Administration sous-conjonctivale de vecteurs de virus adéno-associés dans des modèles de petits animaux

Résumé

Dans ce manuscrit, l’injection sous-conjonctivale est démontrée comme une méthode d’administration vectorielle valide pour les tissus oculaires chez la souris utilisant un système d’injection composé d’une pompe à seringue de perfusion / retrait et d’une seringue amovible étanche couplée à des aiguilles de micro-injection. Ce système d’injection est également adaptable à d’autres voies d’administration intraoculaires.

Résumé

Les maladies oculaires comprennent un large éventail de maladies génétiques héréditaires et acquises qui sont des cibles attrayantes pour l’administration locale de médicaments en raison de leur relative facilité d’accès via de multiples voies d’administration. Les injections sous-conjonctivales (SCJ) offrent des avantages par rapport aux autres voies d’administration intraoculaires car elles sont simples, sûres et généralement effectuées en ambulatoire. Les injections de SCJ chez les petits animaux nécessitent généralement l’aide d’un microscope opératoire en raison de la taille de l’œil. Des travaux antérieurs ont démontré que l’injection par SCJ de sérotypes spécifiques de virus adéno-associés (AAV) est une stratégie d’administration génique valide pour la transduction ciblée de la surface oculaire, du muscle oculaire, de la cornée et du nerf optique, offrant une approche potentielle pour le traitement de nombreuses maladies oculaires.

Ici, un protocole détaillé est présenté pour les injections de SCJ dans un modèle murin utilisant un système d’injection composé d’une pompe à seringue programmable pour perfusion/retrait (qui permet une vitesse et une pression d’injection constantes et précises) et d’une seringue amovible étanche couplée à des aiguilles de micro-injection. Le système d’injection est également adaptable à d’autres voies d’administration intraoculaires telles que les injections intrastromales, intracamériennes, intravitréennes et sous-rétiniennes chez les petits animaux. Bien que l’administration de vecteurs viraux adéno-associés pour les études de thérapie génique oculaire soit décrite, le protocole présent peut également être adapté à une variété de solutions ophtalmiques dans de petits modèles animaux. Les étapes pratiques clés de la voie d’administration, la configuration de la plate-forme d’injection, la préparation de l’injection et les conseils tirés de l’expérience directe seront discutés en détail. En outre, les techniques de validation courantes pour la confirmation de l’administration d’AAV aux tissus souhaités seront également brièvement discutées.

Introduction

Les maladies oculaires englobent un large éventail de troubles génétiques et acquis. En 2015, on estimait à 36 millions le nombre de personnes aveugles au sens de la loi dans le monde et à plus d’un milliard le nombre de personnes souffrant d’au moins un certain niveau de déficience visuelle, ce qui souligne la nécessité d’intensifier les efforts d’atténuation à tous les niveaux¹. Les principales méthodes d’administration des médicaments oculaires comprennent l’administration topique et locale, comme les gouttes oculaires ou sous-conjonctivales (SCJ), les injections intracamérales, intravitréennes et sous-rétiniennes. Bien que le traitement topique non invasif soit la méthode d’administration la plus courante pour les médicaments ophtalmiques et qu’il soit largement utilisé pour de nombreux troubles du segment antérieur, la présence de barrières anatomiques cornéennes présente un défi pour la biodisponibilité, la biodistribution et l’efficacité des substances administrées par voie topique, ce qui suggère que ce n’est peut-être pas la meilleure voie de traitement candidate pour de nombreuses maladies de l’œil interne. L’injection locale dans le compartiment oculaire spécifique affecté par la maladie est susceptible d’être une approche d’administration de médicaments plus efficace et ciblée². Cependant, les effets indésirables résultant d’injections répétées peuvent compliquer les stratégies d’administration. Idéalement, une thérapie devrait maintenir son efficacité thérapeutique à long terme après une administration unique. Ainsi, la thérapie génique est une option prometteuse pour minimiser le nombre d’injections nécessaires et fournir une expression transgénique soutenue pour le traitement de la maladie oculaire ^3,4.

