Удаление глаз у живых личинок рыбок данио для изучения иннерваторно-зависимого роста и развития зрительной системы

Резюме

В статье объясняется, как хирургически удалить глаза у живых личинок рыбок данио в качестве первого шага к исследованию того, как вход сетчатки влияет на рост и развитие зрительного тектума. Кроме того, в статье представлена информация об обезболивании личинок, фиксации и рассечении мозга с последующей иммуногистохимией и конфокальной визуализацией.

Аннотация

Рыбки данио демонстрируют замечательный пожизненный рост и регенеративные способности. Например, специализированные ниши стволовых клеток, созданные во время эмбриогенеза, поддерживают непрерывный рост всей зрительной системы, как в глазу, так и в мозге. Скоординированный рост между сетчаткой и оптическим тектумом обеспечивает точное ретинотопическое картирование по мере добавления новых нейронов в глаза и мозг. Чтобы решить, предоставляют ли аксоны сетчатки важную информацию для регулирования поведения тектальных стволовых и клеток-предшественников, таких как выживание, пролиферация и / или дифференцировка, необходимо иметь возможность сравнивать иннервированные и денервированные тектальные доли внутри одного и того же животного и у разных животных.

Хирургическое удаление одного глаза у живой личинки рыбки данио с последующим наблюдением за оптическим тектумом достигает этой цели. В сопроводительном видео показано, как обезболить личинок, электролитически заточить вольфрамовые иглы, и использовать их для удаления одного глаза. Далее показано, как препарировать мозг у неподвижных личинок рыбок данио. Наконец, видео содержит обзор протокола иммуногистохимии и демонстрацию того, как монтировать окрашенные эмбрионы в агарозу с низкой температурой плавления для микроскопии.

Введение

Целью этого метода является исследование того, как вход сетчатки влияет на рост и развитие оптического тектума, центра визуальной обработки в мозге рыбок данио. Удалив один глаз, а затем сравнив две стороны оптического тектума, можно наблюдать и нормализовать тектальные изменения в одном образце, что позволяет сравнивать несколько образцов. Современные молекулярные подходы в сочетании с этой техникой дадут представление о механизмах, лежащих в основе роста и развития зрительной системы, а также аксональной дегенерации и регенерации.

Сенсорные системы - зрительная, слуховая и соматосенсорная - собирают информацию от внешних органов и передают эту информацию в центральную нервную систему, генерируя «карты» внешнего мира по среднему мозгу ^1,2. Зрение является доминирующей сенсорной модальностью почти для всех позвоночных, включая многих рыб. Сетчатка, нервная ткань в глазу, собирает информацию с помощью нейронной цепи, состоящей в основном из фоторецепторов, биполярных клеток и ганглиозных клеток сетчатки (RGC), проекционных нейронов сетчатки. RGC имеют длинные аксоны, которые находят свой путь через внутреннюю поверхность сетчатки к головке зрительного нерва, где они фасцикулируют и путешествуют вместе через мозг, в конечном итоге заканчиваясь в центре визуальной обработки в спинном среднем мозге. Эта структура называется оптическим тектумом у рыб и других позвоночных, не являющихся млекопитающими, и гомологична верхнему колликулусу у млекопитающих³.

Оптический тектум представляет собой двусторонне симметричную многослойную структуру в спинном среднем мозге. У рыбок данио и большинства других рыб каждая доля зрительного тектума получает визуальный ввод исключительно от контралатерального глаза, так что левый зрительный нерв заканчивается в правой тектальной доле, а правый зрительный нерв заканчивается в левой тектальной доле⁴ (рисунок 1). Как и его аналог млекопитающих, превосходный колликулус, оптический тектум интегрирует визуальную информацию с другими сенсорными входами, включая прослушивание и соматозондирование, контролируя сдвиги в зрительном внимании и движениях глаз, таких как саккады ^1,5,6. Однако, в отличие от верхнего колликулуса млекопитающих, оптический тектум непрерывно генерирует новые нейроны и глию из специализированной ниши стволовых клеток вблизи медиального и каудального краев тектальных долей, называемой зоной текальной пролиферации⁷. Поддержание пролиферативных предшественников в тектуме зрительного нерва и других областях центральной нервной системы частично способствует замечательной регенеративной способности, задокументированной у рыбок данио⁸.

