小動物モデルにおけるアデノ随伴ウイルスベクターの結膜下投与

要約

本稿では、マウスの眼組織に対する有効なベクター送達法として、輸液/離脱シリンジポンプと気密着式シリンジとマイクロインジェクション針を組み合わせた注射システムを用いて結膜下注射を実証しています。この注射システムは、他の眼内投与経路にも適応可能である。

要約

眼疾患には、広範囲の遺伝性遺伝性疾患および後天性疾患が含まれ、複数の投与経路を介したアクセスが比較的容易であるため、局所薬物送達の魅力的な標的です。結膜下注射(SCJ)は、簡単で安全であり、通常は外来で行われるため、他の眼内投与経路よりも優れています。小動物へのSCJ注射は、通常、目の大きさのために手術用顕微鏡の支援を必要とする。以前の研究では、特定のアデノ随伴ウイルス(AAV)血清型のSCJ注射が、眼表面、眼の筋肉、角膜、視神経の標的形質導入のための有効な遺伝子送達戦略であり、多くの眼疾患の治療に潜在的なアプローチを提供することが実証されています。

ここでは、プログラム可能な注入/離脱シリンジポンプ(一貫した正確な注入速度と圧力を可能にする)とマイクロインジェクション針と結合された気密取り外し可能なシリンジで構成される注入システムを使用したマウスモデルでのSCJ注射の詳細なプロトコルが提示されます。注射システムは、小動物における間質内、カメラ内、硝子体内、網膜下注射などの他の眼内投与経路にも適応可能である。眼の遺伝子治療研究のためのアデノ随伴ウイルスベクターの送達が記載されているが、本明細書のプロトコルは、小動物モデルにおける様々な眼科溶液にも適合させることができる。投与ルートの主要な実践的なステップ、注射プラットフォームのセットアップ、注射の準備、および直接の経験からのヒントについて詳しく説明します。さらに、所望の組織へのAAV送達確認のための一般的な検証技術についても簡単に説明します。

概要

眼疾患は、遺伝性疾患と後天性疾患の両方の広い範囲を網羅しています。2015年には、世界中で推定3,600万人が法的に失明し、10億人以上が少なくともある程度の視覚障害に苦しんでおり、すべてのレベルで緩和の取り組みを拡大する必要性が浮き彫りになりました¹。眼薬を送達するための主な方法には、点眼薬または結膜下注射(SCJ)、皮内注射、硝子体内注射、および網膜下注射などの局所投与と局所投与の両方が含まれます。非侵襲的局所療法は眼科用薬物の最も一般的な送達方法であり、多くの前眼部障害に広く使用されていますが、角膜の解剖学的障壁の存在は、局所投与された物質のバイオアベイラビリティ、生体分布、および有効性に課題を提示し、それが多くの内眼疾患の最良の候補治療経路ではない可能性があることを示唆しています。疾患の影響を受ける特定の眼コンパートメントへの局所注射は、より効果的で標的を絞った薬物送達アプローチである可能性があります²。ただし、繰り返しの注射に起因する副作用は、投与戦略を複雑にする可能性があります。.理想的には、治療は単回投与後に長期的な治療効果を維持する必要があります。.したがって、遺伝子治療は、必要な注射の回数を最小限に抑え、眼疾患の治療のための持続的な導入遺伝子発現を提供するための有望な選択肢^である3,4。

