha-tubulin antibody	Abcam	ab80779
Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)	R&D Systems	MAB25031
Anti-cytokeratin 8 antibody	Progen	61038
Anti-Muc5AC antibody	Santa Cruz Biotech	sc-20118
Anti-ZO-1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-10804
Ciprofloxacin		provided by Necker Hospital Pharmacy
Colimycin	Sanofi	provided by Necker Hospital Pharmacy
Collagen type IV	Sigma-Aldrich Merck	C-7521
cytology brush	Laboratory GYNEAS	02.104
DMSO	Sigma-Aldrich Merck	D2650
EGF	Life Technologies	PHG0311
Epinephrin	Sigma-Aldrich Merck	E4375
F12-Nutrient Mixture	Life Technologies	11765054
FBS	Life Technologies	10270106
Ferticult	Fertipro NV	FLUSH020
Flasks 25	Thermo Scientific	156.367
Flasks 75	Thermo Scientific	156.499
Glacial acetic acid	VWR	20104.298
HEPES	Sigma-Aldrich Merck	H3375
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich Merck	SLCJ0893
Insulin	Sigma-Aldrich Merck	I0516
Mg2+ and Ca2+-free DPBS	Life Technologies	14190094
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140130
Tazocillin	Mylan	provided by Necker Hospital Pharmacy
Transwell Filters	Sigma-Aldrich Merck	CLS3470-48EA
Triton-X100	Sigma-Aldrich Merck	T8787
Trypsin 0,25%	Life Technologies	25200056
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
VX-445	Selleckchem	S8851
VX-661	Selleckchem	S7059
VX-770	Selleckchem	S1144
VX-809	Selleckchem	S1565
Xylocaine naphazoline 5%	Aspen France	provided by Necker Hospital Pharmacy
Y-27632	Selleckchem	S1049