Предыдущая работа, изучающая мозг слепых или одноглазых рыб, показала, что размер зрительного тектума прямо пропорционален количеству иннервации сетчатки, которую он получает ^9,10,11. У взрослых пещерных рыб, глаза которых вырождаются в раннем эмбриогенезе, оптический тектум заметно меньше, чем у близкородственных, видимых поверхностных рыб⁹. Дегенерация глаза пещерной рыбы может быть заблокирована путем замены эндогенной линзы линзой от поверхностной рыбы во время эмбриогенеза. Когда эти одноглазые пещерные рыбы выращиваются до зрелого возраста, иннервированная тектальная доля содержит примерно на 10% больше клеток, чем неиннервированная тектальная доля⁹. Аналогичным образом, у личинок киллифиш, которые инкубировались с помощью химической обработки для создания глаз разных размеров в пределах одного и того же человека, сторона тектума с большей иннервацией была больше и содержала больше нейронов¹⁰. Данные экспериментов по раздавливанию зрительного нерва у взрослых золотых рыбок указывают на то, что иннервация способствует пролиферации, при этом пролиферация тектальных клеток уменьшается, когда иннервация была нарушена¹¹.

Подтверждая и расширяя эти классические исследования, несколько недавних докладов предоставляют данные, свидетельствующие о том, что пролиферация в ответ на иннервацию модулируется, по крайней мере частично, путем BDNF-TrkB^12,13. Остается много открытых вопросов о росте и развитии оптического тектума, в том числе о том, как развивающаяся сенсорная система справляется с травмой и дегенерацией аксонов, какие клеточные и молекулярные сигналы позволяют входу сетчатки регулировать рост зрительного тектума, когда эти механизмы становятся активными, и позволяют ли иннервационная пролиферация и дифференцировка сетчатке и ее целевой ткани координировать темпы роста и обеспечивать точное ретинотопическое картирование. Кроме того, существуют гораздо более широкие вопросы о развитии, зависящем от активности, которые можно решить, опросив зрительную систему рыбок данио с помощью хирургических подходов, таких как описанный ниже.

Чтобы исследовать клеточные и молекулярные механизмы, с помощью которых нейронная активность, в частности от визуального ввода, изменяет выживание и пролиферацию клеток, описанный подход непосредственно сравнивает иннервированные и денервированные тектальные доли (рисунок 1) в отдельных личинках рыбок данио. Этот метод позволяет документировать дегенерацию аксона RGC в тектуме зрительного нерва и подтвердить, что количество митотических клеток коррелирует с иннервацией.

Рисунок 1: Эскизы личинок рыбок данио до и после одностороннего удаления глаз. (А) Рисование 5 личинок dpf при просмотре под рассекающим микроскопом. Каждая личинка встроена в агарозу с низкой температурой плавления и ориентирована сбоку, прежде чем вольфрамовая игла с острым крючковатым кончиком используется для вычерпывания глаза лицом вверх (левый глаз в этом примере). (B) Рисунок дорсального вида личинки 9 dpf в результате операции, изображенной в A. Только три сильно схематизированных аксона RGC от правого глаза дефасцикулируют и соединяются с нейронами в левой тектальной доле. Сокращения: dpf = дни после оплодотворения; dps = дни после операции; RGC = ганглиозные клетки сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

протокол

Методы в этой статье были проведены в соответствии с руководящими принципами и одобрением институциональных комитетов по уходу за животными и их использованию Рид-колледжа и Университетского колледжа Лондона. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации о штаммах рыбок данио, используемых в этом исследовании.