多数のウイルスおよび非ウイルスベクターが遺伝子治療に利用可能です。ただし、AAVベクターは、その優れた安全性プロファイルのために高い関心を集めています。AAVは、1965年にAtchisonらによってアデノウイルス製剤の汚染物質として最初に発見された小さな一本鎖非エンベロープDNAウイルスです^5,6AAVは、その後1980年代に遺伝子送達のための効率的なウイルスベクターとして設計され、眼疾患を含む多くの疾患に最適な遺伝子治療ベクターになりました。 過去数十年にわたって。これらの中で最も注目に値するのは、まれな後眼疾患であるレーバー先天性アマウロシスを治療するために米国食品医薬品局によって承認された最初の市販の遺伝子治療薬であるボレチゲンネパルボベックです。ボレチゲンネパルボベックは臨床開発の障壁をうまく克服しましたが、追加の眼遺伝子治療の商業化には課題が残っています。例えば、ボレチゲンネパルボベックは、網膜下注射を介して生存可能な網膜細胞を保持する患者に投与される。したがって、生存可能な網膜細胞を欠くより進行した形態の疾患を有する患者は、臨床的利益をもたらさないため、治療の資格がない。さらに、眼の炎症、白内障、網膜裂傷、黄斑症、および疼痛を含む、網膜下注射手順に関連する既知の合併症が観察された^7,8。この手順に関連する他の懸念には、出血、網膜剥離、眼内炎、および眼組織の破壊による眼免疫特権状態の取り消しの可能性が含まれます9,10,11,12。したがって、SCJ注射などの侵襲性の低い遺伝子送達経路を探索する努力はますます重要になっている¹³、^14、15、^16、17。

結膜は、3〜5層の細胞を含み、前眼を内眼瞼に接続する薄い膜です。SCJ注射は、加齢黄斑変性症、緑内障、網膜炎、後部ブドウ膜炎などの眼疾患の治療のために、眼の前部および/または後部の両方への眼科用薬物送達に臨床的に使用されます^18,19。それらは比較的簡単に実行でき、外来患者の設定²⁰での眼科用薬物送達に日常的に使用され、やや痛みがなく、眼の免疫特権を損なうことはなく、投与された薬物が視神経を含む大きな眼窩周囲領域に広がることを可能にします。したがって、SCJ注射はAAV遺伝子治療アプリケーションにとって魅力的な投与経路です。マウスにSCJ注射を介して投与された天然のAAV血清型は、安全性、形質導入効率、血清免疫原性、生体分布、および組織特異性について以前に特徴付けられています¹³、^16、21。これらのデータは、SCJ投与による個々の眼組織への遺伝子送達が正式な可能性であることを示した。

この論文では、マウスモデルでAAVベクターを送達するためのSCJ注入のための簡単で適応可能なプロトコルについて説明します。このアプローチの再現性を確保するために、実体顕微鏡、プログラム可能な注入/離脱シリンジポンプ(一貫した正確な注入速度と圧力を可能にする)、およびマイクロインジェクションニードルと組み合わせた気密取り外し可能なシリンジで構成される注入システムについて説明します。このシステムは、小動物の間質内、カメラ内、硝子体内、網膜下注射などの他の眼内投与経路に適応できます。さらに、フルオレセイン色素は、AAV注射部位の可視化を可能にするためにしばしば利用される。投与ルートの主要な実践的なステップ、注射プラットフォームのセットアップ、注射の準備、および直接の経験からのヒントについて詳しく説明します。最後に、所望の組織へのAAV送達を確認するための一般的な検証技術について簡単に説明します。

プロトコル

すべての動物の手順は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校の施設動物管理および使用委員会の規則に従って実行されました。AAVベクターの使用は、バイオセーフティレベル1のバイオハザードリスクです。AAVを取り扱うときは、白衣、手袋、ゴーグルなどの適切な個人用保護具を着用してください。本明細書に記載の実験のために、血清型8キャプシドをパッケージ化し、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を制御する一般的なユビキタスサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターをコードする組換えAAVベクターを利用した。

1. AAVベクターの取り扱いと保存

1. ウイルスを-80°Cの冷凍庫に、シリコン処理または低保持のマイクロ遠心チューブに100 μLアリコートで保存します。
2. 使用前にすべてのベクターストック溶液を氷上で解凍します。
   注:フルオレセインナトリウム溶液(最終濃度0.1〜2%)などの色素は、注入された溶液を視覚化するためにAAVベクターと混合されることがよくあります。さらに、注入された溶液を視覚化することで、気泡を検出し、注入後のAAV分布や漏れを監視することができます。