De nombreux vecteurs viraux et non viraux sont disponibles pour la thérapie génique; cependant, les vecteurs AAV présentent un grand intérêt en raison de leur excellent profil d’innocuité. AAV est un petit virus à ADN simple brin non enveloppé qui a été initialement découvert comme contaminant d’une préparation d’adénovirus en 1965 par Atchison et ^al.5,6 L’AAV a ensuite été conçu comme un vecteur viral efficace pour l’administration de gènes dans les années 1980 et est devenu le vecteur de thérapie génique de choix pour de nombreuses maladies, y compris les troubles oculaires^, au cours des dernières décennies. Le plus notable d’entre eux est le premier médicament de thérapie génique disponible dans le commerce, voretigene neparvovec, qui a été approuvé par la Food and Drug Administration des États-Unis pour traiter l’amaurose congénitale de Leber, une maladie oculaire postérieure rare. Bien que voretigene neparvovec ait réussi à surmonter les obstacles au développement clinique, des défis subsistent pour la commercialisation de thérapies géniques oculaires supplémentaires. Par exemple, voretigene neparvovec est administré aux patients qui conservent des cellules rétiniennes viables par injection sous-rétinienne. Ainsi, les patients atteints de formes plus avancées de la maladie qui manquent de cellules rétiniennes viables ne sont pas éligibles au traitement, car il n’apporterait aucun bénéfice clinique. De plus, des complications connues associées à la procédure d’injection sous-rétinienne ont été observées, notamment une inflammation oculaire, des cataractes, des déchirures rétiniennes, une maculopathie et des douleurs ^7,8. D’autres préoccupations liées à cette procédure comprennent la possibilité d’hémorragie, de décollement de la rétine, d’endophtalmie et de révocation du statut privilégié immunitaire oculaire par destruction des tissus oculaires 9,10,11,12. Ainsi, les efforts visant à explorer des voies d’administration de gènes moins invasives telles que l’injection de SCJ sont devenus de plus en plus importants 13,14,15,16,17.

La conjonctive est une fine membrane contenant 3 à 5 couches de cellules et reliant l’œil antérieur à la paupière interne. Les injections de SCJ sont utilisées cliniquement pour l’administration de médicaments ophtalmiques aux segments antérieur et / ou postérieur de l’œil pour le traitement de maladies oculaires telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge, le glaucome, la rétinite et l’uvéite postérieure^18,19. Ils sont relativement simples à réaliser, utilisés couramment pour l’administration de médicaments ophtalmiques en ambulatoire²⁰, quelque peu indolores, ne compromettent pas le privilège immunitaire oculaire et permettent aux médicaments administrés de se propager dans une grande région périorbitaire qui englobe le nerf optique. Par conséquent, les injections de SCJ sont une voie d’administration intéressante pour les applications de thérapie génique AAV. Les sérotypes naturels AAV administrés par injection de SCJ chez la souris ont déjà été caractérisés pour leur innocuité, leur efficacité de transduction, leur immunogénicité sérique, leur biodistribution et leur spécificité tissulaire^13,16,21. Ces données ont démontré que l’administration de gènes à des tissus oculaires individuels par administration de SCJ est une possibilité formelle.

Cet article décrit un protocole simple et adaptable pour l’injection de SCJ afin de délivrer des vecteurs AAV dans un modèle murin. Pour assurer la reproductibilité de cette approche, un système d’injection composé d’un stéréomicroscope, d’une pompe à seringue programmable pour perfusion/retrait (qui permet une vitesse et une pression d’injection constantes et précises) et d’une seringue amovible étanche aux gaz couplée à des aiguilles de micro-injection est décrit. Ce système est adaptable à d’autres voies d’administration intraoculaires telles que les injections intrastromales, intracamérales, intravitréennes et sous-rétiniennes chez les petits animaux. De plus, un colorant fluorescéine est souvent utilisé pour permettre la visualisation du site d’injection d’AAV. Les étapes pratiques clés de la voie d’administration, la configuration de la plate-forme d’injection, la préparation de l’injection et les conseils tirés de l’expérience directe seront discutés en détail. Enfin, les techniques de validation communes pour la confirmation de l’administration d’AAV aux tissus souhaités seront brièvement discutées.

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées conformément aux règlements du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill. L’utilisation de vecteurs AAV constitue un risque de biodanger de niveau de biosécurité 1. Portez l’équipement de protection individuelle approprié, y compris une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection lorsque vous manipulez un véhicule antialcoolique. Pour l’expérience décrite ici, un vecteur AAV recombinant emballé avec la capside du sérotype 8 et codant pour un promoteur générique du cytomégalovirus ubiquitaire (CMV) contrôlant l’expression de la protéine de fluorescence verte (GFP) a été utilisé.