1. Подготовка материалов и инструментов

1. Принимайте решения.
   1. Получают эмбриональную среду (E3¹⁴) путем разбавления 60-кратного запаса (300 мМ NaCl, 10,2 мМ KCl, 20 мМ CaCl 2-дигидрата и 20 мМ MgCl_{2-гексагидрата} в деионизированной воде, автоклавной и хранящейся при комнатной температуре). Добавьте 160 мл 60x E3 к 10 л деионизированной воды. Хранить при комнатной температуре.
   2. Получите 1% агарозу с низкой температурой плавления (LMP) в E3. Растворить 1 г агарозы LMP в 100 мл E3 кипятить в микроволновой печи в течение 1-2 мин на высокой мощности. Аликвот расплавленную агарозу в 1,7 мл микрофьюжных пробирок и хранит при 4 °C. Кипятить на водяной бане и держать в тепловом блоке при температуре 40 °C, когда он будет готов к использованию для встраивания.
   3. Изготавливают изотонический раствор модифицированных звонарей Марка (MMR¹⁵) путем разбавления 10-кратного запаса (1 M NaCl, 20 мМ KCl, 10 мМ MgSO₄, 20 мМ CaCl 2-дигидрата, 50 мМ HEPES, рН, скорректированного до 7,5 с 10 М NaOH, затем автоклавированного и хранящегося при комнатной температуре). Добавьте 10 мл 10x MMR к 90 мл деионизированной воды.
2. Заливайте тарелки Sylgard согласно инструкции производителя, позволяя им устанавливаться и сушиться в течение нескольких дней¹⁶.
3. Электролитически заточите вольфрамовые иглы (протокол, модифицированный из ¹⁷).
   1. Во-первых, приготовьте 10% (мас./об.) раствор KOH, добавив 200 мл деионизированной воды в стеклянную банку с широким горлом с завинчивающейся крышкой. Медленно размешать в 20 г гранул KOH.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот едкий раствор является высокоэкзотермическим. Наденьте перчатки и средства защиты глаз и перемешайте раствор в капюшоне.
   2. Отрежьте вольфрамовую проволоку длиной 2-3 см и вставьте ее в держатель иглы.
   3. Подключите катодные и анодные провода к источнику питания. Прикрепите зажим для аллигатора на конце катодной проволоки к частично выпрямленной скрепке и вставьте скрепку в раствор KOH, прикрепив ее к боковой части банки.
   4. Далее прикрепите зажим аллигатора анодной проволоки к шейке игольчатого держателя. Включите питание (до ~20 В) и окуните вольфрамовый провод в раствор KOH, вытащив провод из раствора под углом, чтобы электролитически заточить провод в тонкий наконечник.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки будут исходить из скрепки по мере развития реакции.
   5. Проверьте кончик иглы под рассекающим микроскопом, чтобы убедиться, что он достаточно острый.
   6. Промойте иглу деионизированной водой, чтобы удалить все остатки KOH. Сделайте несколько игл заранее и держите их до личиночных операций и рассечений.
4. Сделайте камерные слайды для визуализации образцов рыбок данио с помощью вертикального конфокального микроскопа.
   1. Получите стекла микроскопа и двухкомпонентную эпоксидную смолу (см. Таблицу материалов). Смешайте эпоксидную смолу в соответствии с инструкциями на упаковке и нанесите толстые кольца или прямоугольники на стеклянные слайды. Дайте горкам затвердеть и высохнуть в вытяжке в течение не менее 24 часов перед использованием.

2. Сбор и выращивание эмбрионов

1. Парите взрослых самцов и самок рыб желаемых генотипов в гнездовых ящиках в конце дня / ранним вечером. На следующее утро, после того, как они нерестятся, соберите вновь оплодотворенные яйца с помощью сетчатого ситечка и перенесите их в Е3 в 100 мм чашках Петри.
2. Инкубируйте эмбрионы при ~27,5 °C с 14-часовым световым /10-часовым темным циклом до дня операции. Меняйте E3 ежедневно или по мере необходимости.
3. Кормите личинок с помощью капельницы, полной собранных коловраток один раз в день, начиная либо через 5 дней после оплодотворения (dpf), либо через день после операции. После того, как у личинок будет несколько часов, чтобы поесть, измените E3, чтобы удалить оставшихся коловраток и продукты жизнедеятельности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не кормите личинок в день операции.