2.結膜下注射(SCJ)

1. 注入システムを組み立てます。
   1. 注入システムを組み立てるには、実体顕微鏡とシリンジポンプをバイオセーフティキャビネットに配置します。
      注:高精度で注入を行うには、輸液ポンプが必要です。ここでは、0.5μLから60mLの範囲の容量のシリンジ用のタイトグリップと安全なシリンジクランプを含む、標準的な注入/引き出しプログラム可能なシリンジポンプが使用されています( 材料の表を参照)。このポンプはまた、1.28 pl/minから88.28 ml/minまでの高精度でスムーズな流量で強化された流量性能を提供します。
   2. ポリエチレンチューブを約50cmの長さに切断します( 材料の表を参照)。
   3. 36 Gの針のハブの端をチューブの端の1つに挿入します。
      注意: ニードルハブの端をチューブに~3mmスライドさせて、漏れが発生しないようにします。36Gの針は、その後のSCJ注射に使用されます。32Gから36Gの範囲の針は、SCJ注射に最も一般的に使用されるサイズです。このステップを支援するために止血剤を使用することは、鋭利な怪我の潜在的なリスクを回避するために強く推奨されます。
   4. 使い捨ての3mLシリンジに滅菌水を入れます。この使い捨てシリンジを針の反対側のチューブの側面に挿入し、チューブ/針全体に水を洗い流します。70%アルコールでこの手順を繰り返します。
   5. 手順2.1.4をさらに3回繰り返し、滅菌水と70%アルコールを交互にフラッシュして、チューブを消毒し、チューブ全体に漏れ、詰まり、または損傷が観察されないことを確認します。
   6. 使い捨ての3 mLシリンジを使用してチューブに滅菌水を満たし、チューブを使い捨てシリンジに取り付けたままにします。
   7. ベンチの表面にパラフィルムを置き、滅菌水(~1 mL)のプールを追加します。針に接続されているチューブの部分を滅菌水のプールに沈めます。使い捨てシリンジを反対側の端のチューブ開口部から引き出して、シリンジを取り外したときにチューブ/ニードルシステムに空気が入らないようにします。針に接続されているチューブの部分を水たまりに沈めたままにします。
      注意: 層流フードで手順2.1.4から2.1.7を実行します。
   8. 10 μLのハミルトンシリンジ/ニードルに滅菌水を入れ、シリンジ内の空気を避けます。ハミルトンシリンジのチューブと針の先端をパラフィルム上の滅菌水のプールに沈めて、ハミルトンシリンジ/ニードルをチューブの残りの開放端に接続します。
   9. ポンプ画面の 高速リバース ボタンを押して、プッシャーブロックをシリンジのおおよその長さに移動します。ブラケットclを緩めますampノブを緩めて、プッシャーとシリンジホルダーブロックの保持ブラケットを緩めます。ハミルトンシリンジをシリンジホルダーブロックにロードし、製造元の指示に従ってシリンジを固定します。
      注意: シリンジを固定するには、シリンジバレルclする必要がありますamp シリンジバレルに対してしっかりと固定する必要があります。ただし、特にガラス注射器を使用する場合は、締めすぎないでください。シリンジプランジャーは、プッシャーブロック保持ブラケットで固定する必要があります。
   10. ポンプ設定画面でパラメータを調整します。
       1. [強制]ボタンを押して、力のレベルを30%に設定します。変更を受け入れて設定画面に戻ります。
       2. クイックスタートボタンを押して、方法を選択します|注入/撤退。
       3. シリンジには、ハミルトン1700、ガラス、10 μLを選択します。注入と撤退率と注入量を選択します。
          注意: 力のレベル は、シリンジのタイプ/材料/容量/メーカーに応じて設定されます。各シリンジの推奨力については、工場メーカーの指示を参照してください。本実験で用いた注入速度は200nL/sであり、SCJ注射は比較的安全であり、注射による眼圧上昇(IOP)の誘発の懸念は少ない。針への逆流を避け、動物間の注射の一貫性を維持するために、特定の用途では注入速度を遅くすることが望ましいことがよくあります。
   11. ハミルトンシリンジから水を排出しますが、チューブと注射針は水でいっぱいのままにします。 リバース ボタンを押してハミルトンシリンジを少し引き戻し、チューブ/ニードルに小さな気泡を導入します。
       注:気泡は、チューブ内の水と治療薬(この場合はAAV)の間のバリアとして機能し、投与された用量の精度を保証します。
   12. 注射針をウイルスストックのアリコートに入れてウイルスを回収します。ウイルスとチューブ内の水の間に目に見える気泡が残っていることを確認してください。