1. Manipulation et stockage des vecteurs AAV

1. Conservez le virus dans un congélateur à -80 °C dans des aliquotes de 100 μL dans des tubes à microcentrifugeuses siliconés ou à faible rétention.
2. Décongeler toutes les solutions mères vectorielles sur la glace avant utilisation.
   REMARQUE: Des colorants tels que la solution de fluorescéine de sodium (à une concentration finale de 0,1-2%) sont souvent mélangés avec les vecteurs AAV pour visualiser la solution injectée. De plus, la visualisation des solutions injectées permet de détecter les bulles d’air et de surveiller la distribution et/ou les fuites d’AAV après l’injection.

2. Injection sous-conjonctivale (SCJ)

1. Assemblez le système d’injection.
   1. Pour assembler le système d’injection, placez un stéréomicroscope et une pompe à seringue dans une enceinte de biosécurité.
      REMARQUE: Une pompe à perfusion est nécessaire pour effectuer des injections avec une grande précision. Ici, une pompe à seringue programmable standard à perfuser/retirer est utilisée (voir le tableau des matériaux), qui comprend une poignée serrée et une pince de seringue sécurisée pour les seringues d’un volume allant de 0,5 μL à 60 mL. Cette pompe offre également des performances de débit améliorées avec une grande précision et des débits lisses de 1,28 pl/min à 88,28 ml/min.
   2. Coupez le tube en polyéthylène à une longueur d’environ 50 cm (voir le tableau des matériaux).
   3. Insérez l’extrémité du moyeu d’une aiguille de 36 G dans l’une des extrémités du tube.
      REMARQUE: Faites glisser l’extrémité du moyeu de l’aiguille dans le tube pendant ~3 mm pour vous assurer qu’aucune fuite ne se produit. L’aiguille de 36 G est utilisée pour l’injection SCJ suivante. Les aiguilles comprises entre 32 G et 36 G sont les tailles les plus couramment utilisées pour les injections de SCJ. L’utilisation d’un hémostatique pour faciliter cette étape est fortement recommandée pour éviter le risque potentiel de blessure par objets tranchants.
   4. Remplir une seringue jetable de 3 mL avec de l’eau stérile; Insérez cette seringue jetable dans le côté du tube opposé à l’aiguille et rincez l’eau dans tout le tube ou l’aiguille. Répétez cette étape avec 70% d’alcool.
   5. Répétez l’étape 2.1.4 trois fois de plus, en alternant les rinçages avec de l’eau stérile et de l’alcool à 70 %, pour désinfecter le tuyau et vous assurer qu’aucune fuite, obstruction ou dommage n’est observé dans tout le tube.
   6. Utilisez la seringue jetable de 3 mL pour remplir le tube avec de l’eau stérile et laissez le tube attaché à la seringue jetable.
   7. Placez un morceau de parafilm sur la surface du banc et ajoutez-y une flaque d’eau stérile (~1 mL). Immergez la partie du tube reliée à l’aiguille dans la piscine d’eau stérile. Retirez la seringue jetable de l’ouverture du tube à l’extrémité opposée pour empêcher tout air de pénétrer dans le système de tubulure ou d’aiguille lors du retrait de la seringue. Laissez la partie du tube reliée à l’aiguille immergée dans la mare d’eau.
      REMARQUE : Exécuter les procédures 2.1.4 à 2.1.7 dans un capot laminaire.
   8. Remplissez une seringue ou une aiguille Hamilton de 10 μL avec de l’eau stérile et évitez l’air dans la seringue. Connectez la seringue ou l’aiguille Hamilton à l’extrémité ouverte restante de la tubulure en immergeant la tubulure et l’extrémité de l’aiguille de la seringue Hamilton dans la flaque d’eau stérile sur le parafilm.
   9. Appuyez sur le bouton de marche arrière rapide sur l’écran de la pompe pour déplacer le bloc poussoir à la longueur approximative de la seringue. Dévissez les boutons de serrage du support pour desserrer les supports de fixation du poussoir et des blocs porte-seringues. Chargez la seringue Hamilton sur le bloc porte-seringue et fixez-la en suivant les instructions du fabricant.
      REMARQUE: Pour fixer la seringue, la pince du corps de la seringue doit être serrée contre le corps de la seringue; Cependant, ne serrez pas trop, surtout lorsque vous utilisez des seringues en verre. Le piston de la seringue doit être fixé par le support de retenue du bloc poussoir.
   10. Ajustez les paramètres dans l’écran des paramètres de la pompe.
       1. Appuyez sur le bouton Force et réglez le niveau de force à 30%. Acceptez les modifications pour revenir à l’écran des paramètres .
       2. Appuyez sur le bouton de démarrage rapide et sélectionnez Méthode | Infuser/retirer.
       3. Pour la seringue, sélectionnez Hamilton 1700, verre, 10 μL. Sélectionnez le débit de perfusion et de retrait et le volume d’injection.
          REMARQUE : Le niveau de force est réglé en fonction du type/matériau/capacité/fabricant de la seringue ; Voir les instructions du fabricant en usine pour la force suggérée pour chaque seringue. La vitesse d’injection utilisée dans cette expérience était de 200 nL/s. Les injections de SCJ sont relativement sûres et l’induction d’une pression intraoculaire élevée (PIO) résultant de l’injection est moins préoccupante. Une vitesse d’injection plus lente est souvent souhaitable pour certaines applications afin d’éviter le reflux dans l’aiguille et de maintenir la cohérence des injections chez les animaux.
   11. Éjectez l’eau de la seringue Hamilton, mais laissez la tubulure et l’aiguille d’injection pleines d’eau. Tirez légèrement sur la seringue Hamilton en appuyant sur le bouton Reverse pour introduire une petite bulle d’air dans le tube ou l’aiguille.
       REMARQUE: La bulle d’air servira de barrière entre l’eau dans le tube et le médicament thérapeutique (dans ce cas, AAV), assurant la précision de la dose administrée.