3. Подготовьте личинок к операции

1. В день операции используйте стеклянную пипетку Пастера с широким отверстием, чтобы перенести 10-15 личинок в 35-миллиметровую чашку Петри, наполненную свежей E3.
2. Обезболивают личинки путем добавления 3-5 капель 0,4% мас./об. раствора трикаина (0,4 г трикаина, растворенного в 210 мМ Трис, рН 9; конечный раствор, скорректированный до рН 7,4 при необходимости¹⁸) в чашку для конечной концентрации ~0,0015% мас./об.трикаина. Ищите отсутствие реакции на прикосновение, чтобы определить, адекватно личинки обезболены. Если они все еще реагируют на прикосновение через ~3 мин, добавьте еще 2-3 капли 0,4% мас./об.раствор трикаина и повторно проведите повторную оценку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этой стадии развития можно контролировать кровоток и частоту сердечных сокращений в дополнение к моторике под рассекающим микроскопом.
3. Обездвиживают обезболенных личинок рыбок данио, встраивая их в 1% агарозу LMP, растворенную в E3.
   1. Во-первых, поместите крышку 35-миллиметровой чашки Петри лицевой стороной вверх под рассекающим микроскопом. Затем возьмите одну личинку в узкоствольную стеклянную пипетку Пастера с небольшим количеством E3.
   2. Затем аспирировать ~200 мкл расплавленной, теплой (~40 °C) 1% агарозы LMP в пипетку с личинкой. Наконец, брызните личинку и агарозу на перевернутую крышку чашки Петри.
   3. Используйте тусклую вольфрамовую иглу, чтобы быстро, но осторожно маневрировать личинкой так, чтобы она была боковой, с одним глазом, обращенным вверх. Дождитесь схватывания агарозы (~5 мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если агароза затвердевает, в то время как личинка не является боковой, освободите ее от агарозы (как описано в шаге 5) и верните ее в чашку с E3 и трицином.

4. Удаление глаз

1. Как только агароза застынет, и личинка будет расположена сбоку, используйте кончик очень тонкой, электролитически заточенной вольфрамовой иглы, чтобы проткнуть кожу вокруг глаза, следуя краю глазной орбиты.
2. Далее сдвиньте край иглы (не кончик) под глаз с височно-вентральной стороны глаза. Используйте контролируемое давление, чтобы освободить глаз от глазницы.
3. Используйте очень тонкие хирургические щипцы, чтобы удалить глаз, защемляя зрительный нерв и подталкивая глаз от медиального к боковому. В качестве альтернативы, просто продолжайте давить на глаз дорсально и спереди боковой стороной иглы, в конечном итоге разрезая зрительный нерв и освобождая глаз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткани, отличные от глаза, случайно заколоты во время операции, быстро и гуманно убейте личинку путем быстрого обезглавливания.

5. Послеоперационный уход до экспериментальной конечной точки

1. После успешного удаления глаз накройте агарозу раствором MMR.
2. Освободите каждую личинку от агарозы, осторожно расчесывая вольфрамовую иглу вокруг их головы, а затем вокруг их тела, стабилизируя крышку чашки Петри щипцами.
3. Переложите одноглазых личинок в 35-миллиметровую чашку Петри, которая содержит MMR, дополненную разбавлением 1:100 коктейля пенициллин/стрептомицин. Инкубируйте эмбрионы при ~27,5 °C с темным циклом 14 ч света/10 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот изотонический раствор MMR, дополненный антибиотиками, первоначально способствует заживлению и выживанию личинок. Каждое блюдо может вместить до 15 выздоравливающих личинок.
4. На следующий день верните личинок в Е3. Начиная с второй половины дня после операции, кормите личинок (~ 6 dpf и старше) с помощью капельницы, полной собранных коловраток один раз в день. После того, как у личинок будет несколько часов, чтобы поесть, измените E3, чтобы удалить оставшихся коловраток и отходы.

6. Фиксация личинок

1. Как только личинки достигнут желаемой стадии развития для анализа, обезболивайте их смертельной дозой трикаина (~ 0,4% конечной концентрации), пока их сердца не остановятся.
2. Пипетка до 30 личинок на 1,5 мл микрофьюжной трубки. Удалите избыток E3, а затем добавьте 0,5-1 мл фиксирующего раствора (4% параформальдегида (PFA) и 4% сахарозы в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS)) для фиксации ткани. Насиживают личинок в течение ночи при 4 °C.
3. Промыть личинок PBS на следующий день, удалив фиксатор и промывая личинок 3-4 раза PBS. Хранить личинки при температуре 4 °C до 7 дней до рассечения.