       注:AAVベクターはプラスチックチューブや金属針に結合し、ウイルスの喪失や不正確な投与計画につながる可能性があります。したがって、AAVの厳密さ、再現性、および正確な線量を確保するために、その後AAVと接触する表面をプレコーティングすることをお勧めします。チューブ/ニードルシステムをウイルスでコーティングするには、ウイルスベクター溶液をチューブ/ニードルに引き込み、室温で10分間インキュベートして、ニードルおよび/またはチューブの壁に結合するウイルスを飽和させます。ウイルスを破棄します。
2. ウイルスインジェクション
   1. 吸入麻酔(イソフルラン)またはケタミン/キシラジン/アセプロマジンの腹腔内注射でマウスを麻酔します。.しっかりとしたつま先のつまみに対する反応の欠如によって麻酔の手術面を確認します。
      注:少なくとも6週齢の雌および/または雄のC57BL / 6JまたはBALB / cマウスを使用してください。.ケタミン/キシラジン/アセプロマジンの用量は次のとおりです:70 mg / kgのケタミン、7 mg / kgのキシラジン、および1.5 mg / kgのアセプロマジン。.
   2. 注射を受ける目に局所麻酔をかけます。
      注:局所麻酔には、0.1%塩酸プロパラカインおよび/または塩酸テトラカイン点眼液(0.5%)を使用してください。.
   3. 乾燥や怪我を防ぐために、注射を受けないもう一方の目に局所軟膏を塗ります。
   4. マウスを顕微鏡ステージに配置し、実体顕微鏡下でマウスの目を露出させます。
   5. まぶたに2本の指を置き、マウスの目から少し引き離して、まぶたと強膜をつなぐ内膜である結膜を露出させます。
   6. 鉗子で結膜をつかみます。
   7. まぶたを放し、利き手を使って斜角を上に向けて針を持ちます。
   8. 針を結膜に挿入します。ベベルが結膜で完全に覆われるまで針を挿入します。地球に対して針を置きます。
      注:結膜は透明な膜であるため、針先/斜角は簡単に見えます。
   9. フットスイッチを使用して スタート ボタンを押して注入を開始します。
      注意: 空気の動きとハミルトンプランジャーは同期しています。遅延は、注入システム内の過剰な空気、またはチューブ、針、および/またはシリンジコンポーネント間の接続が緩んでいる可能性があります。
   10. 注射が終了したら、針を結膜から引き抜く前に針を10秒間保持して、逆流の可能性を減らします。
       注:SCJ注射の部位にブレブが現れるのはよくあることです。このようなブレブは通常、注射後数時間以内に完全に解消します。
   11. 眼の乾燥/損傷を防ぐためにマウスの目に局所潤滑剤ゲルを一滴置き、次にマウスを加熱パッドに置いて回復させます。
   12. 涙液産生、IOP、細隙灯検査などの眼内検査を角膜フルオレセイン染色と併せて行い、注射後の眼の異常を評価します。
       注:涙液の生成はフェノールレッドスレッドテストによって測定され、眼圧計はマウスの目のIOPを調べるためによく使用されます。硝子体内注射などの一部の眼内注射は、IOPの大幅な増加をもたらす可能性があると報告されています。しかしながら、SCJ注射後のIOP変化は明らかではない¹³、²²、^23、24。
3. 結膜下注射後のAAV生体分布および形質導入効率試験
   1. SCJを介して送達されるAAVベクターのウイルスゲノムの生体分布および/または形質導入プロファイルを調べるには、AVMA承認の方法でマウスを安楽死させます。
      注:この実験では、マウスを注射後8週間で屠殺した。
   2. 標的眼コンパートメントでの生体分布および導入遺伝子発現のために、まぶた、角膜、結膜、眼筋、網膜、視神経などの関心のある関連組織を解剖します。すべての組織をフラッシュフリーズし、-80°Cで保存します。 全身のAAVの生体分布を調べるには、顎下リンパ節や肝臓などの臓器を採取し、-80°Cで瞬間凍結して保存します。
   3. DNA/RNA抽出キットを使用して、同じサンプルからgDNAとRNAを収集し、導入遺伝子発現とAAVの生体分布をそれぞれ調べます。ベクターの生体分布のみが必要な場合は、DNA抽出キットを使用してgDNAを抽出します。
   4. ベクター導入遺伝子特異的プライマー/プローブを使用して、標準的なqPCRおよびRT-qPCRを実行し、AAVベクターの生体分布およびcDNAの存在量を測定します^13,25。
   5. 組織学分析では、目を固定し、パラフィンに埋め込み、5μmの厚さで切片化します。標準的な免疫蛍光染色を行い、導入遺伝子発現を明らかにした²⁶。

