マウスの疼痛行動を測定するための機械的衝突回避アッセイ

要約

機械的競合回避アッセイは、マウスの疼痛感受性の非反射的読み出しとして使用され、様々なマウス疼痛モデルにおける情動動機付け応答をよりよく理解するために使用することができる。

要約

疼痛は、感覚的(侵害受容的)および情動的(不快な)次元の両方からなる。前臨床モデルでは、疼痛は伝統的に、疼痛の侵害受容性成分に関する推論を可能にするが、疼痛の感情的または動機的成分に関する情報をほとんど提供しない反射的試験を用いて評価されてきた。したがって、これらの痛みの要素を捉えるテストを開発することは、翻訳的に重要です。したがって、研究者は非反射的行動アッセイを使用して、そのレベルでの疼痛知覚を研究する必要があります。機械的衝突回避(MCA)は、3チャンバーパラダイムにおける有害な機械的刺激に対する動機付け応答を研究するための確立された自発的非反射的行動アッセイである。マウスの位置選好の変化は、競合する有害な刺激に直面したとき、足の触覚刺激に対する明るい光の知覚された不快感を推測するために使用される。このプロトコルは、疼痛研究者がさまざまなマウス疼痛モデルにおける情動動機付け応答を理解するために使用できるMCAアッセイの修正版を概説する。ここでは特に説明していませんが、MCAデータの例は、足底内完全フロイントアジュバント(CFA)、予備神経損傷(SNI)、および骨折/キャスティングモデルを疼痛モデルとして使用して、MCA手順を説明しています。

概要

痛みは、感覚的および感情的な要素を持つ複雑な経験です。疼痛知覚の閾値の低下および熱的および/または機械的刺激に対する過敏症は、この経験の重要な特徴であり、刺激誘発性疼痛行動試験が捕捉することができる(ハーグリーブスの熱感受性の試験および機械的感受性のフォン・フライ検定のような)^1,2。このようなテストは堅牢で再現可能な結果をもたらしますが、知覚された有害な刺激からの反射的な撤退への依存によって制限されています。これは、これらの検査のみに対する疼痛研究の継続的な依存に疑問を投げかけている。そのために、疼痛研究者は数年前からげっ歯類の疼痛モデルで使用するための代替/補完的な行動テストを模索し、痛みの感情的および/または動機付けの要素をより多く捉えようと努力してきました。これらの非誘発的、自発的、または非反射的手段(例えば、車輪走行、穴掘り活動、条件付けられた場所の選好^3、4、⁵)は^、前臨床疼痛研究の翻訳可能性を改善する試みにおいて実施されている。

機械的衝突回避(MCA)アッセイは、もともとHarte et al. in 2016⁶で記載され、主にラット^7,8で使用され、以前のアプローチ - 場所 - 回避パラダイム - の修正を表しています。このアプローチでは、後肢の有害な刺激が、そうでなければ望ましい(暗い)チャンバ内で行われ、そのような刺激を逃れる/回避するために動物の意図的な行動を駆動する^9,10。MCAアッセイは、観察者による後肢の手動の有害な刺激に頼る代わりに、マウスに潜在的に有害な刺激を交渉させ、嫌悪的な環境を脱出し、暗い部屋に到達する。アッセイにその名前を与える対立/回避は、これらの2つの競合する動機から生じます:明るく照らされた領域を脱出し、足の有害な刺激を避ける。MCAアッセイはまた、疼痛緩和と環境合図の組み合わせが、疼痛緩和/報酬的文脈に対する選好を反映する行動の変化を促進する条件付けられた場所嗜好試験の特徴を共有する¹¹。