7. Рассечение личинок для выявления мозга (адаптировано из ¹⁵)

1. Подвешивайте неподвижные личинки в каплях PBS на пластине Сильварда под рассекающим микроскопом. Закрепите их сбоку, поместив два вольфрамовых штифта (обычно старые вольфрамовые иглы, которые составляют менее 2 см) через нотохорд, причем один штифт находится позади пигментированной области, охватывающей область аорты-гонад-мезонефрос (AGM), и другой в соответствии с концом расширения желтка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Расположите вольфрамовые штифты в как можно меньшем количестве попыток, потому что ткань будет становиться более рыхлой с каждым проколом.
2. Используйте очень острую вольфрамовую иглу и острые щипцы, чтобы обнажить мозг, удалив в этом порядке глаз (ы), ухо, челюсть, пищеварительный тракт и спинную черепную кожу.
   1. Во-первых, удалите глаз, используя технику, аналогичную хирургическому удалению глаза на шаге 4. Затем открепите личинку и переверните ее в противоположную сторону, чтобы другой глаз был доступен и повторился. В качестве альтернативы, проткните иглу через челюсть на другую сторону и удалите глаз, не отстегивая.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глаза могут быть собраны в этот момент, если требуется анализ этой ткани (аналогично ¹⁹).
   2. Затем используйте вольфрамовую иглу, чтобы поцарапать от височной до вентральной стороны уха. В том же действии / движении поднесите иглу сзади к челюсти и осторожно потяните кпереди, пока ухо и челюсть не будут удалены.
   3. Используйте щипцы, чтобы вытащить вентральные органы и любой оставшийся желток.
   4. Наконец, сделайте неглубокий разрез в дорсальной черепной коже вблизи соединения между задним мозгом и спинным мозгом. Подтяните кожу щипцами и потяните ее спереди и вокруг теленцефалона. Если это окажется слишком трудным, начните с начального разреза в заднем мозге и потяните кожу сначала латерально, а затем вентрально и спереди, стараясь не поцарапать боковые края тектума.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку средний мозг является объектом исследования, задний мозг может быть разрезан; однако глубокий разрез может привести к обезглавливанию.
   5. Удалите оставшуюся ткань щипцами. Открепите личинку и перенесите на PBS в микрофрагменной трубке объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте хвост прикрепленным к мозгу для лучшей видимости при выполнении протоколов wholemount.

8. Обезвоживание и хранение мозга

1. Удалите PBS из мозга и добавьте 1 мл PBS, содержащего 0,1% TritonX-100 (PBST). Инкубировать в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
2. Удалите PBST и замените его раствором метанола: PBST 50:50. Инкубировать в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
3. Промывайте мозги 100% метанолом (MeOH) дважды по 5 мин при комнатной температуре.
4. Храните мозг в 100% MeOH при -20 °C в течение не менее 16 ч перед выполнением иммуногистохимии или других процедур полного объема.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мозг может храниться в MeOH до 2 лет при -20 °C.

9. Иммуногистохимия

ПРИМЕЧАНИЕ: Установленные протоколы для многих полезных методов wholemount у рыбок данио можно найти на ZFIN²⁰. В этой рукописи приведены примеры сравнения одноглазых и двухглазых личинок, которые были ослаблены антителами, которые распознают либо красный флуоресцентный белок (RFP), который экспрессируется в аксонах зрительного нерва в линии Tg[atoh7:RFP] (рисунок 2), либо фосфорилированный гистон H3 (PH3), который выделяет митотические клетки (рисунок 3). Стандартный протокол иммуногистохимии для цельных эмбрионов и личинок кратко изложен ниже.