   12. Prélever le virus en plaçant l’aiguille d’injection dans une partie aliquote du stock de virus. Assurez-vous qu’une bulle d’air visible reste entre le virus et l’eau dans le tube.
       REMARQUE: Les vecteurs AAV peuvent se lier au tube en plastique et à l’aiguille métallique, entraînant une perte de virus et / ou des schémas posologiques inexacts. Ainsi, pour assurer la rigueur, la reproductibilité et une dose précise d’AAV, il est recommandé de pré-enduire les surfaces qui entrent ensuite en contact avec l’AAV. Pour enduire le système de tubulure ou d’aiguille du virus, aspirer la solution de vecteur viral dans la tubulure ou l’aiguille et l’incuber à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre la saturation de la liaison du virus à la paroi de l’aiguille et/ou de la tubulure. Jetez le virus.
2. Injection de virus
   1. Anesthésier la souris avec une anesthésie inhalée (isoflurane) ou une injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine/acépromazine. Confirmer le plan chirurgical de l’anesthésie par une absence de réponse à des pincements fermes des orteils.
      REMARQUE: Utilisez des souris femelles et / ou mâles C57BL / 6J ou BALB / c âgées d’au moins 6 semaines. Les doses de kétamine/xylazine/acépromazine sont les suivantes : kétamine à 70 mg/kg, xylazine à 7 mg/kg et acépromazine à 1,5 mg/kg.
   2. Appliquez une anesthésie topique sur l’œil qui recevra l’injection.
      REMARQUE : Utilisez une solution ophtalmique de chlorhydrate de proparacaïne à 0,1 % et/ou de chlorhydrate de tétracaïne (0,5 %) pour l’anesthésie topique.
   3. Appliquez une pommade topique sur l’autre œil qui ne recevra pas d’injection pour prévenir la sécheresse et les blessures.
   4. Placez la souris sur le stade microscopique et exposez l’œil de la souris sous le stéréomicroscope.
   5. Placez deux doigts sur la paupière et éloignez-la légèrement de l’œil de la souris pour exposer la conjonctive, qui est la membrane interne reliant la paupière à la sclérotique.
   6. Saisissez la conjonctive avec une pince.
   7. Relâchez la paupière et tenez l’aiguille avec le biseau vers le haut à l’aide de la main dominante.
   8. Insérez l’aiguille dans la conjonctive. Insérez l’aiguille jusqu’à ce que le biseau soit complètement recouvert par la membrane conjonctivale. Posez l’aiguille contre le globe.
      REMARQUE: Comme la conjonctive est une membrane claire, la pointe de l’aiguille / biseau est facilement visible.
   9. Lancez l’injection en appuyant sur le bouton Start à l’aide de la pédale.
      NOTE: Le mouvement de l’air et du piston Hamilton sont synchronisés; Tout retard indique un excès d’air dans le système d’injection ou peut-être une connexion desserrée entre les composants de la tubulure, de l’aiguille et/ou de la seringue.
   10. Une fois l’injection terminée, maintenez l’aiguille en place pendant 10 s avant de retirer l’aiguille de la conjonctive pour diminuer les risques de refoulement.
       REMARQUE: Il est fréquent qu’un bleb apparaisse au site de l’injection SCJ. Ces bulles disparaissent normalement complètement quelques heures après l’injection.
   11. Mettez une goutte de gel lubrifiant topique sur les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse / blessure oculaire, puis placez la souris sur un coussin chauffant pour récupérer.
   12. Effectuer des examens oculaires tels que la production de larmes, la PIO et l’examen à la lampe à fente en conjonction avec la coloration cornéenne à la fluorescéine pour évaluer les anomalies oculaires après l’injection.
       REMARQUE: La production de larmes est mesurée par un test de fil rouge de phénol, et un tonomètre est souvent utilisé pour examiner la PIO de l’œil de souris. Il est rapporté que certaines injections intraoculaires, telles que les injections intravitréennes, pourraient entraîner une augmentation significative de la PIO; cependant, les changements de PIO après l’injection de SCJ ne sont pas évidents ^13,22,23,24.
3. Examen de l’efficacité de la biodistribution et de la transduction de l’AAV après injection sous-conjonctivale
   1. Pour étudier la biodistribution du génome viral et / ou le profil de transduction des vecteurs AAV délivrés via SCJ, euthanasier les souris par une méthode approuvée par l’AVMA.
      REMARQUE: Dans cette expérience, les souris ont été sacrifiées 8 semaines après l’injection.
   2. Pour la biodistribution et l’expression des transgènes dans les compartiments oculaires ciblés, disséquer les tissus d’intérêt pertinents tels que les paupières, la cornée, la conjonctive, le muscle oculaire, la rétine et le nerf optique. Congeler tous les mouchoirs et les conserver à -80 °C. Pour examiner la biodistribution de l’AAV dans tout le corps, prélever des organes tels que les ganglions lymphatiques sous-maxillaires et le foie, les congeler et les stocker à -80 °C.
   3. À l’aide d’un kit d’extraction d’ADN / ARN, prélever l’ADNg et l’ARN du même échantillon pour examiner l’expression transgénique et la biodistribution AAV, respectivement. Si seule la biodistribution vectorielle est souhaitée, utilisez un kit d’extraction d’ADN pour extraire l’ADNg.
   4. Effectuer la qPCR standard et la RT-qPCR pour déterminer la biodistribution du vecteur AAV et l’abondance de l’ADNc à l’aide d’amorces/sondes spécifiques aux transgènes vectoriels^13,25.
   5. Pour l’analyse histologique, fixez les yeux, intégrez-les dans de la paraffine et sectionnez-les sur une épaisseur de 5 μm. Effectuer une coloration par immunofluorescence standard pour révéler l’expression du transgène²⁶.

Résultats

La solution injectée dans l’espace sous-conjonctival se présente sous la forme d’un bleb en fonction du volume d’injection.
Dans cette expérience, 7 μL d’AAV (7 × 10⁹ génomes viraux (vg)/œil) mélangés à de la fluorescéine à une concentration finale de 0,1 % ont été injectés avec une aiguille de 36 G sous un stéréomicroscope, et la vitesse/pression d’injection a été maintenue constante à l’aide d’une pompe à seringue programmable à 1 μL/s. Un bleb peut ap...

Discussion

La thérapie génique médiée par AAV présente un grand potentiel pour le traitement des maladies oculaires. La thérapie génique oculaire actuelle repose sur deux voies d’administration locales majeures, les injections intravitréennes et sous-rétiniennes. Malheureusement, les deux voies sont invasives et peuvent entraîner de graves complications, notamment un décollement de la rétine, la formation de cataracte et une endophtalmie. Ainsi, l’étude de voies relativement moins invasives, telles que l’injectio...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
36 G NanoFil Needles	World Precision Instruments	NF36BV-2
AAV vector	University of North Carolina at Chapel Hill	/
Acepromazine	Henry Schein	NDC 11695-0079-8
anti-GFP antibody	AVES labs Inc.
Digital camera	Cannon	Cannon EOS T5i
DNA/RNA extraction kit	Qiagen	80204
Forceps	Fine Science Tools	F6521
Hamilton syringe	Hamilton	7654-01
India ink	StatLab	NC9903975
Ketamine hydrochloride injection solution	Henry Schein	NDC 0409-2051-05
Moisture-resistant film	Parafilm	807-6
Polyethylene tubing	Becton Dickinson and Company	427401
Proparacaine 0.1%	Bausch Health US	NDC 24208-730-06
Rebound tonometer	Tonovet	/
Sodium fluorescein solution	Sigma-Aldich	46960
Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump	Harvard Bioscience	70-4504
Stereo microscopye	Leica	Mz6
Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5%	Bausch and Lomb	Rx only
Topical ointment	GenTeal	NDC 0078-0429-47
Xylazine	Akorn	NDC 59399-110-20
Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads	ZONE-QUICK	PO6448