根本的に言えば、これらすべてのアッセイは同様のアプローチを共有しています:ある嫌悪的な環境に対する動物の好みを別の環境よりもシフトさせることを、感情的/動機付けの状態の指標として使用します。MCAアッセイは、明るく照らされたチャンバと、それに続く高さ調節可能なプローブを備えた暗い中間チャンバと、嫌悪刺激のない暗い第3チャンバからなる3チャンバパラダイムです。怪我をしていないマウスは、明るい光¹²に対するげっ歯類の生来の嫌悪感を考えると、典型的には、暗くなった部屋に逃げるように動機付けられる。この例では、明るく照らされた環境から逃れようとする自然な動機は、暗くなった環境で排他的に発生する後足の刺激(調整可能な高さプローブ)に遭遇する不本意さを克服します。対照的に、痛みを経験しているマウス(例えば、炎症または神経障害による)は、進行中の触覚過敏症の設定において機械的プローブの不快な触覚経験を避ける動機があるため、明るく照らされた環境でより多くの時間を過ごすことを選択する可能性がある。

この記事では、MCA アッセイの修正版について説明します。我々は、マウスでの使用のために元の方法(ラット⁶で実施した)を適応させた。また、データ収集を効率化するため、プローブの高さを6から3(床の高さから0、2、5mm)に減らしました。このアプローチは、複数の疼痛モデルにわたってテストされ、既知の鎮痛薬で検証されており、疼痛過敏症および/または関連する感情的および動機付けの変化が行動におけるこれらの変化を促進していることを示している。このアプローチは、他の非反射的手段と比較して比較的迅速に実施でき、適応性があり、慣れと訓練に何日もかかることがあります^1,2。MCAは、他の疼痛の尺度と協調して、疼痛の感情的および動機付けの側面に関する貴重な洞察を生成することができる。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

マウスの使用およびそれに続く手順を含むすべての実験は、MDアンダーソンがんセンターおよびスタンフォード大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって、国立衛生研究所の実験動物のケアおよび使用のためのガイドに厳密に従って承認された。

1. MCAの建設

1. 側壁、床、天井に使用される不透明な白色の厚さ3mmのアクリルから、125mm x 125 mm x 125 mm(幅 x 奥行き x 高さ)のチャンバ1を構築します。正面向きの壁には厚さ3mmの透明なアクリルを使用してください。専用のアクリル接着剤を使用して、すべての側面を事前にしっかりと接着してください。
   警告: アクリル系粘着剤は危険物(可燃性、蒸気に有害、飲み込むと有害、皮膚や目を刺激する恐れがあります)と見なされます。このような接着剤は、製造業者の指示に従ってのみ使用してください(すなわち、換気の良い場所に適切なPPEとともに)。
2. チャンバ1の蓋をヒンジで取り付け、マウスをチャンバ内に容易に配置してチャンバから取り出せるようにする。自己粘着性の発光ダイオード(LED)テープを蓋の内面に取り付けて、〜4800ルクスの照明を提供します。
3. チャンバ1をMCAの残りの部分から閉じ、不透明なアクリルシートを所定の位置に出し入れすることによって閉じる。
4. MCA試験チャンバー2を、全面に半透明の濃い赤色アクリル(厚さ3mm)で製造された長さ270mmの無点灯チャンバーとして構築し、上部にヒンジ付き蓋を付けます。チャンバー 2 の床に 13 x 31 グリッドの 2 mm の穴を配置し、直径 0.5 mm の先端 (例えば、鈍いマップピン) を持つ一連の鈍いプローブを突出させます。
   メモ: 120 グリットのサンドペーパーブロックなどを使用した鈍いピン。胞子虫駆除剤で消毒する前に、洗剤で温水できれいにしてください。
5. プローブベースプレートの下にアクリルシートを追加して、プローブの高さを調整します(図1)。このアプローチを使用して、プローブの高さが 0 mm、2 mm、および 5 mm の 3 つの設定でデバイスを構成します。
6. 鈍いマップピンまたは同様の材料の代わりに、3Dプリンタファイルを使用してチャンバ2の床とプローブプレートを印刷します( 補足ファイル1:機械プローブを参照するSpikeBed-MCA.stl、およびチャンバ2の床を形成する 補足ファイル2:MCA_baseplate.stlを参照)。
   メモ:3D印刷が利用できない場合は、デバイスの壁を構築するのに使用したのと同じアクリル接着剤を使用して、マップピンをアクリルシートに接着します。
7. ナイロン12プラスチックなど、洗濯可能で生体適合性のある材料で印刷します(推奨)。
8. チャンバー3を次の寸法で構築します:125 mm x 125 mm x 125 mmを、照明のない半透明の濃い赤色のアクリルボックス(すべての側面)として、チャンバー1の反対側に配置します。チャンバ1および2と同様に、チャンバ上にヒンジ付き蓋を置く。このチャンバは、チャンバ2内の機械的プローブからの暗くなった脱出領域として機能する。