1. Сначала регидратируйте личиночный мозг градуированной серией промывок MeOH:PBST при комнатной температуре путем инкубации образцов в 50:50 MeOH:PBST в течение 5 мин, затем в 30:70 MeOH:PBST в течение 5 мин и заканчивая 3 промывками PBST.
2. Чтобы проникнуть в мозг, инкубируют его в ПБСТ, дополненном протеиназой К (ФК) в конечной концентрации 20 мкг/мл ПК в течение 30 мин при 37 °C. Храните аликвоты 10 мг/мл ПК при -20 °C и размораживайте их перед использованием.
3. Удалите раствор ФК и смойте оставшийся фермент, промыв мозг ПБСТ 3 раза в течение 15 минут.
4. Рефиксируйте пермеабилизированный мозг, инкубируя их в 4% PFA в течение 20 мин при 25 °C (или комнатной температуре). Затем удалите PFA и смойте все оставшиеся фиксирующие средства, промывая мозг 3 раза в течение 15 минут PBST.
5. Замените окончательную промывку PBST свежеприготовленным буфером иммуноблокировки (IB) (10% нормальной козьей сыворотки и 1% DMSO в PBST) и инкубируйте при комнатной температуре в течение не менее 1 ч.
6. Разбавляют первичные антитела в буфер IB в соответствующей концентрации (например, 1:500 для RFP и 1:300 для антител PH3).
7. Удалите буфер IB из мозга и замените его первичным разведением антител. Инкубировать в течение ночи при 4 °C на орбитальном шейкере с мягким раскачиванием. Убедитесь, что трубы надежно лежат по бокам.
8. На следующее утро удалите раствор первичного антитела микропипеткой, промойте пару раз в ПБСТ, а затем промывайте мозги в ПБСТ при комнатной температуре в течение 4 х 30 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные разведения антител могут быть повторно использованы один раз в течение ~ 7 дней при хранении при 4 °C.
9. Промывайте мозг в буфере IB, разбавляя вторичные антитела в буфер IB в соответствующей концентрации (например, 1:500 для Alexa-fluor 568 против кролика).
10. Удалите буфер IB и замените его вторичным разведением антител. Насиживайте в течение ночи при 4 °C на орбитальном шейкере с мягким раскачиванием трубок, опирающихся на их бока.
11. На следующее утро удаляют раствор вторичных антител, смывают ПБСТ, а затем промывают мозги в ПБСТ при комнатной температуре в течение 4 х 30 мин.
12. Противодействовать 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) или ToPro3 (1:5,000 в ПБСТ при 4 °C в сутки).
13. На следующее утро перенесите личиночный мозг в PBS и перейдите к этапам монтажа и визуализации, перечисленным ниже.

10. Монтаж и визуализация

1. Закрепите камерный затвор в крышке 100-миллиметровой чашки Петри вакуумной смазкой.
2. Перенесите иммуноокрашенные и обработанные личинки на пластину колодца или углубление, чтобы просмотреть их с помощью рассекающего микроскопа.
3. Установите личинок на камерный затвор в колонны из 1% агарозы LMP.
   1. Используя стеклянную пипетку Пастера, положите одну личинку на камерную горку, отложив как можно меньше PBS. Той же пипеткой накройте личинку расплавленной 1% агарозой LMP (~40 °C).
   2. Тупой вольфрамовой иглой или щипцами втяните агарозу в столб, а затем расположите личинку как можно более симметрично, с видимой дорсальной поверхностью.
   3. Повторите эту процедуру для оставшихся личинок.
   4. После того, как агароза застыла, накройте ее несколькими каплями PBS, а затем поместите на сцену конфокального микроскопа.
4. Выровняйте объектив с образцом, сфокусируйте микроскоп с помощью проходящего света и осветите образец соответствующими лазерами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере для возбуждения DAPI и RFP соответственно использовались длины волн 405 нм и 568 нм.
5. Отрегулируйте коэффициент усиления, смещение и мощность лазера, переместив ползунки на соответствующий уровень относительно сигнала и используемого детектора. Проверьте гистограммы для каждого канала и нажмите кнопку индикатора состояния насыщенности над изображением, чтобы измерить уровень экспозиции, убедившись, что ни один из пикселей не насыщен и что отношение сигнал/шум высокое. Пример оптимальных параметров конфокальной визуализации для клеточного и субклеточного разрешения у рыбок данио см. ²¹.
6. Установите верхний и нижний пределы стека z-плоскостей с помощью колеса прокрутки мыши, чтобы найти верхнюю и нижнюю части образца. Щелкните верхний и нижний пределы для получения изображений, а затем запустите захват z-стека, нажав кнопку Выполнить сейчас .
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от того, насколько симметрично установлен мозг, общая z-глубина для мозга личинок рыбок данио 9 dpf составит ~ 150-200 мкм.
7. Обрабатывайте и раскрашивайте изображения с учетом доступности дальтонизма (например, используйте синий и оранжевый или пурпурный и зеленый цвета для двухцветных изображений). Установите таблицы подстановки в программном обеспечении, используемом для захвата изображений, или программном обеспечении для обработки изображений, таком как Photoshop от Adobe.
8. В Photoshop цветные необработанные микрофотографии сохраняются в формате TIFF с 8-битными тегами путем (i) преобразования режима изображения в RGB и (ii) доступа к параметру «Кривые» в | Настраивает меню, а затем (iii) сдвигает соответствующие цветные световые выходы до 0 или 255 уровней для достижения желаемого цвета. Например, чтобы получить зеленый сигнал, выберите Красный канал и сдвиньте его выход до 0; затем выберите синий канал и сдвиньте его выход до 0 . Аналогично, чтобы получить пурпурный сигнал, выберите зеленый канал и сдвиньте его выход до 0; оставьте красный и синий каналы такими, какие они есть.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогичные шаги могут быть выполнены в бесплатной программе Gnu Image Manipulation Program (GIMP).
9. Вручную количественно оцените количество ячеек, отображающих определенный маркер, с помощью плагина счетчика ячеек в ImageJ²², доступного в разделе Анализ в меню Плагины. Примеры того, как использовать ImageJ для подсчета ячеек, можно найти во многих учебниках, включая ²³.
10. Создание графических представлений данных в статистическом программном обеспечении, таком как RStudio (см. дополнительные данные для . Rmd файл).