結果

結膜下腔に注入された溶液は、注入量に応じてブレブとして現れる。
本実験では、フルオレセインと最終濃度0.1%で混合したAAV(7 ×^{10 9} ウイルスゲノム(vg)/眼)7 μLを実体顕微鏡下で36 G針で注入し、プログラム可能なシリンジポンプを用いて注入速度/圧力を1 μL/sで一定に保ちました。注射時にブレブが現れることがあります(矢印)。マウスSCJ区画へのAAVベクター投与の顕?...

ディスカッション

AAVを介した遺伝子治療は、眼疾患の治療に大きな可能性を秘めています。現在の眼科遺伝子治療は、硝子体内注射と網膜下注射の2つの主要な局所投与経路に依存しています。残念ながら、どちらの経路も侵襲的であり、網膜剥離、白内障形成、眼内炎などの重篤な合併症を引き起こす可能性があります。したがって、SCJ注射などの比較的侵襲性の低い経路の調査は非常に興味深いものです。...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
36 G NanoFil Needles	World Precision Instruments	NF36BV-2
AAV vector	University of North Carolina at Chapel Hill	/
Acepromazine	Henry Schein	NDC 11695-0079-8
anti-GFP antibody	AVES labs Inc.
Digital camera	Cannon	Cannon EOS T5i
DNA/RNA extraction kit	Qiagen	80204
Forceps	Fine Science Tools	F6521
Hamilton syringe	Hamilton	7654-01
India ink	StatLab	NC9903975
Ketamine hydrochloride injection solution	Henry Schein	NDC 0409-2051-05
Moisture-resistant film	Parafilm	807-6
Polyethylene tubing	Becton Dickinson and Company	427401
Proparacaine 0.1%	Bausch Health US	NDC 24208-730-06
Rebound tonometer	Tonovet	/
Sodium fluorescein solution	Sigma-Aldich	46960
Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump	Harvard Bioscience	70-4504
Stereo microscopye	Leica	Mz6
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%	Bausch and Lomb	Rx only
Topical ointment	GenTeal	NDC 0078-0429-47
Xylazine	Akorn	NDC 59399-110-20
Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads	ZONE-QUICK	PO6448