2. マウスMCAの馴化とテスト

1. 動物における行動結果を含むすべての実験と同様に、潜在的なバイアスを最小限に抑えるために、適切な無作為化と盲検化を全体を通して観察する。
   注:代表的な結果は、8〜12週齢の雄および雌のC57BL/6Jマウス(ジャクソン研究所株数000664)を用いて生成した。マウスは、ケージあたり最大5匹まで社会的に飼育され、食物と水は 自由摂取 で、07:00時間から19:00時間の光サイクルで飼育された。MCAは光期に09:00 hから12:00 hの間に起こった。
2. ベースラインテストがスケジュールされる1日前に、マウスをMCAユニットに5分(最小)から15分(最大)ケージメイトと一緒に順応させ、デバイス全体の社会的探査を容易にします。
3. プロセス全体を通して、チャンバ1内のLEDがオフになっていること、チャンバ1とチャンバ2の間のバリアが開いたままになっていること、およびプローブがゼロの高さに設定されている(すなわち、チャンバ2の床から突出していない)ことを確認します。
4. 試験に陰性対照動物(すなわち、偽手術、または車両注射対照)が組み込まれている場合は、マウスのベースライン試験(オプション)を実行する。必要に応じて、ベースライン検定を使用して、チャンバ2に決して交差しない怪我をしていない外れ値を排除しますが、これは必要であるとは証明されていません。使用する場合は、除外のすべての基準と除外されたマウスの数を報告します。
   1. テストを開始する前に、MCA デバイス全体を横向きに表示できる 1080p 映像を三脚に録画できるビデオ カメラをセットアップします。MCA が記録した画像に収まるように視野を調整します。
   2. 録画が開始されたら、カメラの視野にハンドヘルドドライイレースボードを持ち、動物のテスト実行に関する識別情報(マウスID、プローブの高さ、日付、時点など)でビデオの開始にラベルを付けます。
   3. 最初の実行では、プローブの高さをゼロに設定します。試験対象のマウスを自宅のケージからバリアドアを所定の位置に取り付けた状態でチャンバー1に移します。録画したフッテージに表示されるタイマーを開始します。
      メモ: タイマーは、テストのさまざまな部分間の間隔が実行間で一貫していることを保証します。
   4. 10秒後、チャンバー1のLEDをオンにする。マウスが点灯したチャンバーに 20 秒間入った後、チャンバー 1 と 2 の間のバリアを取り外します。
   5. 動物を2分間観察する。テストの進行中にストップウォッチで待ち時間や滞留時間を測定します。または、テストが完了したら、ビデオ映像を分析することもできます。
      注:スループットと嫌悪刺激への長時間の暴露を避けるという理由から、カットオフは2分に設定されました。
   6. 特定されたいくつかの有用な結果のうちの1つ以上を測定します(下記参照)。図1)。特定の実験設定で行動のどの側面が異なるかを確認するために、テストを開始するときに5つの結果測定をすべて分析することをお勧めします。
      1. オプション I: チャンバー 2 への最初のエントリまでの待機時間を記録します。オプションII:チャンバー2を横断する半分以上を横切るレイテンシを記録します。オプションIII:チャンバー2の合計滞留時間を記録します。オプション IV: チャンバー 3 に到達するまでの待機時間を記録します (エスケープ)。オプションV:オプションIIと同様に、各チャンバーの合計滞留時間を2分以内に記録し、比率に変換します。
         注:すべての実験はユニークであり、疾患モデルに固有の生物学的要因や行動変化の影響を受ける可能性があるため、研究者はこれらの尺度やその他の尺度を自分の手で実験することができます。
   7. テストが完了したら、マウスをホームケージに戻し、MCAチャンバーを70%エタノールで洗浄し、完全に乾燥させます。
      注:糞便ボリは、通常、エタノール/消毒剤の前にペーパータオルでチャンバーから比較的簡単に洗浄することができます。より徹底的な洗浄が必要になった場合は、チャンバー2と3を分解して、温かい石鹸水に浸すことができます。
   8. プローブの高さをゼロに設定したコホート内のすべてのマウスを実行した後、機械式プローブベースプレートの下にアクリルの3mmシートを挿入し、プローブの高さを2mmにしてステップ2.4.2~2.4.7を繰り返します。
   9. プローブの高さを2mmに設定してすべてのマウスを実行した後、プローブベースプレートの下に2枚目の3mmのアクリルシートを挿入し、プローブの高さ5mmで手順2.4.2~2.4.7を繰り返します。
      注:このアプローチを使用して、8匹のマウスのグループを約2時間で試験することができます。より正確な薬物後のタイミングが必要な場合(例えば、薬物時間経過実験の場合)には、より小さなグループサイズを使用する。
   10. テストセッションの最後に消毒剤で最終洗浄を行います。
5. 疼痛過敏症を誘発した後および/または薬物治療で検査を繰り返す。
6. ベースライン時の各マウスのパフォーマンスを、痛みが誘発された後のパフォーマンスと比較します。ビヒクル処理動物と薬物処理動物を同時に比較することにより、薬理学的介入の影響を評価する。
7. 動物が所望の結果測定値を満たさずに2分間のカットオフに達した場合、ノンパラメトリック統計分析(例えば、Mann Whitney U検定)を実行し、その結果、非連続データが得られる。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