Результаты

Чтобы подтвердить, было ли удаление глаз полным, и оценить, как изменяется оптический тектум, были проведены операции в штамме Tg[atoh7:RFP], который маркирует все RGC мембранно-целевым RFP и, таким образом, все аксоны, которые проецируются из сетчатки и образуют зрительный нерв²⁴

Обсуждение

Методы, описанные в этой статье, иллюстрируют один из многих подходов к изучению развития зрительной системы позвоночных у рыбок данио. Другие исследователи опубликовали методы рассечения эмбриональной сетчатки и проведения анализа экспрессии генов¹⁹ или визуализации ак...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and supplies:
Breeding boxes	Aquaneering	ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease	Sigma or equivalent supplier	Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL)			For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation.
Fine forceps - Dumont #5	Fine Science Tools (FST)	11252-20
Glass Pasteur pipettes	DWK Lifescience	63A53 & 63A53WT	For pipetting embryos and larvae.
Glass slides for microscopy	VWR or equivalent supplier	48311-703	Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders			For making and storing solutions.
2-part epoxy resin	ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent	0.85 oz syringe	https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	VWR or equivalent supplier	22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length)	Fine Science Tools (FST)	26018-17	To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent	Ali Express or equivalent		For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip			For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	50-190-0267
Petri dishes 35 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	08-757-100A
Pipette pump	SP Bel-Art or equivalent	F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma	909122	For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage)			For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit	Dow Corning	3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter)	World Precision Instruments (WPI)	TGW0515	Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block	The Lab Depot or equivalent supplier	BSH1001 or BSH1002	Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)			For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads			For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope			Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope			High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (NIS-Elements by Nikon) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES	Sigma	H7006	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	1374248	For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate	Sigma	M7506	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210	Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333-20ML	Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	Diagnostic BioSystems	DMR E404-01	Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride	Sigma	P3911	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride	Sigma	S9888	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide	Sigma	S5881	Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose	Sigma	S9378
Tricaine-S	Pentair	100G #TRS1	Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG	Invitrogen	A-11011	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3	Invitrogen	1306 or T3605	Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH)	Sigma	34860	Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum	ThermoFisher Scientific	50-062Z	A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3	Millipore	06-570	Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)	MBL International	PM005	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK)	Sigma	P2308-10MG	Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100	Sigma	T8787	Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji)			Freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
RStudio			Freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP			Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains. This study used the AB, TU, Tg[atoh7:RFP] strains.			Available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.