生きているゼブラフィッシュ幼虫の眼球除去による神経支配依存性の成長と視覚系の発達を調べる

要約

この記事では、網膜入力が視蓋の成長と発達にどのように影響するかを調査するための第一歩として、生きているゼブラフィッシュの幼虫から外科的に目を取り除く方法について説明します。さらに、この記事では、幼虫の麻酔、固定、および脳解剖に関する情報を提供し、続いて免疫組織化学および共焦点イメージングを行う。

要約

ゼブラフィッシュは生涯にわたる顕著な成長と再生能力を示します。例えば、胚発生中に確立された特殊な幹細胞ニッチは、眼および脳の両方において、視覚系全体の継続的な成長をサポートする。網膜と視蓋の間の協調的な成長は、新しいニューロンが目と脳に追加されるにつれて、正確な網膜トピックマッピングを保証します。網膜軸索が、生存、増殖、および/または分化などの眼底幹および前駆細胞の挙動を調節するための重要な情報を提供するかどうかに対処するには、同じ動物内および動物間で神経支配および脱神経化されたテクタルローブを比較できることが必要である。

生きている幼虫ゼブラフィッシュから片目を外科的に除去し、続いて視蓋骨を観察することで、この目標を達成します。付属のビデオは、幼虫を麻酔し、タングステン針を電気的に鋭くし、それらを使用して片目を除去する方法を示しています。次に、固定されたゼブラフィッシュ幼虫から脳を解剖する方法を示します。最後に、このビデオでは、免疫組織化学のプロトコルの概要と、顕微鏡検査のために染色された胚を低融点アガロースにマウントする方法のデモンストレーションを提供します。

概要

この方法の目的は、網膜入力がゼブラフィッシュ脳の視覚処理センターである視蓋骨の成長と発達にどのように影響するかを調べることです。片目を取り除いた後、視蓋の両側を比較することで、同一試料内のテクタル変化を観察・正規化することができ、複数の検体間での比較が可能となります。この技術と組み合わせた現代の分子アプローチは、視覚系の成長と発達、ならびに軸索の変性と再生の根底にあるメカニズムへの洞察をもたらすでしょう。

視覚、聴覚、体性感覚などの感覚系は、外部器官から情報を収集し、その情報を中枢神経系に中継し、中脳全体の外界の「マップ」を生成します^1,2。視覚は、多くの魚を含むほぼすべての脊椎動物にとって支配的な感覚様式です。眼の神経組織である網膜は、網膜の投影ニューロンである視受容体、双極性細胞、網膜神経節細胞(RGC)を主体とする神経回路で情報を収集します。RGCは長い軸索を持ち、網膜の内面を横切って視神経頭に向かい、そこで脳を魅了して一緒に移動し、最終的に背側中脳の視覚処理センターで終わる。この構造は、魚類や他の哺乳類以外の脊椎動物では視蓋骨と呼ばれ、哺乳類の優れた丘陵地帯と相同である³。

視蓋骨は、背側中脳における両側対称の多層構造である。ゼブラフィッシュおよび他....

プロトコル

この論文の方法は、リードカレッジとユニバーシティカレッジロンドンの施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインと承認に従って実施されました。この研究で使用されたゼブラフィッシュ株の詳細については、 材料表 を参照してください。

1. 材料と工具を準備する

1. 解決策を作る。
   1. 60倍ストック(300 mM NaCl、10.2 mM KCl、20 mM CaCl 2-二水和物、および20 mM MgCl₂-六水和物)をイオン交換水で希釈して胚培地(E3¹⁴)を作り、オートクレーブ処理し、室温で保存した。10 L の脱イオン水に 60 x E3 160 mL を加えます。室温で保存してください。
   2. E3に1%の低融点(LMP)アガロースを作ります。1gのLMPアガロースを100mLのE3に溶解させ、マイクロ波で高出力で1〜2分間煮沸する。アリコート溶融アガロースを1.7mLマイクロフュージチューブに入れ、4°Cで保存した。 水浴中で沸騰させ、埋め込みに使用する準備ができたら40°Cのヒートブロックに保持する。
   3. ¹⁰倍ストック(1 M NaCl、20 mM KCl、10 mM MgSO₄....

結果

眼球除去が完了したかどうかを確認し、視蓋がどのように変化するかを評価するために、すべてのRGCを膜標的RFPでラベル付けし、したがって網膜から突出して視神経を形成するすべての軸索²⁴を有するTg[atoh7:RFP]株で手術を行った。この菌株を使用することは絶対に必要ではありませんが、視蓋神経ニューロピルにおける視神経末端の簡単な観察と可視化を可能にしま?.......

ディスカッション

この論文で説明する技術は、ゼブラフィッシュにおける脊椎動物の視覚系発達を研究するための多くのアプローチの1つを示しています。他の研究者は、胚性網膜を解剖し、遺伝子発現解析¹⁹ を実行する方法、または視蓋^骨30におけるニューロン活性を視覚化する方法を発表した。この論文は、差動網膜入力が視蓋内の細胞挙動にどのように影響するかを探?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and supplies:
Breeding boxes	Aquaneering	ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease	Sigma or equivalent supplier	Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL)			For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation
Fine forceps - Dumont #5	Fine Science Tools (FST)	11252-20
Glass Pasteur pipettes	DWK Lifescience	63A53 & 63A53WT	For pipetting embryos and larvae
Glass slides for microscopy	VWR or equivalent supplier	48311-703	Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders			For making and storing solutions
2-part epoxy resin	ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent	0.85 oz syringe	https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	VWR or equivalent supplier	22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length)	Fine Science Tools (FST)	26018-17	To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent	Ali Express or equivalent		For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip			For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	50-190-0267
Petri dishes 35 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	08-757-100A
Pipette pump	SP Bel-Art or equivalent	F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma	909122	For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage)			For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit	Dow Corning	3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter)	World Precision Instruments (WPI)	TGW0515	Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block	The Lab Depot or equivalent supplier	BSH1001 or BSH1002	Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)			For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads			For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope			Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope			High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (Elements) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES	Sigma	H7006	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	1374248	For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate	Sigma	M7506	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210	Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333-20ML	Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	Diagnostic BioSystems	DMR E404-01	Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride	Sigma	P3911	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride	Sigma	S9888	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide	Sigma	S5881	Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose	Sigma	S9378
Tricaine-S	Pentair	100G #TRS1	Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG	Invitrogen	A-11011	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3	Invitrogen	1306 or T3605	Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH)	Sigma	34860	Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum	ThermoFisher Scientific	50-062Z	A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3	Millipore	06-570	Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)	MBL International	PM005	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK)	Sigma	P2308-10MG	Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100	Sigma	T8787	Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji)			freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
Rstudio			freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP			Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains			available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.