MCAアッセイは、いくつかの機械的に異なるマウス疼痛モデルで首尾よく使用されている。図2は、選択した結果尺度がチャンバ 2 の中間点を横切っていたデータを示しています(図2A)。チャンバー3への脱出に対する中間点を用いて得られたデータは、プローブ高さ5mmの神経因性疼痛の免れた神経損傷(SNI)モデルにおいて、チャンバー3脱出のための〜4...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

すべての行動テストと同様に、動物の治療に対する適切な取り扱い、無作為化、および盲検化は、全体を通して不可欠です。複雑な行動や意思決定への多因子インプットを考えると、苦痛を最小限に抑えながら、動物をできるだけ一貫して扱い、慣れさせ、テストすることが不可欠です。また、チャンバー1にマウスを配置し、LEDライトをオンにし、バリアを取り除くタイミングを再現するに...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs	Lepro	SKU: 410087-DWW-US	For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html
3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor'	Shapeways	N/A	Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins.
70% ethanol	Various	N/A	To clean MCA between mice.
Acryl-Hinge 2	TAP Plastics	N/A	for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122
Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear	TAP Plastics	N/A	3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510
Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red - 50%	TAP Plastics	N/A	3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519
Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White - 0.1%	TAP Plastics	N/A	3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341
Disinfectant (e.g. Quatricide)	Pharmacal Research Laboratories, Inc.	65020F	To disinfect MCA at the end of a testing session.
Dry-erase markers and board	Various	N/A	To add experimental info to the beginning of video footage.
Map pins	Various	N/A	Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts.
Paper towels	Various	N/A	To clean/disinfect MCA.
SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement	TAP Plastics	N/A	For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131
Stopwatch	Various	N/A	To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video.
Timer	Various	N/A	To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently.
Video camera	Various	HDRCX405 Handycam Camcorder	To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution.
Tripod	Famall	N/A	Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable.